1-磷酸神经酰胺转运蛋白对人口腔鳞状细胞癌HSC-3细胞生物学行为的影响.pdf

第 49 卷 第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.4Jul.2023DOI：10.13481/j.1671587X.202304071-磷酸神经酰胺转运蛋白对人口腔鳞状细胞癌 HSC-3细胞生物学行为的影响张湘豫1,2,胡溢洪1,2,韩语诚1,2,邹先琼1（1.桂林医学院附属口腔医院口腔颌面外科，广西 桂林 541004；2.桂林医学院基础医学院免疫学教研室，广西 桂林 541100）摘要 目的目的：探讨 1-磷酸神经酰胺转运蛋白（CPTP）对人口腔鳞状细胞癌 HSC-3 细胞生物学行为的影响，阐明其相关作用机制。方法方法：体外培养 HSC-3 细胞，分为对照组和实验组，分别采用pFlag-CMV4和 pFlag-CPTP质粒进行转染，采用抗性筛选法构建稳定转染（稳转）CPTP的细胞。采用 Western blotting 法和免疫荧光法检测 2 组细胞中 CPTP 蛋白表达水平，采用克隆形成实验和CCK-8法检测各组细胞中克隆形成数和细胞增殖活性，细胞划痕实验检测 2组细胞划痕愈合率，Transwell小室实验检测 2 组细胞中侵袭细胞数。小鼠随 机 分 为 对 照 组 和 实 验 组，分 别 注 射 pFlag-CMV4 稳转HSC-3细胞和 pFlag-CPTP 稳转 HSC-3细胞，制备小鼠皮下移植瘤模型，检测 2组小鼠移植瘤体积和质量。采用生物信息学方法对头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）组织中 CPTP 差异表达基因进行富集分析。采用实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）法检测 2组细胞中 p53、血小板反应蛋白 1（THBS1）和细胞周期蛋白 G2（CCNG2）mRNA 表达水平。结果结果：与对照组比较，实验组细胞中 CPTP 蛋白表达量明显增加。与对照组比较，实验组细胞中克隆形成数明显增加（P0.01），细胞增殖活性和划痕愈合率明显升高（P0.05或 P0.01），侵袭细胞数明显增加（P0.01）。注射肿瘤细胞 2、3和 4周，与对照组比较，实验组小鼠移植瘤体积明显增加（P0.05或 P0.01）；注射肿瘤细胞 4周，与对照组比较，实验组小鼠移植瘤质量明显增加（P0.05）。生物信息学分析，在 HNSCC 组织中 CPTP 的作用可能是通过 p53等信号通路介导。与对照组比较，实验组细胞中 p53、THBS1和 CCNG2 mRNA 表达水平明显降低（P0.01）。结论结论：过表达 CPTP 能促进 HSC-3细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤能力，CPTP通过抑制 p53信号通路促进口腔鳞状细胞癌 HSC-3细胞生长。关键词 口腔鳞状细胞癌；1-磷酸神经酰胺转运蛋白；细胞侵袭；信号通路中图分类号 R734.2文献标志码 AEffect of ceramide 1-phosphate transfer protein on biological behavior of human oral squamous cell carcinoma HSC-3 cellsZHANG Xiangyu1,2,HU Yihong1,2,HAN Yucheng1,2,ZOU Xianqiong1（1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery，Affiliated Stomatology Hospital，Guilin Medical University，Guilin 541004，China；2.Department of Immunology，School of Basic Medicine，Guilin Medical University，Guilin 541100，China）ABSTRACT Objective：To discuss the effect of human ceramide 1-phosphate transfer protein（CPTP）on the biological behavior of oral squamous cell carcinoma HSC-3 cells，and to clarify its related mechanism.文章编号 1671587X(2023)04087509收稿日期 20221014基金项目 国家自然科学基金项目（81760490）；广西壮族自治区科技厅自然科学基金项目（2020GXNSFDA238026）作者简介 张湘豫（1996），女，贵州省贵阳市人，医学硕士，主要从事黏膜免疫方面的研究。通信作者 邹先琼，教授，博士研究生导师（E-mail：）875第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）Methods：The HSC-3 cells were cultured in vitro and divided into control group and experiment group，and the cells in two groups were transfected with pFlag-CMV4 and pFlag-CPTP plasmids，respectively；the cells stably transfected with CPTP were constructed by using resistance screening method.Western blotting and immunofluorescence methods were used to detect the expression levels of CPTP protein in cells in two groups；clone formation experiment and CCK-8 assay were used to detect the numbers of clone formation and proliferation activities of cells in two groups；cell scratch experiment was used to detect the scratch healing rates of cells in two groups；Transwell chamber experiment was used to detect the numbers of invasion cells in two groups.The mice were randomly divided into control group and experiment group，and the mice were injected with the HSC-3 cells stably transfected with pFlag-CMV4 and the HSC-3 cells stably transfected with pFlag-CPTP respectively to construct the subcutaneous transplanted tumor models in the mice.The volumes and weights of transplant tumors of the mice in two groups were detected.The enrichment analysis on CPTP differentially expressed genes in head and neck squamous cell carcinoma（HNSCC）cells was analyzed by using bioinformatics method；real-time fluorescence quantitative PCR（RT-qPCR）method was used to detect the expression levels of p53，thrombospondin-1（THBS1），and cyclin G2（CCNG2）mRNA in cells in two groups.Results：Compared with control group，the expression amount of CPTP protein in the cells in experiment group was increased.Compared with control group，the number of clone formation in the cells in experiment group was significantly increased（P0.01），the proliferation activity and scratch healing rate of the cells were significantly increased（P0.05 or P0.01），and the number of invasion cells was increased（P0.01）.After injecting tumor cells for 2，3，and 4 weeks，compared with control group，the volumes of the transplanted tumor of the mice in experiment group were increased（P0.05 or P0.01）；after injecting tumor cells for 4 weeks，compared with control group，the weight of transplanted tumor of the mice in experiment group was increased（P0.05）.The bioinformatics analysis results showed that the role of CPTP in the HNSCC tissue may be mediated through the signaling pathways such as p53.Compared with control group，the expression levels of p53，THBS1，and CCNG2 mRNA in the cells in experiment group were significantly decreased（P0.01）.Conclusion：Over-expression of CPTP can promote the proliferation，migration，invasion，and tumorigenesis of the HSC-3 cells.CPTP promotes the growth of the oral squamous cell carcinoma HSC-3 cells by inhibiting the p53 signaling pathway.KEYWORDS Oral squamous cell carcinoma；Ceramide-1-phosphate transfer protein；Cell invasion；Signaling pathway1-磷 酸 神 经 酰 胺 转 运 蛋 白（ceramide-1-phosphate transfer protein，CPTP）是糖脂转运蛋白（glycolipid transfer protein domain-containing protein，GLTP）家族的一个新成员，是可选择性转 运 1-磷 酸 神 经 酰 胺（ceramide-1-phosphate，C1P）并 调 节 细 胞 中 C1P 水 平 和 分 布 的 转 运 蛋白1。CPTP 由 3 个外显子和 2 个内含子组成，位于染色体 1p361-2。沉默 CPTP 可上调细胞高尔基体中 C1P 水平而引起质膜中 C1P 水平降低，并刺激A型磷脂酶 A2（phospholipase A2，PLA2）释放花生四烯酸，进而促进类花生酸的生成，而类花生酸为炎症和肿瘤的信号分子，提示 CPTP与炎症和肿瘤有密切关联3-5。同时细胞中鞘脂分子水平变化在诱导癌细胞死亡或生存中起关键作用，对鞘脂代谢和相关脂转运蛋白的研究在改善癌症治疗上具 有 重 要 的 临 床 意 义4-5。在 重 症 胰 腺 炎 中，CPTP 可通过下调胞浆型 PLA2（cytosolic PLA2，cPLA2）表达影响紧密连接蛋白 ZO-1 表达，进而保护肠上皮屏障，而紧密连接是调节肠道通透性的结构基础，其可能在细菌易位中发挥重要作用6。研究7表明：人类 CPTP 可通过鞘脂代谢物神经酰胺和磷脂酰肌醇4激酶（phosphatidylinositol 4-kinase alpha，PI4KA）/蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT）信号通路促进胰腺癌细胞生长和转移。尽管 CPTP与肿瘤的发生发 展 关 系 密 切，但 其 在 口 腔 鳞 状 细 胞 癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞中的作用及其机制尚未见报道。本研究旨在探讨过表达 CPTP876张湘豫，等.1磷酸神经酰胺转运蛋白对人口腔鳞状细胞癌 HSC3细胞生物学行为的影响对口腔鳞状细胞癌 HSC-3 细胞的影响，为 OSCC的预防、诊断和治疗提供新的理论依据。1 材料与方法 1.1实验动物实验动物、细胞细胞、主要试剂和仪器主要试剂和仪器56 周龄BALB/c-nu 雄性小鼠购自湖南景达实验动物有限公 司，动 物 生 产 许 可 证 号：SCXK（湘）2019-0004。人 OSCC HSC-3 细胞购自美国菌种保藏中心。CCK-8 试 剂 盒 购 自 日 本 同 仁 化 学 研 究 所，Transwell小室购自美国 Corning 公司，RPMI 1640培 养 基 购 自 美 国 Gibco 公 司，FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix 试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，Flag 抗体购自美国 Santa Cruz Biotech 公司，-actin 抗体购自大连 Origen 科技有限公司。酶标仪购自美国 Biotek 仪器有限公司，ECLIPSE Ti2 荧 光 显 微 镜 购 自 日 本 Nikon 公 司，CKX41 型 倒 置 显 微 镜 购 自 日 本 Olympus 公 司，7500 Fast 定量 PCR仪购自美国 ABI公司。1.2细胞培养细胞培养、过表达过表达 CPTP稳定转染稳定转染（稳转稳转）细胞细胞系制备和实验分组系制备和实验分组HSC-3 细胞在 RPMI 1640 培养基（含 10%FBS）中孵育，在 37、5%CO2条件下培养。细胞融合度为 70%左右时，分别采用pFlag-CMV4 和 pFlag-CPTP 进行转染，同时设空白对照组 和 阳 性 对 照 组。首 先 采 用 浓 度 为500 g L1 G418 进行筛选，持续筛选 23 周，逐步降低 G418 浓度，直至空白对照组细胞大部分死亡后，采用 200 g L1 G418 作为最终维持浓度。收集生长的细胞，梯度稀释接种至细胞培养皿中，形成单细胞克隆后，挑选不同的克隆细胞扩大培养，并通过 Western blotting法和免疫荧光法对不同单克隆细胞抽提的蛋白进行分析，鉴定出阳性克隆。实验分为对照组（pFlag-CMV4稳转 HSC-3细胞）和实验组（pFlag-CPTP 稳转 HSC-3 细胞）。Western blotting 法：提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒进行蛋白定量，将提取的蛋白样品进行SDS-PAGE 蛋白电泳，电泳转膜后，采用 Flag 抗体和-actin 抗体为一抗，采用 HRP 标记的山羊抗兔 IgG（H+L）为二抗，ECL 发光后凝胶成像系统成像，分析各组细胞中 CPTP 蛋白表达量的变化。免疫荧光法：各组细胞采用冰冷的甲醇固定，Flag抗体为一抗，Alexa Flour 594标记的山羊抗小鼠 IgG（H+L）为二抗，制片后在荧光显微镜下观察 CPTP蛋白表达情况。1.3克隆形成实验和克隆形成实验和 CCK-8 法检测法检测 2 组细胞增殖组细胞增殖能力能力对照组和实验组 HSC-3 细胞分别接种于直径 10 cm 的培养皿中，每皿 1 000 个细胞，每隔 3 d换液 1次，12 d后进行结晶紫染色并对形成的克隆进行计数，克隆数代表细胞克隆形成能力。采用CCK-8 法检测各组细胞增殖活性，按照 CCK-8 试剂盒 说 明 书 进 行 操 作，每 孔 悬 空 滴 加 100 L CCK-8 试剂，2 h 后开始检测不同时间点（0、24、48 和 72 h）450 nm 波长处的吸光度（A）值，以A值表示各组细胞增殖活性。1.4细胞划痕实验和细胞划痕实验和 Transwell小室实验检测小室实验检测 2组组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数细胞划痕愈合率和侵袭细胞数细胞划痕实验：将对照组和实验组 HSC-3细胞培养至完全贴壁铺满，使用无菌枪头垂直于 6孔细胞培养板平面进行平行划线，6 和 12 h 时在显微镜下观察划痕愈合情况，计算划痕愈合率，代表细胞迁移能力。划痕愈合率=（0 h 划痕面积6 或 12 h 划痕面积）/0 h 划痕面积100%。Transwell小室实验：在铺有基质胶的小室中分别加入 25104 mL1不含血清培养基制成的对照组和实验组细胞悬液 200 L，24 孔细胞培养板中加入 750 L 含有 20%血清的 RPMI 1640 培养基，侵袭培养 48 h后，进行结晶紫染色，并拍照计数穿膜细胞数，即侵袭细胞数。1.5 小 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型 制 备小 鼠 皮 下 移 植 瘤 模 型 制 备 将 56 周 龄BALB/c-nu 雄性小鼠随机分为对照组和实验组，每组 6 只。常规培养对照组和实验组 HSC-3 细胞，消化后重悬于 PBS 缓冲液中，注射器吸取 100 L细胞悬液（约 5106个细胞）皮下注射至小鼠右腋窝区域制备皮下移植瘤模型。对照组小鼠注射pFlag-CMV4 稳转 HSC-3 细胞，实验组小鼠注射pFlag-CPTP 稳转 HSC-3 细胞。每天定时观察各组小鼠状态，每 3 d 测量 1 次移植瘤质量并计算移植瘤体积，肿瘤体积（mm3）=（长宽2）/2。注射 4 周后剥离 2 组小鼠移植瘤标本。所有动物实验均按照 实验动物护理和使用指南 进行，并经桂林医学院机构动物护理和使用委员会批准，符合所有相关道德规范（批准号：2021-0005）。1.6头颈部鳞状细胞癌头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）组织中组织中 CPTP 差异表达基差异表达基因富集分析因富集分析通过 LinkedOmics网站中的基因集富集 分 析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）对基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路877第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）富集分析8-10。LinkedOmics 网站（http：/www.linkedomics.org/login.php）包含了来自肿瘤和癌症 基 因 组 图 谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）项目的 32 种癌症类型和 11 158 例肿瘤患者的多 组 学 数 据 和 临 床 类 型 数据8。检索步骤：选 择 肿 瘤 类 型 为“HNSCC”；选 择 TCGA-HNSCC RNAseq 数 据；输 入 目 的 基 因“CPTP”；选 择 数 据 中 联 合 分 析 临 床 数 据“TCGA-CPTP RNAseq”；选 择“Pearson correlation test”；选择“GSEA 基因富集分析方法对基因进 行 KEGG 通 路 富 集 分 析”；选择“P0.05”。1.7 实 时 荧 光 定 量实 时 荧 光 定 量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法 检 测法 检 测 2 组 细 胞 中组 细 胞 中p53、血 小 板 反 应 蛋 白血 小 板 反 应 蛋 白 1（thrombospondin 1，THBS1）和细胞周期蛋白和细胞周期蛋白 G2（cyclin G2，CCNG2）mRNA 表达水平表达水平采用 Trizol法抽提对照组和实验组 HSC-3 细 胞 总 RNA，采 用 FastKing Gdna Dispelling RT SuperMix 试剂盒进行逆转录反应，反应条件：42 C、15 min，95 C、3 min，4 C、30 min。p53 引 物 序 列：正 向 引 物 5-CCCTC-CTCAGCATCTTATCC-3，反 向 引 物 5-TGG-TACAGTCAGAGCCAACCT-3；THBS1 引物序列：正向引物 5-GCTGGAAATGTGGTGCTTG-TCC-3，反向引物 5-CTCCATTGTGGTTGAA-GCAGGC-3；CCNG2 引 物 序 列：正 向 引 物5-CAGGATTGAGAAATGCCAAAGT-3，反 向引物 5-TGACAGCCAGGACAAAAGTT-3；GAPDH 引 物 序 列：正 向 引 物 5-GAAGGTGA-AGGTCGGAGTC-3，反向引物 5-GAAGATGG-TGATGGGATTTC-3。RT-qPCR 法 反 应 条 件：95 C、15 min；95 C、10 s，55 C、20 s，72 C、30 s，40个循环；72 C、3 min，4 C、30 min。以GAPDH 为内参基因，采用 2Ct法计算各组细胞中目的基因 mRNA表达水平。1.8统计学分析统计学分析采用 SPSS 18.0 统计软件进行统计学分析。各组细胞克隆形成数、细胞增殖活性、划痕愈合率和侵袭细胞数，小鼠移植瘤质量和体积，各组细胞中 p53、THBS1和 CCNG2 mRNA表达水平均符合正态分布，以 xs表示。2 组间样本均数比较采用两独立样本 t检验，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用 SNK-q检验。所有实 验 均 重 复 36次。以P0.05为差异有统计学意义。2 结 果 2.1稳转细胞系鉴定及稳转细胞系鉴定及 2 组细胞中克隆形成数和组细胞中克隆形成数和细胞增殖活性细胞增殖活性与空白对照组比较，部分单克隆细胞中 CPTP蛋白表达量明显增加，也有部分单克隆细胞中 CPTP蛋白表达量无明显增加，同时阳性对照组指示 CPTP蛋白表达的位置（图 1）。对获得的阳性单细胞克隆采用免疫荧光法进一步分析，与对照组比较，实 验 组 细 胞 中 可 见 明 显 的 红 色 荧 光（图 2）。与对照组（92.00 个5.09 个）比较，实验组细胞中克隆形成数（165.43个17.89个）明显增加（P0.01）（图 3）。与对照组比较，24、48和 72 h后实验组细胞增殖活性逐渐升高，72 h时差异有统计学意义（P0.01）（图 4）。2.2 2 组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数组细胞划痕愈合率和侵袭细胞数 与对照组（85.89%4.09%）比较，12 h 时实验组细Lane 1：Blank control group；Lane 2：Positive control group；Lane 3：CPTP positive mononuclear cells；Lane 4：CPTP negative mononuclear cells.图图 1 Western blotting 法 检 测 各 组法 检 测 各 组 HSC-3 细 胞 中细 胞 中CPTP蛋白表达电泳图蛋白表达电泳图Fig.1 Electropherogram of expressions of CPTP protein in HSC-3 cells in various groups detected by Western blotting method图图 2免疫荧光法检测对照组免疫荧光法检测对照组（A）和实验组和实验组（B）细胞中细胞中CPTP蛋白表达情况蛋白表达情况（Bar=10 m）Fig.2 Expressions of CPTP protein in cells in control group（A）and experiment group（B）detected by immunofluorescence method（Bar=10 m）878张湘豫，等.1磷酸神经酰胺转运蛋白对人口腔鳞状细胞癌 HSC3细胞生物学行为的影响胞 划 痕 愈 合 率（96.78%4.00%）明 显 升 高（P0.05）。与对照组（70.99个10.09个）比较，48 h 后 实 验 组 细 胞 中 侵 袭 细 胞 数（170.23 个 15.23 个）明显增加（P0.01）。见图 5和 6。2.32 组小鼠皮下移植瘤体积和质量组小鼠皮下移植瘤体积和质量与对照组比较，注射后 2、3 和 4 周时实验组小鼠移植瘤体积明显增加（P0.05 或 P0.01）。见图 7。与对照组（90.56 mg6.03 mg）比较，注射 4 周时实验组小鼠移植瘤质量（113.23 mg7.89 mg）明显增加（P0.05）。2.4HNSCC 组织中组织中 CPTP 差异表达基因差异表达基因通过LinkedOmics 网站，分析 HNSCC 组织中 CPTP 差异表达基因，CPTP 基因与散乱片段极性蛋白 1（dishevelled segment polarity protein 1，DVL1）、泛图图 3克隆形成实验检测对照组克隆形成实验检测对照组（A）和实验组和实验组（B）细胞中克细胞中克隆形成情况隆形成情况Fig.3Clone formations of cells in control group（A）and experiment group（B）detected by clone formation test*P 0.01 compared with control group.图图 4CCK-8法检测法检测 2组细胞增殖活性组细胞增殖活性Fig.4 Proliferation activities of cells in two groups detected by CCK-8 methodA-C：Control group；D-F：Experiment group；A，D：0 h；B，E：6 h；C，F：12 h.图图 5细胞划痕实验检测对照组和实验组细胞迁移情况细胞划痕实验检测对照组和实验组细胞迁移情况(Bar=10 m)Fig.5Migrations of cells in control group and experiment group detected by cell scratch experiment(Bar=10 m)879第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）素偶联酶E2 J2（ubiquitin conjugating enzyme E2 J2，UBE2J2）、假尿苷合酶 1（pseudouridine synthase like 1，PUSL1）、保 留 在 内 质 网 分 选 受 体 1（retention in endoplasmic reticulum sorting receptor 1，RER1）和肿瘤蛋白 p63 调节 1（tumor protein p63 regulated 1 like，TPRG1L）mRNA 表达水平呈正相关关系（P0.05），与基质蛋白 3（matrin 3，MATR3）、M 期磷蛋白 9（M-phase phosphoprotein 9，MPHOSPH9）、lin-9 DREAM MuvB 核 心 复 杂 组 件（lin-9 DREAM MuvB core complex component，LIN9）、Sp4 转录因子（Sp4 transcription factor，SP4）和血管内皮锌指转录因子（vascular endothelial Zinc finger 1，VEZF1）mRNA表达水平呈负相关关系（P0.05）。KEGG 通路富集分析显示：CPTP 与核糖体酶、水解酶、帕金森病和生物合成等有密切关联，同时 CPTP 参与生物素代谢、磷酸肌醇代谢、p53信号通路和 RNA 转运等代谢通路（图 8）。提示在HNSCC 细胞中 CPTP 的作用可能是通过 p53 等信号通路介导的。2.52 组细胞中组细胞中 p53、THBS1 和和 CCNG2 mRNA 表表达 水 平达 水 平 与 对 照 组 比 较，实 验 组 HSC-3 细 胞 中p53、THBS1和 CCNG2 mRNA 表达水平明显降低（P0.01）。见图 9。3 讨 论 头颈部肿瘤是世界第六大常见的恶性肿瘤，每年约有 50 万新确诊病例，同时也是癌症相关死亡的主要原因之一11。口咽、口腔和下咽的鳞状上皮是其主要的组织起源12-13。口腔癌（oral cancer，OC）是一类比较常见的恶性肿瘤14，2018年全球记录了 354 864 例 OC 新发病例和 177 384 例与 OC相关的死亡病例14-15。吸烟、无烟烟草、饮酒和人乳 头 瘤 病 毒 感 染 是 OC 的 主 要 危 险 因 素16-17。OSCC 占 OC 的 90%以上，目前 OSCC 患者的主要治疗包括手术治疗、化疗、放疗和联合治疗18-19。尽管 OSCC的治疗取得了一定的进展，但由于局部复发和颈部淋巴结继发性转移，OSCC 患者的 5 年生存率仍为 50%60%20-21。因此迫切需要寻找OSCC的潜在标志物和有效治疗靶点。在癌症发生发展中，CPTP 的调节机制与其生物学功能有密切关联。研究显示：癌症的形成不仅与癌细胞的生长有关，也与癌细胞的迁移和侵袭能力 有 关22。在 鼻 咽 癌 中，锌 指 蛋 白 488（Zinc finger protein 488，ZNF488）作 为 一 种 类 似图图 6Transwell 小室实验检测对照组小室实验检测对照组（A）和实验组和实验组（B）细细胞侵袭情况胞侵袭情况（结晶紫结晶紫，Bar=10 m）Fig.6 Invasion of cells in control group（A）and experiment group（B）detected by Transwell chamber experiment(Crystal violet,Bar=10 m)A：Transplanted tumors formed on dorsal side of nude mice；B：In vivo growth curve.*P0.05，*P 0.01 compared with control group.图图 72组小鼠移植瘤体积组小鼠移植瘤体积Fig.7Volumes of transplanted tumor of mice in two groups880张湘豫，等.1磷酸神经酰胺转运蛋白对人口腔鳞状细胞癌 HSC3细胞生物学行为的影响Kruppel的锌指转录因子，已被证实是一种癌基因，可促进 Wnt/-连环蛋白途径，诱导肿瘤细胞侵袭和肿瘤发生发展，引起上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）23。本研究结果表明：CPTP对 OSCC HSC-3细胞的迁移和侵袭能力具有促进作用，但其作用的分子机制尚待进一步深入研究。在线的数据库分析结果显示：在 HNSCC 细胞中 CPTP 可能影响生物素代谢、磷酸肌醇代谢、p53 信号通路和 RNA 转运等的代谢通路，其中对p53 信号通路的抑制作用可能会影响肿瘤的发生发展。研究24证明：50%以上恶性肿瘤中会出现p53 基因突变，具有 p53 基因突变的细胞失去了自我修复和监视的功能，最终造成细胞的恶性增殖。上调 p53信号通路一般具有抑制肿瘤的功能，而下调 p53信号通路具有促进肿瘤的作用25。在不同癌症中，p53 信号通路对肿瘤的发生发展均发挥重要作用26，抗沉默功能蛋白 1B（anti-silencingfunction 图图 8HNSCC组织中组织中 CPTP差异表达基因差异表达基因 KEGG通路富集分析通路富集分析Fig.8KEGG pathway enrichment analysis on CPTP differential expression genes in HNSCC tissueA：p53 mRNA expression level；B：THBS1 mRNA expression level；C：CCNG2 mRNA expression level.*P0.01 compared with control group.图图 92组细胞中组细胞中 p53、THBS1和和 CCNG2 mRNA表达水平表达水平Fig.9Expression levels of p53,THBS1,CCNG2 mRNA in HSC-3 cells in two groups881第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）1B，ASF1B）可通过调节 p53 介导的 EMT 信号通路促进肺癌细胞增殖、迁移和侵袭27。侵袭性乳腺癌中经常出现 p53丢失和 PTEN 限制的磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphoinositide-3 kinase，PI3K）-AKT通路激活28。本研究结果显示：在 CPTP 过表达的 HSC-3细胞中，p53、THBS1和 CCNG2 mRNA表达水平降低，提示 CPTP 可能通过抑制 p53信号通路发挥作用；体外成瘤实验结果显示：CPTP 过表达可增强 HSC-3 细胞在小鼠体内的成瘤能力。在本研究中仅讨论了过表达 CPTP对口腔鳞状细胞癌 HSC-3 细胞功能的影响，后续可通过转录组测序和蛋白质组学分析过表达或敲低 CPTP对细胞中信号通路的影响，进一步阐明其在肿瘤细胞中的作用机制。参考文献1 ZHANG Y Q，ZHANG X Y，LU M Y，et al.Ceramide-1-phosphate and its transfer proteins in eukaryotes J.Chem Phys Lipids，2021，240：105135.2 MISHRA S K，GAO Y G，DENG Y B，et al.CPTP：a sphingolipid transfer protein that regulates autophagy and inflammasome activationJ.Autophagy，2018，14（5）：862-879.3 SIMANSHU D K，KAMLEKAR R K，WIJESINGHE D S，et al.Non-vesicular trafficking by a ceramide-1-phosphate transfer protein regulates eicosanoids J.Nature，2013，500（7463）：463-467.4 GOMEZ-LARRAURI A，PRESA N，DOMINGUEZ-HERRERA A，e