3D打印n-HA_壳聚糖_米诺环素复合支架的构建与其理化性能、细胞毒性研究.pdf

基金项目:新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目(2 0 2 0 D 0 1 A 2 8)作者简介:牛婉琼(1 9 9 4-),女,在读硕士,研究方向:口腔修复与种植。通信作者:汪振华,男,主任医师,硕士生导师,研究方向:口腔修复与种植,E-m a i l:6 7 0 9 5 2 8 8 5q q.c o m。本文引用:牛婉琼,杨 楠,刘佳怡,等.3 D打印n-HA/壳聚糖/米诺环素复合支架的构建与其理化性能、细胞毒性研究J.新疆医科大学学报,2 0 2 3,4 6(8):1 0 0 9-1 0 1 6.d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.0 8.0 0 43 D打印n-H A/壳聚糖/米诺环素复合支架的构建与其理化性能、细胞毒性研究牛婉琼1,杨 楠2,刘佳怡2,汪振华2(1石河子大学医学院,新疆 石河子 8 3 2 0 0 0;2乌鲁木齐市口腔医院修复科,乌鲁木齐 8 3 0 0 0 2)摘要:目的 采用3 D打印的方法构建不同质量的纳米羟基磷灰石(N a n o-h y d r o x y a p a t i t e,n-HA)/壳聚糖/米诺环素的载药复合支架,并进行相关性能测试。方法 根据加入不同质量的羟基磷灰石和不同浓度的米诺环素,经组合,实验组分为S 1(n-HA 2.5 g、米诺环素1 m o l/L)、S 2(n-HA 3.5 g、米诺环素1 m o l/L)和S 3(n-HA 4.5 g、米诺环素1 m o l/L);S 4(n-HA 2.5 g、米诺环素5 m o l/L)、S 5(n-HA 3.5 g、米诺环素5 m o l/L)和S 6(n-HA 4.5 g、米诺环素5 m o l/L);S 7(n-HA 2.5 g、米诺环素1 0 m o l/L)、S 8(n-HA 3.5 g、米诺环素1 0 m o l/L)和S 9(n-HA 4.5 g、米诺环素1 0 m o l/L)。对照组分为D 1(n-HA 2.5 g、米诺环素0 m o l/L)、D 2(n-HA 3.5 g、米诺环素0 m o l/L)和D 3(n-HA 4.5 g、米诺环素0 m o l/L)。扫描电镜下观察支架形貌结构,对复合支架的吸水率、力学性能、孔径、p H值、体外降解速率、MT T细胞毒性进行检测。结果 不同质量的纳米羟基磷灰石和米诺环素均对复合支架的性能产生影响,支架的孔隙率和孔径会随纳米羟基磷灰石和米诺环素质量的增加不断减小;随着n-HA质量的增加,吸水率呈逐渐下降趋势,但对照组间差异无统计学意义(P=0.8 9 6),同一n-HA质量下实验组的吸水率随着米诺环素浓度的增高缓慢增加(P=0.0 0 0 9),但随着时间的延长,各实验组吸水率又慢慢降低;随着n-HA质量的增加,对照组支架的拉伸强度和最大载荷均有不同程度的降低(P=0.0 0 0 2)。实验组S 1-S 6复合支架拉伸强度随米诺环素增加而增大,当米诺环素的浓度持续加至1 0 m o l/L后,S 7、S 8、S 9组拉伸强度反而降低;相同n-HA质量下的实验组p H值随米诺环素浓度的增加在降低(P=0.0 0 3),S 8组p H值接近健康牙周组织;随着米诺环素浓度的增加,降解率降低,随着n-HA质量的增加,降解率反而增加;不同质量的n-HA支架的细胞增殖率差异无统计学意义,浓度为1、5 m o l/L米诺环素实验组与对照组差异无统计学意义(P=0.6 5),当米诺环素浓度为1 0 m o l/L时,实验组O D值在3 d后出现抑制细胞增殖的情况(P=0.0 0 7)。结论 实验中的米诺环素质量为1、5 m o l/L时,复合支架组具有良好的物理化学性能,无细胞毒性。关键词:3 D打印技术;纳米羟基磷灰石;壳聚糖;米诺环素;种植体周围炎中图分类号:R 7 8 3.1 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 9-5 5 5 1(2 0 2 3)0 8-1 0 0 9-0 8d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 9-5 5 5 1.2 0 2 3.0 8.0 0 4C o n s t r u c t i o n,p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n d c y t o t o x i c i t y o f 3 D p r i n t e d n-H A/c h i t o s a n/m i n o c y c l i n e c o m p o s i t e s c a f f o l d N I U W a n q i o n g1,Y A N G N a n2,L I U J i a y i2,WA N G Z h e n h u a2(1M e d i c a l C o l l e g e o f S h i h e z i U n i v e r s i t y,S h i h e z i X i n j i a n g 8 3 2 0 0 0,C h i n a;2D e p a r t m e n t o f R e s t o r a t i o n,U r u m q i S t o m a t o l o g i c a l H o s p i t a l,U r u m q i 8 3 0 0 0 2,C h i n a)A b s t r a c t:O b j e c t i v e T h e d r u g-c a r r y i n g c o m p o s i t e s c a f f o l d e r s o f N a n o-h y d r o x y a p a t i t e(N a n o-h y d r o x y a p a-t i t e,n-HA)/c h i t o s a n/m i n o c y c l i n e w i t h d i f f e r e n t q u a l i t y w e r e c o n s t r u c t e d b y 3 D p r i n t i n g m e t h o d,a n d t h e r e l a t e d p e r f o r m a n c e t e s t s w e r e c a r r i e d o u t.M e t h o d s B a s e d o n t h e a d d i t i o n o f d i f f e r e n t m a s s e s o f 第4 6卷 第8期新 疆 医 科 大 学 学 报V o l.4 6 N o.8 2 0 2 3年8月J o u r n a l o f X i n j i a n g M e d i c a l U n i v e r s i t yA u g.2 0 2 3 h y d r o x y a p a t i t e a n d d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f m i n o c y c l i n e,b y t h e c o m b i n a t i o n,t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p w a s d i v i d e d i n t o S 1(n-HA 2.5 g,m i n o c y c l i n e 1 m o l/L),S 2(n-HA 3.5 g,m i n o c y c l i n e 1 m o l/L)a n d S 3(n-HA 4.5 g,m i n o c y c l i n e 1 m o l/L);S 4(n-HA 2.5 g,m i n o c y c l i n e 5 m o l/L),S 5(n-HA 3.5 g,m i n o c y c l i n e 5 m o l/L),a n d S 6(n-HA 4.5 g,m i n o c y c l i n e 5 m o l/L);S 7(n-HA 2.5 g,m i n o c y c l i n e 1 0 m o l/L),S 8(n-HA 3.5 g,m i n o c y c l i n e 1 0 m o l/L),a n d S 9(n-HA 4.5 g,m i n o c y c l i n e 1 0 m o l/L).T h e c o n t r o l g r o u p w a s D 1(n-HA 2.5 g,m i n o c y c l i n e 0 m o l/L),D 2(n-HA 3.5 g,m i n o c y c l i n e 0 m o l/L),a n d D 3(n-HA 4.5 g,m i n o c y c l i n e 0 m o l/L).T h e m o r p h o l o g i c a l s t r u c t u r e o f t h e s c a f f o l d w a s o b s e r v e d u n d e r t h e s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e,a n d t h e w a t e r a b s o r p t i o n,m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s,p o r e s i z e,p H,d e g r a-d a t i o n e x p e r i m e n t s a n d MT T c y t o t o x i c i t y o f t h e c o m p o s i t e s c a f f o l d w a s e x a m i n e d.R e s u l t s T h e n-HA a n d m i n o c y c l i n e w i t h d i f f e r e n t q u a l i t i e s h a d a n i m p a c t o n t h e p e r f o r m a n c e o f t h e c o m p o s i t e s c a f f o l d.T h e p o-r o s i t y a n d p o r e s i z e o f t h e s c a f f o l d d e c r e a s e d w i t h t h e i n c r e a s e o f n-HA a n d m i n o c y c l i n e.W i t h t h e i n c r e a s e o f n-HA q u a l i t y,w a t e r a b s o r p t i o n s h o w e d a g r a d u a l d o w n w a r d t r e n d,b u t t h e r e w a s n o s t a t i s t i c a l s i g n i f i-c a n c e b e t w e e n c o n t r o l s(P=0.8 9 6).U n d e r t h e s a m e n-HA q u a l i t y,w a t e r a b s o r p t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p i n c r e a s e d s l o w l y w i t h t h e i n c r e a s e o f m i n o c y c l i n e c o n c e n t r a t i o n(P=0.0 0 0 9),b u t w i t h t h e e x t e n s i o n o f t i m e,w a t e r a b s o r p t i o n o f a l l e x p e r i m e n t a l g r o u p s g r a d u a l l y d e c r e a s e d.W i t h t h e i n c r e a s e o f n-HA m a s s,t h e t e n s i l e s t r e n g t h a n d m a x i m u m l o a d o f t h e s t e n t i n t h e c o n t r o l g r o u p w e r e d e c r e a s e d t o v a r y i n g d e g r e e s(P=0.0 0 0 2).I n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p,t h e t e n s i l e s t r e n g t h o f S 1-S 6 c o m p o s i t e s c a f f o l d i n-c r e a s e d w i t h t h e i n c r e a s e o f m i n o c y c l i n e,b u t t h e t e n s i l e s t r e n g t h o f S 7,S 8 a n d S 9 g r o u p s d e c r e a s e d w h e n m i n o c y c l i n e c o n c e n t r a t i o n w a s c o n t i n u o u s l y i n c r e a s e d t o 1 0 m o l/L.T h e p H v a l u e o f e x p e r i m e n t a l g r o u p w i t h t h e s a m e n-HA m a s s d e c r e a s e d w i t h t h e i n c r e a s e o f m i n o c y c l i n e c o n c e n t r a t i o n(P=0.0 0 3),a n d t h e p H v a l u e o f t h e S 8 g r o u p w a s c l o s e t o t h e h e a l t h y p e r i o d o n t a l t i s s u e.W i t h t h e i n c r e a s e o f m i n o c y c l i n e c o n-c e n t r a t i o n,t h e d e g r a d a t i o n r a t e d e c r e a s e d,a n d w i t h t h e i n c r e a s e o f n-HA q u a l i t y,t h e d e g r a d a t i o n r a t e i n-c r e a s e d.T h e r e w a s n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e c e l l p r o l i f e r a t i o n r a t e o f n-HA s c a f f o l d w i t h d i f f e r e n t q u a l i t y,a n d t h e r e w a s n o s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m i n o c y c l i n e g r o u p a n d t h e c o n t r o l g r o u p w h e n t h e m i n o c y c l i n e c o n c e n t r a t i o n w a s 1 a n d 5 m o l/L(P=0.6 5).Wh e n t h e m i n o c y-c l i n e c o n c e n t r a t i o n w a s 1 0 m o l/L,t h e O D v a l u e o f t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p i n h i b i t e d c e l l p r o l i f e r a t i o n a f-t e r 3 d a y s(P=0.0 0 7).C o n c l u s i o n Wh e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f m i n o c y c l i n e w a s 1 a n d 5 m o l/L,t h e c o m-p o s i t e s c a f f o l d g r o u p h a d g o o d p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n d n o c y t o t o x i c i t y.K e y w o r d s:3 D p r i n t i n g t e c h n o l o g y;n a n o-h y d r o x y a p a t i t e;c h i t o s a n;m i n o c y c l i n e;p e r i-i m p l a n t i t i s 种植牙技术是目前临床上治疗牙体、牙列缺失的常用手段,具有修复美观、功能改善效果好等优点,但术后部分患者种植体周围因各种原因发生炎症感染,导致种植体周围骨丢失,植体发生松动、脱落,严重影响远期预后1。研究种植体周围炎(P I)以及如何控制、治疗种植体周围炎骨缺损是口腔医师急需解决的问题2。研究发现局部给药米诺环素微球联合其他药物或者方法清创对种植体周围炎有效3。纳米羟基磷灰石作为骨替代材料已在骨增量和种植体涂层方面广泛应用,参与复合构建新骨成型的支架,但纳米羟基磷灰石(N a n o-h y d r o x y a p a t i t e,n-HA)存在脆性较大、强度较低、生物降解速度慢等缺点4,经常被用来与可降解的天然高分子材料组合来改善其缺点,壳聚糖(C h i t o s a n,C S)是其选择之一。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物,天然材料,具有无细胞毒性、可降解性、抗菌能力和止血作用的特性5,还具有载药功能,发挥药物的缓释、控释作用6。临床中,数字化制造技术可以帮助临床口腔医生为牙列缺失和缺损的患者更快、更好地提供新种植体和骨缺损材料7。3 D打印技术的应用可以节约骨充填材料并减少手术过程中的创伤,达到精准、微创、快速修复的要求,同时还能缩短治疗周期8。基于以上背景,本研究通过3 D打印技术构建n-HA/C S复合支架,探究不同复合支架的理化性质及细胞毒性。1 材料与方法1.1 材料与仪器 纳米羟基磷灰石(上海阿拉丁试剂有限公司,规格:9 7%,粒径1 0 0 n m),壳聚糖(上海阿拉丁试剂有限公司,规格:2 5 g),米诺环素(天津阿拉丁试剂有限公司),氢氧化钠、无水乙醇、乙酸(新疆农业大学提供),打印成型机(新疆大学自建),小鼠成纤维细胞L-9 2 9(山东国际生物科技园提供),培养瓶、离心管、9 6孔细胞培养板(苏州柯仕0101 新 疆 医 科 大 学 学 报第4 6卷 达电子材料有限公司),四唑盐(MT T)、磷酸缓冲液(P B S)、二甲基亚砜(DM S O)、R PM I 1 6 4 0细胞培养液,胎牛血清,胰蛋白酶,生理盐水溶液(北京索莱宝科技有限公司)。生物安全柜、低温高速离心机、C O2培养箱(美国T h e r m o S c i e n t i f i c),全自动酶标仪(美国B i o T e k),台式低速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司),光学显微镜(日本O l y m p u s 17 1),电子万能试验机(三思纵横UTM 6 0 0 0系列),扫描电镜(日本电子J S M-7 6 1 0 F系列),电子天平(瑞士P r e c i s a)。1.2 实验方法及分组 3 D打印n-HA/壳聚糖/米诺环素复合支架模型是取1 g壳聚糖(脱乙酰度为8 5%9 0%)粉末,溶解于6 m L浓度为0.2 m o l/L的乙酸,在5 0条件下均匀搅拌1 h,此时的溶液为壳聚糖溶液(质量浓度为1%),之后再分批次分别加入2.5、3.5、4.5 g的纳米羟基磷灰石,相同条件下继续搅拌2 h,形成羟基磷灰石/壳聚糖溶液,再分别将1、5、1 0 m o l/L的米诺环素粉末溶于1 m L无水乙醇,将以上两溶液混合后,继续搅拌2 0 m i n,形成米诺环素/C S/n-HA溶液。由于加入不同质量的羟基磷灰石和不同浓度的米诺环素,经组合,实验组分为S 1(n-HA 2.5 g、米诺环素1 m o l/L)、S 2(n-HA 3.5 g、米诺环素1 m o l/L)和S 3(n-HA 4.5 g、米诺环素1 m o l/L);S 4(n-HA 2.5 g、米诺环素5 m o l/L)、S 5(n-HA 3.5 g、米 诺 环 素5 m o l/L)和S 6(n-HA 4.5 g、米 诺 环 素5 m o l/L);S 7(n-HA 2.5 g、米诺环素1 0 m o l/L)、S 8(n-HA 3.5 g、米诺环素1 0 m o l/L)和S 9(n-HA 4.5 g、米诺环素1 0 m o l/L)。对照组分为D 1(n-HA 2.5 g、米诺环素0 m o l/L)、D 2(n-HA 3.5 g、米诺环素0 m o l/L)和D 3(n-HA 4.5 g、米诺环素0 m o l/L)。将各组溶液装入3 D打印成型机中,设置长方体编程程序(喷印边长1 0 mm,高3 mm),启动设置,开始打印支架。待支架打印成形后,浸泡在5%的氢氧化钠溶液中3 0 m i n,将乙酸彻底去除,之后材料用蒸馏水冲洗至中性,室温下干燥2 4 h。1.3 各组支架理化性质检测1.3.1 吸水率检测 对复合支架进行吸水试验,评定其亲水性。称得 各 组 支 架 干 燥 时 的 质 量M 0,3 7下 放 入 装 有5 0 m L蒸 馏 水(p H=7.4的0.0 1 m o l/L P B S中)的烧杯中,每隔0.5、1、4、8、2 4、3 6、4 8 h取各组的样本,检测样本支架质量,滤纸吸除支架表面多余水分后称得质量M 1,计算支架吸水率。吸水率=(M 1-M 0)/M 01 0 0%。1.3.2 力学性能检测 支架拉伸试验:将支架裁取成1 0 mm1.5 mm的样条,常温下用电子万能试验机对支架进行拉伸测试,以0.5 mm/m i n的速率进行测试。1.3.3 孔径检测 每组取3个样品,扫描电镜下观察支架内部结构、孔隙连通性,测量孔径大小取其平均值并记录。1.3.4 支架表面形貌观察 利用原子力显微镜观察各组支架的表面粗糙度,然后在支架表面喷金,再用扫描电子显微镜观察材料的表面微观结构。1.3.5 p H值的测定(1)紫外线3 0 m i n照射细胞无菌操作室;(2)照射完毕后,进入操作室内进行实验;(3)将2 5 0 m g支架材料加入1 m L培养基中,并放置在3 7 恒温培养箱中培养;(4)1 1 0 d取同一时间的浸出液,同时放入冰箱4 保存;(5)每次取样结束后,用检测仪对浸出液的p H值进行精确检测;(6)每组样品重复实验3次,统计实验结果并取均值。1.3.6 支架体外降解性能分析 选择生理盐水溶液作为材料的降解介质,研究材料的体外降解行为。取样品1 0份,每份干燥称质量,将其浸没于质量为自身质量1 0 0倍的生理盐水中,空气环境中在3 7电热恒温培养箱下进行培养,连续1 0周,分别于每周同一时间随机取出1份,称取质量,分析降解性能。降解率=(M 0-M 1)/M 01 0 0%,M 0为支架材料的原始质量,M 1为支架材料降解后的质量。1.4 复合支架MT T细胞毒性检测 取对数生长期小鼠成纤维细胞(L-9 2 9)并配置成单细胞悬液,在3块9 6孔板中,分别将细胞以31 04个/m L,且每孔接种1 0 0 L的质量接种后,放置于C O2培养箱(含体积分数5%二氧化碳气体)中,3 7条件下培养2 4 h,废弃原培养液。之后分别添加各组复合支架浸出液2 0 0 L,继续放置在5%C O2、3 7的培养箱中,同时以不加浸提液的小鼠细胞为空白对照组。7 2 h后,再 在 每 孔 中 加 入 质 量 浓 度 为5 g/L的MT T溶液1 0 0 L,再于4 h后去除孔板中溶液,加DM S 0液体6 0 0 L,置于振荡器振荡1 0 m i n,在酶标仪5 6 0 n m波长下测定各组的吸光度(O D值)。在1、3、5、7、9、1 1 d的同一时间点各取一块板,记录O D值,倒置显微镜观察细胞生长情况及其形态。细胞毒性分级如下:相对增殖率(R G R)1 0 0%为0级;9 9%相对增殖率8 0%为1级;7 9%相对增殖率5 0%为2级;4 9%相对增殖率3 0%为3级;2 9%相对增殖率0%为4级。1.5 统计学分析 应用S P S S 2 2.0软件处理数据,1101 第8期 牛婉琼,等:3 D打印n-HA/壳聚糖/米诺环素复合支架的构建与其理化性能、细胞毒性研究计量资料符合正态性,以均数标准差(x-s)表示,采用方差分析;不符合正态性,以M(P2 5,P7 5)表示,采用K r u s k a l-W a l l i s H检验。计数资料以例(%)表示,采用2检验,P0.0 5为差异具有统计学意义。2 结果2.1 复合支架的表面形态 打印出的复合支架为约1 0 mm1 0 mm3 mm的长方体,呈乳白色,肉眼可见支架纵横结构内存在多孔隙,表面粗糙,有一定的韧性和脆性,见图1。图1 复合支架表面形态2.2 各组复合支架的理化性质2.2.1 各组支架吸水率变化 对照组D 1-D 3中,随着n-HA质量的增加,吸水率呈逐渐下降趋势,但D 1、D 2、D 3组间差异无统计学意义(P=0.8 9 6)。各实验组吸水率在4 h左右趋于稳定,相同n-HA质量下实验组(即S 1、S 4和S 7;S 2、S 5和S 8;S 3、S 6和S 9)的吸水率随着米诺环素浓度的增高缓慢增加(P=0.0 0 0 9),其中S 7组在4 h时的吸水率最高,为2 1 3.5%,但随着时间的延长,各实验组吸水率又慢慢降低,S 7、S 8、S 9组在2 43 6 h时降低速度最快,可能由于米诺环素自身具有亲水性的特性,可以在24 h内溶于水中,见图2。2.2.2 各组支架力学性能比较 随着n-HA质量的增加,对照组D 1-D 3复合支架的拉伸强度和最大载荷均有不同程度的降低(P=0.0 0 0 2)。实验组S 1-S 6复合支架的拉伸强度随着米诺环素浓度的增加而增大,当米诺环素的浓度继续增加至1 0 m o l/L后,S 7、S 8、S 9组拉伸强度反而降低,实验组S 9的拉伸强度仅为1.4 7 MP a,见表1。2.2.3 各组孔径大小比较 研究表明,促进骨组织修复再生的孔隙率应至少在5 0%以上9,本研究中各组支架的孔隙率均符合这一要求,且孔径越大支架孔隙率越高,见表2。图2 对照组D 1-D 3和实验组S 1-S 9的吸水率变化情况 表1 各组支架力学性能比较分组最大载荷/N拉伸强度/MP a拉伸情况S 14 3.7 93.4 1样品从中间断裂S 23 6.9 42.7 3样品从中间断裂S 32 9.7 72.1 8样品从中间断裂S 44 6.8 33.7 9样品从中间断裂S 53 7.3 52.9 4样品从中间断裂S 63 0.6 72.3 8样品从中间断裂S 73 8.8 52.9 9样品从中间断裂S 82 7.4 42.0 6样品从中间断裂S 92 0.3 71.4 7样品从中间断裂D 14 0.7 93.2 8样品从中间断裂D 2 3 4.4 72.6 8样品从中间断裂D 3 2 5.5 91.9 5样品从中间断裂表2 各组孔径大小比较分组孔径/m孔隙率/%S 14 3 95 78 2.52.1S 23 5 54 87 6.41.5S 32 0 54 96 5.11.3S 44 0 66 07 9.62.0S 53 1 75 57 2.31.8S 61 8 85 56 2.81.7S 73 6 47 27 5.52.1S 82 7 35 77 0.91.6S 91 4 76 56 0.81.7D 14 5 77 48 5.42.0D 23 6 76 07 9.61.3D 32 1 54 66 9.81.52.2.4 各组支架表面形貌情况 电镜下复合支架2101 新 疆 医 科 大 学 学 报第4 6卷 呈网状结构,材料间相互结合,有大小不等的孔隙,分布不均匀。电镜下放大1 0 0 0倍后,随着n-HA质量的增加,D 1、D 2、D 3对照组的孔隙在逐渐减小。同时随着米诺环素浓度的增加,相同n-HA质量下各实验组的支架孔隙也在逐渐减小,支架表面具有贯通的空隙,见图3。图3 电镜下各组支架的表面形貌(1 0 0 0)2.2.5 各组支架p H值的比较 随着n-HA质量的增加,p H值变化不大,未见明显升高或降低(P=0.0 0 0 6),随着米诺环素浓度的增加,相同n-HA质量下的实验组p H值降低(P=0.0 0 3)。实验组S 1-S 9的p H值于78 d的时间点时趋于相对稳定状态,其中S 8组的复合支架的p H值(6.87.2)在趋于稳定时更接近健康牙周组织的p H值1 0,见图4。2.2.6 各组支架体外降解性能比较 经过连续1 0周的降解,显示支架具有一定的生物稳定性,同时随时间推移缓慢降解;随着米诺环素浓度的增加,降解率降低,随着n-HA质量的增加,降解率增加,见图5。图4 各组支架11 0 d的p H值变化情况3101 第8期 牛婉琼,等:3 D打印n-HA/壳聚糖/米诺环素复合支架的构建与其理化性能、细胞毒性研究图5 各组支架第1 0周降解率比较2.3 复合支架MT T细胞毒性检测 小鼠L-9 2 9细胞培养的第1天,各实验组间细胞O D值比较差异无统计学意义;培养第3天,S 1-S 6组复合支架细胞的O D值与对照组比较差异无统计学意义(P=0.6 5),此时1 0 m o l/L米诺环素复合支架组(即S 7、S 8、S 9)的O D值到达峰值,随着时间增加O D值在不断降低,抑制了细胞增殖(P=0.0 0 7),说明具有一定的细胞毒性。而1 m o l/L、5 m o l/L米诺环素复合支架组(即S 1-S 6)的O D值在第5天左右达到最高水平,后期则基本保持不变,见图6。S 1-S 6组的细胞相对增殖率(R G R)均在8 0%以上,毒性分级为01级,细胞毒性评价均合格。S 7、S 8、S 9组R G R的分级中出现了2、3级,其余各组之间细胞增殖率差异无统计学意义,见表3。在11 1 d内显微镜下观察细胞形态发现,各组复合支架材料浸提液中的小鼠L-9 2 9细胞贴壁生长、增殖情况非常好,第3天时镜下观察细胞数量的差异不大,此后细胞逐渐贴壁生长,多数呈卵圆形或者是梭形,细胞数量开始增多,见图7。图6 不同浓度米诺环素支架处理后的小鼠L 9 2 9细胞1 1 d内增殖情况表3 各组支架培养小鼠L-9 2 9细胞相对增殖率与细胞毒性分级评价分组1 dR G R/%分级3 dR G R/%分级5 dR G R/%分级7 dR G R/%分级9 dR G R/%分级1 1 dR G R/%分级S 11 1 2.5 301 0 6.4 101 0 0.0 909 4.7 019 5.2 018 9.8 81S 21 2 1.8 701 0 2.6 201 0 4.6 019 9.3 719 3.0 219 5.4 51S 31 3 1.4 701 0 4.8 401 0 5.2 801 0 9.4 109 9.2 701 0 2.4 90S 41 1 6.5 301 0 8.1 201 0 4.4 301 0 1.1 101 0 5.2 401 0 5.5 00S 51 2 8.5 301 0 7.7 201 0 2.8 101 0 0.8 701 0 5.5 301 0 6.0 90S 61 3 3.0 701 0 4.5 801 0 6.7 301 1 5.2 601 0 6.8 401 0 6.9 70S 71 3 6.5 301 0 7.3 306 1.7 525 4.0 723 8.7 633 6.9 83S 81 4 2.4 009 9.2 117 0.2 726 2.7 725 3.4 525 0.6 22S 91 4 3.2 001 0 5.8 906 7.3 826 3.5 225 0.5 524 6.0 03D 11 0 9.8 701 0 1.4 409 8.2 119 5.5 719 7.6 019 8.0 91D 21 1 6.0 009 7.6 419 9.6 619 7.5 511 0 0.9 509 8.6 11D 39 2.5 319 8.6 919 3.5 318 8.8 519 0.1 119 7.0 714101 新 疆 医 科 大 学 学 报第4 6卷 图7 各组支架浸提液中的小鼠L-9 2 9细胞形态(4 0 0)3 讨论随着骨组织工程的发展,支架作为细胞的载体,主要为细胞提供营养和代谢的化学环境和物理支撑;利用支架材料修复骨组织损伤的过程中,支架是决定缺损部位组织结构能否实现重建、恢复组织再生能力的关键性因素,同时也为细胞的黏附、生长、增殖、迁移、分化等生物学功能提供有利场所1 1-1 2。支架的组成材料及复合方式决定了支架的内部结构,同样也决定着其物理性质和机械性能。本实验通过3 D打印技术完成羟基磷灰石、壳聚糖、米诺环素材料的结合,成功构建了复合载药支架。对复合支架试验研究中发现,3 D打印不同质量n-HA/C S/米诺环素复合支架具有良好的物理、化学、细胞毒性低的性能,力学检测中随着n-HA质量的增加,对照组支架的拉伸强度和最大载荷均有不同程度的降低,实验组S 1-S 6复合支架拉伸强度随米诺环素增加而增大,当米诺环素的浓度持续加至1 0 m o l/L后,S 7、S 8、S 9组拉伸强度反而降低;随着n-HA质量的增加,吸水率呈逐渐下降趋势,同一n-HA质量下实验组的吸水率随着米诺环素浓度的增高缓慢增加,但随着时间的延长,各实验组吸水率又慢慢降低;相同n-HA质量下的实验组p H值随米诺环素浓度的增加在降低;随着米诺环素浓度的增加,降解率降低,随着n-HA质量的增加,降解率反而增加;MT T细胞毒性检测中,低浓度米诺环素实验组与对照组差异不大,当米诺环素浓度为1 0 m o l/L时,实验组O D值在3 d后出现抑制细胞增殖的情况,有细胞毒性。有研究表明,米诺环素、壳聚糖、纳米羟基磷灰石的降解速率依次降低,随着米诺环素、壳聚糖比例的增加,支架材料的降解率变快,可能由于这两种材料有较好的亲水能力1 3-1 4。因此控制好米诺环素、壳聚糖、纳米羟基磷灰石的质量比例,使得降解速度与成骨速率相当,这样才能有效地修复骨缺损,从而做到在支架材料降解的同时有新骨进入生长。本实验中MT T浸提比例的问题还有待研究,马凤森