基因诊疗与基因治疗专家讲座.pptx

基因诊疗与基因治疗基因诊疗与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy第二十八章第二十八章基因诊疗与基因治疗第1页n第一节第一节 基因诊疗学基础基因诊疗学基础n第二节第二节 遗传病基因诊疗遗传病基因诊疗n第三节第三节 肿瘤基因诊疗肿瘤基因诊疗n第四节第四节 基因基因诊疗诊疗在法医学上在法医学上应应用用 n第五节第五节 基因治疗概念及策略基因治疗概念及策略 本章内容提要本章内容提要基因诊疗与基因治疗第2页第一节第一节 基因诊疗学基础基因诊疗学基础Basis of Gene Diagnostics基因诊疗与基因治疗第3页基因诊疗之父基因诊疗之父简悦威简悦威 1976年年加加州州大大学学华华裔裔科科学学家家 Kan YW用用核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术首首次次对对一一例例地地中中海海贫血进行诊疗。贫血进行诊疗。基因诊疗与基因治疗第4页一、一、基因基因诊疗诊疗概念、特点及概念、特点及临临床意床意义义 定义：定义：利利用用分分子子生生物物学学技技术术，经经过过检检测测基基因因及及基基因因表表示示产产物物存存在在状状态态，对对人人体体疾疾病病作作出出诊诊疗疗方方法。法。基基因因诊诊疗疗检检测测目目标标分分子子是是DNADNA、RNARNA，也也能够是蛋白质或者多肽。能够是蛋白质或者多肽。基因诊疗与基因治疗第5页诊疗依据诊疗依据(遗传物质改变遗传物质改变)n nDNADNA、RNARNA或或或或蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质水水水水平平平平改改改改变变变变，如如病病毒毒基基因因及及其其转转录录产产物物在在体体内内从从无无到到有有、癌癌基基因因表表示示水水平平从低到高；从低到高；n n基基基基因因因因结结结结构构构构改改改改变变变变，如如点点突突变变引引发发基基因因失失活活、染染色色体转位引发基因异常激活或灭活。体转位引发基因异常激活或灭活。基因诊疗与基因治疗第6页基因诊疗特点基因诊疗特点n高特异性高特异性n高灵敏性高灵敏性n早期诊疗性早期诊疗性n应用广泛性应用广泛性基因诊疗与基因治疗第7页二、基因诊疗中惯用分子生物学技术二、基因诊疗中惯用分子生物学技术核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization）聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）DNA序列测定（序列测定（DNA sequencing）生物芯片（生物芯片（biochips）Western免疫印迹（免疫印迹（Western blotting）免疫组织化学诊疗免疫组织化学诊疗 基因诊疗与基因治疗第8页（三）（三）单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strand conformation polymorphism,SSCP）DNA突突变变造造成成DNA片片段段碱碱基基序序列列不不一一样样，变变性性为为单单链链后后在在中中性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶中中构构象象不不一一样样（单单链链构构象象多多态态性性），利利用用迁迁移移率率差差异异可可使各种序列不一样单链分离开来。使各种序列不一样单链分离开来。基因诊疗与基因治疗第9页PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意基因诊疗与基因治疗第10页正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 基因诊疗与基因治疗第11页基因诊疗中惯用分子生物学方法比较基因诊疗中惯用分子生物学方法比较方法方法特点特点核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多DNADNA测序测序可自动化可自动化生物芯片生物芯片效率高，成本高效率高，成本高基因诊疗与基因治疗第12页三、三、基因诊疗技术路线与方法基因诊疗技术路线与方法 n直接诊疗：直接分析致病基因分子结构及表直接诊疗：直接分析致病基因分子结构及表示是否异常示是否异常n间接诊疗：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊疗：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 依据对致病基因或相关基因了解程度决定依据对致病基因或相关基因了解程度决定基因诊疗技术路径选择。基因诊疗技术路径选择。基因诊疗与基因治疗第13页（一）直接诊疗路径（一）直接诊疗路径 必要条件：必要条件：被检测基因改变与疾病发生有直接因果关系被检测基因改变与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被确定被检基因正常分子结构已被确定 被检基因致病分子机制（突变位点或表示改变）被检基因致病分子机制（突变位点或表示改变）已知已知基因诊疗与基因治疗第14页5/5/3/3/RFLP1.1.点突变检测点突变检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变基因诊疗与基因治疗第15页斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 基因诊疗与基因治疗第16页 在在DNA序序列列上上有有一一段段较较长长序序列列重重新新排排布布。包包含含数数十十个个碱碱基基到到数数千千个个碱碱基基丢丢失失、插插入入、替替换换、重重复复和和倒倒位位等等，以以及及染染色色体体突突变变或或畸畸变变，包包含含染染色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.2.基因重排检测基因重排检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR 基因诊疗与基因治疗第17页3.基因表示异常检测基因表示异常检测 mRNA相对定量分析相对定量分析 mRNA绝对定量分析绝对定量分析 mRNA长度分析长度分析基因诊疗与基因治疗第18页（二）间接诊疗路径（二）间接诊疗路径1.1.采取原因采取原因致病基因未知或基因结构不确定致病基因未知或基因结构不确定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测基因诊疗与基因治疗第19页 DNA多多态态性性：指指群群体体中中DNA分分子子存存在在最最少少两两种种不不一一样样类类型型，即即个个体体间间同同一一染染色色体体相同位置上核苷酸序列存在一定差异或变异相同位置上核苷酸序列存在一定差异或变异。多多在在进进化化中中形形成成，本本身身并并不不致致病病，只只是是与一些遗传性致病基因有一定连锁关系。与一些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标识遗传标识基因诊疗与基因治疗第20页间接诊疗：检测与致病基因连锁遗传标识间接诊疗：检测与致病基因连锁遗传标识三代遗传标识：三代遗传标识：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variable number of tandem repeats);STR(short tandem repeats)SNP(single nucleotide polymorphism)基因诊疗与基因治疗第21页第五节第五节 基因治疗概念及策略基因治疗概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy基因诊疗与基因治疗第22页n n定定义义：经过经过在特定靶在特定靶细细胞中表示胞中表示该细该细胞原来不胞原来不表示基因，或采取特定方式关表示基因，或采取特定方式关闭闭、抑制异、抑制异常表示基因，到达治常表示基因，到达治疗疗疾病目疾病目标标治治疗疗方法。方法。基因诊疗与基因治疗第23页本节内容提要本节内容提要 一、基因治疗策略一、基因治疗策略二、基因转移技术二、基因转移技术三、基因干预三、基因干预四、基因治疗应用研究四、基因治疗应用研究五、基因治疗前景与问题五、基因治疗前景与问题基因诊疗与基因治疗第24页 一、基因治疗策略一、基因治疗策略基因诊疗与基因治疗第25页 （一）基因置换（一）基因置换（gene replacement）定定义义：指指将将特特定定目目标标基基因因导导入入特特定定细细胞胞，经经过过定定位位重重组组，导导入入正正常常基基因因，以以置置换换基基因因组组内内原原有有缺缺点基因。点基因。目标：目标：将缺点基因异常序列进行桥正。将缺点基因异常序列进行桥正。对对缺缺点点基基因因缺缺点点部部位位进进行行准准确确原原位位修修复复，不不包括基因组任何改变。包括基因组任何改变。基因诊疗与基因治疗第26页（二）（二）基因添加基因添加（gene augmentation）定定义义:经经过过导导入入外外源源基基因因使使靶靶细细胞胞表表示示其其本本身身 不表示基因。不表示基因。类型类型:n在在有有缺缺点点基基因因细细胞胞中中导导入入对对应应正正常常基基因因，而而细细胞胞内内缺缺点点基基因因并并未未除除去去，经经过过导导入入正正常常基基因表示产物，赔偿缺点基因功效；因表示产物，赔偿缺点基因功效；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞原原来来不不表表示示基基因因，利利用其表示产物到达治疗疾病目标。用其表示产物到达治疗疾病目标。基因诊疗与基因治疗第27页（三）基因干预（三）基因干预（gene interference）定义：定义：采采取取特特定定方方式式抑抑制制某某个个基基因因表表示示，或或者者经经过过破破坏坏某某个个基基因因结结构构而而使使之之不不能能表表示示，以以到达治疗疾病目标。到达治疗疾病目标。基因诊疗与基因治疗第28页n定定义义：将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码酶酶能能使使无无毒毒性性药药品品前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应，从而到达去除肿瘤细胞目标。应，从而到达去除肿瘤细胞目标。n应用：应用：是恶性肿瘤基因治疗主要方法之一。是恶性肿瘤基因治疗主要方法之一。（四）自杀基因治疗（四）自杀基因治疗(Suicide Gene Therapy)基因诊疗与基因治疗第29页自杀基因作用机制自杀基因作用机制 基因诊疗与基因治疗第30页 （五）基因免疫治疗（五）基因免疫治疗 经过将抗癌免疫增强细胞因子或经过将抗癌免疫增强细胞因子或MHC基基因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中抗癌免疫反应。免疫反应。基因诊疗与基因治疗第31页二、基因转移技术二、基因转移技术 基因诊疗与基因治疗第32页基因治疗两种路径基因治疗两种路径载体载体目标基因目标基因in vivoex vivo靶细胞基因诊疗与基因治疗第33页 基因转移基因转移(gene transfer)技术技术 1.病毒介导基因转移病毒介导基因转移 2.非病毒介导基因转移非病毒介导基因转移基因诊疗与基因治疗第34页 1.1.病毒介导基因转移系统病毒介导基因转移系统 病病毒毒载载体体介介导导基基因因转转移移效效率率较较高高，所所以以它它也也是是使使用用最最多多基基因因治治疗疗载载体体。据据统统计计，有有72%72%临临床床试试验验计计划划和和71%71%病病例例使使用用了了病病毒毒载载体，其中用得最多是反转录病毒载体体，其中用得最多是反转录病毒载体。基因诊疗与基因治疗第35页反转录病毒结构及生活周期反转录病毒结构及生活周期（1 1）反转录病毒）反转录病毒 基因诊疗与基因治疗第36页反转录病毒介导基因转移系统反转录病毒介导基因转移系统 由两部分组成由两部分组成反反转转录录病病毒毒载载体体：其其基基因因组组为为缺缺点点型型，保保留留了了病病毒毒包包装装信信号号，而而缺缺失失病病毒毒包包装装蛋蛋白白基基因因.辅辅助助细细胞胞株株：能能合合成成包包装装蛋蛋白白，用用于于反反转转录录病病毒毒载载体体包包装装，但但本本身身却却不不能能包包装装成成辅辅助助病毒颗粒。病毒颗粒。基因诊疗与基因治疗第37页Retroviral packaging system基因诊疗与基因治疗第38页 （2）腺病毒）腺病毒(adenovirus)载体载体 腺病毒是一个大分子腺病毒是一个大分子(36 kb)双链无包膜双链无包膜DNA病毒。它经过受体介导内吞作用进入细胞病毒。它经过受体介导内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。基因诊疗与基因治疗第39页腺病毒优点腺病毒优点n基因导入效率高，对人类安全；基因导入效率高，对人类安全；n宿主范围广；宿主范围广；n基因转导与细胞分裂无关；基因转导与细胞分裂无关；n重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸入重组腺病毒可经过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；或气管内滴注；n腺病毒载体容量较大，可插入腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因。外源基因。基因诊疗与基因治疗第40页 2.非病毒载体介导基因转移系统非病毒载体介导基因转移系统 （1）脂质体介导基因转移技术）脂质体介导基因转移技术 脂脂质质体体介介导导基基因因转转移移技技术术使使用用方方便便、成成本本低低廉。廉。基基本本原原理理:利利用用阳阳离离子子脂脂质质体体单单体体与与DNA混混合合后后，能能够够自自动动形形成成包包埋埋外外源源DNA脂脂质质体体，然然后后与与细细胞胞一一起起孵孵育育，即即可可经经过过细细胞胞内内吞吞作作用用将将外外源源DNA（即目标基因）转移至细胞内，并进行表示。即目标基因）转移至细胞内，并进行表示。基因诊疗与基因治疗第41页 脂质体介导基因转移示意图脂质体介导基因转移示意图基因诊疗与基因治疗第42页（2）受体介导转移技术）受体介导转移技术 将将DNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性配配体体偶偶联联，可使可使DNA含有靶向性。含有靶向性。多多聚聚阳阳离离子子与与配配体体共共价价连连接接后后，又又经经过过电电荷荷相相互互作作用用与与带带负负电电荷荷DNA结结合合，将将DNA包包围围，只只留留下下配配体体暴暴露露于于表表面面。这这么么形形成成复复合合物物可可被被带带有有特特异异性性受受体体靶靶细细胞胞吞吞饮饮，从从而而将将外源外源DNA导入靶细胞。导入靶细胞。基因诊疗与基因治疗第43页受体介导受体介导转移技术转移技术示意图示意图基因诊疗与基因治疗第44页 （3）基因直接注射技术）基因直接注射技术 不不需需要要进进行行基基因因工工程程繁繁琐琐操操作作，直直接接将将裸裸露露DNA注入动物肌肉或一些器官组织内。注入动物肌肉或一些器官组织内。动动物物试试验验表表明明：接接收收注注射射外外源源DNA小小鼠鼠能能够够按按其其基因编码合成对应蛋白质，并能维持数月之久。基因编码合成对应蛋白质，并能维持数月之久。n将将促促进进心心脏脏血血管管生生长长基基因因直直接接注注入入试试验验鼠鼠心心脏脏，可可使使其其心心脏脏壁内毛细血管增加壁内毛细血管增加30%40%；n将将胰胰岛岛素素基基因因直直接接注注入入鼠鼠骨骨骼骼肌肌细细胞胞，能能分分泌泌糖糖尿尿病病所所缺缺乏乏胰岛素；胰岛素；n肌内注射凝血因子肌内注射凝血因子基因，可产生血友病所需凝血因子基因，可产生血友病所需凝血因子。基因诊疗与基因治疗第45页三、基因干预三、基因干预 （gene interference）基因诊疗与基因治疗第46页（一）反义（一）反义RNA（antisense RNA）1.反义反义RNA与基因表示调控与基因表示调控 利用反义利用反义RNA对体外培养细胞进行基因表对体外培养细胞进行基因表示调控，通常采取方法有两种：示调控，通常采取方法有两种：（1）体外合成反义）体外合成反义RNA，直接作用于培养细胞，直接作用于培养细胞，细胞吸收细胞吸收RNA后，发挥作用。后，发挥作用。（2）构建一些能转录反义）构建一些能转录反义RNA重组质粒，将这些重组质粒，将这些质粒转入细胞中，转录出反义质粒转入细胞中，转录出反义RNA而发挥作用。而发挥作用。基因诊疗与基因治疗第47页2.受体介导反义受体介导反义RNA转移技术转移技术 受体介导受体介导RNA转移十分专一，而且效率高；转移十分专一，而且效率高；被被转转移移RNA是是被被保保护护，与与周周围围环环境境之之间间存存在在多多聚聚赖赖氨氨酸酸保保护护层层,能能够够抵抵抗抗环环境境中中核核酸酸酶酶降降解作用。解作用。借助前述受体介导基因转移方法借助前述受体介导基因转移方法，能够能够实现受体介导反义实现受体介导反义RNA转移。转移。基因诊疗与基因治疗第48页（二）核酶（二）核酶 (ribozyme)在在基基因因治治疗疗时时，利利用用核核酶酶分分子子结结合合到到靶靶RNA分分子子中中适适当当部部位位，形形成成锤锤头头状状核核酶酶结结构构，将将靶靶RNA分分子子切切断断，经经过过破破坏坏靶靶RNA分分子子而而到到达治疗疾病目标。达治疗疾病目标。基因诊疗与基因治疗第49页 1.核酶设计核酶设计 （1 1）选选择择适适当当靶靶部部位位，该该部部位位含含有有核核酶酶切切割割位位点点，能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。能与核酶分子结合并组成酶活性结构域。（2）核核酶酶基基本本组组成成：用用于于基基因因治治疗疗核核酶酶分分子子由由三三个个部部分分组组成成，中中间间是是保保守守序序列列（能能够够组组成成酶酶活活性性结结构构域域），两端是引导序列，两端是引导序列。基因诊疗与基因治疗第50页核酶作用机制核酶作用机制 基因诊疗与基因治疗第51页 2.核酶应用核酶应用 与与普普通通反反义义RNA相相比比，核核酶酶含含有有较较稳稳定定空空间间结结构构，不不易易受受到到RNA酶酶攻攻击击。更更主主要要是是，核核酶酶在在切切断断mRNA后后，又又可可从从杂杂交交链链上上解解脱脱下下来来，重重新新结结合合和和切割其它切割其它mRNA分子。分子。基因诊疗与基因治疗第52页（三）（三）RNA干扰干扰 1.RNA干扰现象干扰现象 RNA干干扰扰（RNA interference，RNAi）是是一一个个由由双双链链RNA诱诱发发基基因因缄缄默默现现象象。在在此此过过程程中中，与与双双链链RNA有有同同源源序序列列信信使使RNA（mRNA）被被降降解解，从从而而抑制该基因表示。抑制该基因表示。基因诊疗与基因治疗第53页RNA干扰机制示意图干扰机制示意图 基因诊疗与基因治疗第54页四、基因治疗应用研究四、基因治疗应用研究 基因诊疗与基因治疗第55页（一）遗传病基因治疗研究（一）遗传病基因治疗研究 (一一)遗传病基因治疗必须符合以下要求遗传病基因治疗必须符合以下要求1.在在DNA水平明确其发病原因及机制；水平明确其发病原因及机制；2.必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；必须是单基因遗传病，而且属隐性遗传；3.该基因表示不需要准确调控；该基因表示不需要准确调控；4.该该基基因因能能在在一一个个便便于于临临床床操操作作组组织织细细胞胞中中表表示示并发挥其生理作用；并发挥其生理作用；5.该该遗遗传传病病不不经经治治疗疗将将有有严严重重后后果果(如如不不治治疗疗难难以以存存活活等等)。可可供供选选择择并并符符合合上上述述4条条以以上上要要求求不不过只有过只有30余种遗传病。余种遗传病。基因诊疗与基因治疗第56页n腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 (PNP)缺乏症缺乏症 n珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 n血友病和其它血浆蛋白缺乏症血友病和其它血浆蛋白缺乏症 n苯丙酮酸尿症和其它先天性代谢缺点病苯丙酮酸尿症和其它先天性代谢缺点病 n莱莱-纳纳(Lesch-Nyhan)综合征综合征 n家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 n囊性纤维化病囊性纤维化病 基因诊疗与基因治疗第57页（二）恶性肿瘤基因治疗研究（二）恶性肿瘤基因治疗研究 （1 1）经过基因置换和基因补充，导入各种抑癌基因以抑）经过基因置换和基因补充，导入各种抑癌基因以抑制癌症发生、发展和转移；制癌症发生、发展和转移；肿瘤发生是一个极为复杂过程，许多基因突变会造肿瘤发生是一个极为复杂过程，许多基因突变会造成肿瘤发生。成肿瘤发生。（2 2）抑制癌基因活性，经过干扰癌基因转录和翻译，发）抑制癌基因活性，经过干扰癌基因转录和翻译，发挥抑癌作用；挥抑癌作用；（3 3）增强肿瘤细胞免疫原性，经过对肿瘤组织进行细胞）增强肿瘤细胞免疫原性，经过对肿瘤组织进行细胞因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞溶解因子修饰，刺激机体免疫系统产生对肿瘤细胞溶解和排斥反应；和排斥反应；（4 4）经过导入）经过导入“自杀基因自杀基因”杀伤癌细胞。杀伤癌细胞。基因诊疗与基因治疗第58页自杀基因治疗自杀基因治疗 基基本本原原理理：向向肿肿瘤瘤细细胞胞内内导导入入一一些些真真核核细细胞胞中中不不存存在在酶酶基基因因（自自杀杀基基因因），这这些些基基因因表表示示特特异异性性酶酶能能够够催催化化对对真真核核细细胞胞无无毒毒或或低低毒毒药药品品前前体体，转转变变为为含含有有抑抑制制核核酸酸合合成成效效应应抗抗代代谢谢药药品品，进进而而选选择择性性地地使使转转染染了了“自自杀基因杀基因”肿瘤细胞肿瘤细胞“自杀自杀”。自杀基因治疗是当前肿瘤基因治疗领域自杀基因治疗是当前肿瘤基因治疗领域中研究热点之一。中研究热点之一。基因诊疗与基因治疗第59页 肿瘤免疫基因治疗肿瘤免疫基因治疗 激发机体肿瘤免疫效应或提升免疫效应激发机体肿瘤免疫效应或提升免疫效应细胞功效为目标一个肿瘤基因治疗方法。细胞功效为目标一个肿瘤基因治疗方法。主要包含：主要包含：细胞因子（或受体）基因治疗；细胞因子（或受体）基因治疗；抗原抗体基因治疗。抗原抗体基因治疗。基因诊疗与基因治疗第60页