TGFBR2、TGF-β1及CTGF在盆腔器官脱垂患者子宫韧带组织中的表达及意义.pdf

基金项目：山西省“四个一批”科技兴医创新计划项目（）作者简介：王翮，女，生，在读硕士，：收稿日期：、及 在盆腔器官脱垂患者子宫韧带组织中的表达及意义王翮，平毅（山西医科大学第二医院妇产科，太原 ；通讯作者，：）摘要：目的研究转化生长因子 受体 （，）、转化生长因子 （，）及结缔组织生长因子（，）在盆底器官脱垂（，）患者子宫韧带组织中的表达及意义。方法选取山西医科大学第二医院妇产科 年 月至 年 月收治的 例 患者子宫主韧带及骶韧带组织为 组，另选取 例因子宫肌瘤同期在该院行腹腔镜下全子宫切除术患者的主韧带及骶韧带组织为对照组。染色观察子宫主、骶韧带胶原纤维及成纤维细胞状态，并使用 染色进一步观察胶原纤维形态，免疫蛋白印迹法（）检测 、型胶原蛋白（）及型胶原蛋白（）的蛋白表达水平。另选取 例 患者和 例子宫肌瘤患者骶韧带进行全基因转录组测序，从转录组测序结果中筛选出参与胶原代谢且显著低表达的 基因，并对 基因可能影响的 及 基因从蛋白表达及 转录水平进行分析；采用 相关分析对 与 和 的 相对表达水平进行相关性分析。结果 组及对照组患者的年龄、孕产次、体质量指数比较，差异无统计学意义（）。苏木精 伊红染色法（，）染色显示 组韧带组织胶原细胞数量较对照组明显减少且排列紊乱，染色显示 组韧带组织纤维结缔组织断裂呈片状，排列紊乱且结构疏松，数量较对照组明显减少。基因转录组测序结果显示 患者骶韧带组织与子宫肌瘤患者骶韧带组织基因转录组水平相比有 个基因显著低表达，其中 基因显著低表达，差异有统计学意义（调整 ）。检测显示：组韧带组织中 、及 的蛋白相对表达量均较对照组降低（）。实时荧光定量聚合酶链式反应（，）结果显示：组韧带组织中 、基因 相对表达量均较对照组降低（），与 呈正相关（，），且 与 也呈正相关（，）。结论盆底器官脱垂患者盆底韧带中 、在 转录水平及蛋白表达水平上均降低，可能通过调控 基因通路影响纤维代谢参与 发病。关键词：盆腔器官脱垂；纤维代谢中图分类号：文献标志码：文章编号：（）：，（，；，：）：（），（），（）（），（）（），（），（）（），（）（，）（，），：；盆腔器官脱垂（，）指因盆底肌肉和筋膜组织薄弱或者损伤而造成的盆腔器官下移及功能异常的女性疾病，高发于老年女性，生育政策的改革使得育龄期女性患病风险增加，将对女性患者的生理、生活、经济造成严重负担。环境因素无法完全解释 的发病原因，然而，其分子发病机制尚不明确，目前临床上仅对其症状进行治疗，而无法从病因上予以根治，且存在并发症多以及复发率高等问题。因此，从分子发病机制方面进行研究，可能为 的有效治疗提供新策略。良好的胶原纤维网络是维持盆底支持组织的生物学基础，所有能够影响盆底支持组织胶原代谢的基因都可能导致 的发生 。我们对 患者骶韧带进行全基因转录组测序发现转化生长因子 受体（，）基因在骶韧带组织中呈显著低表达，而 基因编码的载体蛋白是转化生长因子 （，）的特异受体蛋白，及结缔组织生长因子（，）共同参与胶原代谢的过程，另外 被认为是 的下游基因 。可能与 及 共同参与韧带组织胶原代谢过程，既往研究中 和 参与胶原代谢过程，但测序结果中 和 基因在 组与正常组比较，表达并无显著差异，可能与转录组测序中韧带组织样本量少有关，因此，本研究通过免疫组化蛋白印迹（）、实时荧光定量聚合酶链式反应（，）技术对盆底器官脱垂患者子宫韧带组织中 、及 从蛋白表达及 转录水平进行检测，旨在进一步验证并探讨 、在 发生中的作用。资料与方法 一般资料选取 年 月至 年 月本院收治的 例 患者（分期 期）及 例子宫肌瘤患者主韧带及骶韧带标本，分为 组和对照组。韧带组织标本由主治医师及以上职称的医师在多孔腹腔镜下全子宫切除术术中切取，标本大小约 。所有患者无恶性肿瘤、无盆底手术史、无盆腔炎性疾病、无糖尿病、哮喘或心血管疾病、无激素相关疾病等相关病史，手术前 个月内未使用全身激素，且术后病理结果提示无雌激素相关疾病。两组患者的年龄、孕产次数、体质量指数（）等指标比较差异均无统计学意义（，见表 ）。相应组织标本的获取均通过山西医科大学第二医院伦理委员会批准：（）第（）号，获得患者知情同意并签字。研究方法 主要试剂 一抗（兔）、一抗（兔）、一抗（兔）、一抗（鼠）、一抗（兔）和 一抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，蛋白浓度测定试剂盒、彩虹 广谱蛋白 购自北京索莱宝科技有限公司，兔二抗及鼠二抗购自北京全式金生物有限公司，、引物购自上海生工生物工程有限公司，、购自新贝生物科技有限公司。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表 两组患者的一般资料比较 分组年龄（岁）孕次产次 （）组 对照组 取材纳入 组与对照组的患者手术方式均为腹腔镜下全子宫切除术。术中同一位主治及以上级别的医师对韧带组织进行取材，主韧带取材部位：主韧带与宫颈连接处以外 ，组织大小约 ，骶韧带取材部位：骶韧带与宫颈连接处以外 ，组织大小约 ，放入已标记的无菌 管中，立即放置液氮瓶中，后转至 冰箱保存备用。染色及 染色观察韧带组织纤维细胞及胶原纤维状态将术中取得的骶韧带与主韧带组织标记后固定，进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片及烤片。染色：将切片进行脱蜡、水化，再使用苏木精染色 ，然后进行分化、返蓝，伊红染色后进行脱水、透明，最后进行封片，显微镜下观察韧带组织纤维细胞状态。染色：将切片进行脱蜡，水化，然后使用 苏木精染液染色 ，分化、返蓝步骤同 染色，将返蓝后的切片使用丽春红酸性复红浸染 后使用弱酸清洗，然后进行磷钼酸分化、苯胺蓝染色，最后切片脱水、透明和封片，显微镜下观察胶原纤维状态。基因转录组测序挑选目的基因将用于基因测序的 例 患者骶韧带组织及 例非 患者骶韧带组织（取材标准满足本研究纳入标准，获伦理委员会批准及患者知情同意）交由测序公司，北京天一辉远公司使用 完成质量控制，使用 完成序列到参考序列的定位（版本），使用 完成基因和转录本的表达量统计，使用 完成基因的表达差异分析，数据整理后反馈。通过基因测序数据筛选出显著低表达的目标基因 。免疫组化蛋白印迹（，）检测 、及 蛋白表达将韧带组织从 冰箱中取出，将组织剪碎、研磨并标记，然后进行裂解离心，将离心完成的上清液使用移液枪移至新标记好的 空管内。使用 蛋白测定试剂盒进行蛋白含量测定，将已测浓度的蛋白上清于 水浴箱中变性，持续 ，取出室温冷却后放置于 冰箱中保存。实验前将样本解冻、上样、电泳、转膜，而后置于封闭液中，室温摇床孵育，一抗（抗体稀释比例：为 ，为 ，为 ，为 ，为 ）孵育过夜，二抗（抗体稀释比例为 ）孵育 ，将 膜充分浸润于显影剂中，取出后置于曝光仪中运行程序，保存拍摄的图像，使用 对 图像灰度值进行分析，进行归一化处理后制作柱状图。实时荧光定量聚合酶链式反应（，）检测 、的 转录水平匀浆法处理韧带组织后通过 法提取 ，于 浓度检测仪检测 样品浓度，记录数据。然后进行反转录反应操作，按照试剂配制表格配制 反应体系，样本分别加入 孔板，每个样本至少重复 次，设置对照组，总反应体系为 ，样本放入离心机离心至无气泡上机进行 检测，程序设置：预变性的温度为 ，时间为 ；变性的温度为 ，时间为 ，循环次数为 次；退火温度为 ，时间为 ，溶解曲线使用默认设置。将样本上机检测，等待检测结束后记录数据，引物序列见表 。对数据进行归一化处理后制作柱状图，并对 与 、的 转录水平通过 进行相关性分析。统计学方法数据分析采用 进行，使用卡方检验对计数资料进行比较，以均数 标准差（珋 ）表示计量资料，绘制火山图及柱状图，使用独立样本 检验对两个组间的均数进行比较，进行相关性分析，当 表示差异具有统计学意义。，表 中引物序列 基因正向序列反向序列 结果 子宫韧带组织 及 染色结果将子宫主韧带及骶韧带组织通过 染色后切片置于低倍显微镜下观察，镜下可见对照组子宫主、骶韧带纤维结缔组织排列致密、均匀整齐，呈束状；而 组子宫主、骶韧带的纤维结缔组织断裂、紊乱且结构疏松，组较对照组成纤维细胞数量减少（见图 ）。将子宫主、骶韧带组织进行 染色，染色后肌纤维呈红色、胶原纤维呈蓝绿色，切片置于低倍显微镜下观察，镜下可见对照组胶原纤维深染，整齐连续、粗大且致密，呈波浪状，而 组可见主、骶韧带组织中胶原纤维断裂、细小，疏松且紊乱，数量明显减少（见图 ）。箭头所指为纤维结缔组织图 对照组与 组子宫主韧带及骶韧带组织成纤维细胞及胶原纤维的形态（，）（，）箭头所指为韧带组织的胶原纤维图 对照组与 组主韧带及骶韧带组织胶原纤维的形态（，）（，）骶韧带组织转录组测序结果基因转录组测序所取标本为子宫骶韧带组织，其中正常组 例，组 例，通过火山图分析转录组测序结果，发现有 个显著差异表达的基因，其中 个基因在 组中表达显著上调，个基因在 组中表达显著下调（见图 ），基因的表达差异倍数为 ，调整 值（）为 ，差异具有统计学意义（），而 、基因未在转录组测序结果中检索出差异表达。山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期红色代表上调基因，绿色代表下调基因图 子宫骶韧带组织转录组测序结果分析火山图 法半定量检测 、型胶原蛋白（）及型胶原蛋白（）的表达与对照组比较，组子宫主、骶韧带组织中 、及 的相对表达水平均明显降低，差异具有统计学意义（，见图 ）。法检测 、及 基因 转录水平及其相关性 检测结果显示，组主、骶韧带组织中 、及 基因的 转录水平均降低，差异有统计学意义（，见图 ）。对 转录水平进行相关性分析，与 和 呈正相关（，见图 ）。与对照组比较，图 、及 在子宫主、骶韧带组织中蛋白相对表达水平 ，与对照组比较，图 、基因在主、骶韧带中 相对表达水平 ，图 患者 基因与 、基因转录水平的相关性 讨论 是一种中老年女性常见的妇科疾病，随着人口老龄化的加重其发病率呈现逐年上升的趋势，大约 的女性一生中会发生不同程度的 ，虽然该病不致命，但对医疗系统、女性患者及家庭也将造成严重的负担 。目前认为 是一种多因素疾病，主要原因有年龄、妊娠、激素水平等 ，然而流行病学还无法全面的解释 的发病机制，越来越多的学者研究表明环境因素和遗传因素共同作用促使 的发生发展 。因此，从遗传因素角度研究 的分子发病机制可为临床前或尽早干预 的致病过程提供可能。盆底支持组织的薄弱导致盆底器官移位促使 的发生，其主要由子宫主韧带、子宫骶韧带、盆腔筋膜及肛提肌组成，对子宫及阴道起支撑作用 。盆底支持组织主要由胶原纤维构成，胶原纤维的合成减少或分解增加都将导致盆底支持组织薄弱 ，、型胶原蛋白是胶原纤维的主要组成成分，因此、型胶原蛋白表达水平的下降是脱垂组织的特征性表现 ，另外，、型胶原蛋白表达水平及胶原纤维的显微形态也是我们目前制造 动物模型的公认验证指标 ，。我们通过对 患者子宫主韧带及骶韧带进行 染色、染色并对、型胶原蛋白进行 实验检测蛋白的相对表达，验证了盆底韧带组织在组织学形态和、型胶原蛋白表达与正常韧带组织的差异。胶原纤维的合成是多因子共同协调的结果，与胶原蛋白和弹性蛋白的合成及降解直接相关，是胶原代谢的关键因子，在盆底支持组织的损伤修复过程中发挥关键性作用 ，。可刺激成纤维细胞进行增殖，进而增加胶原蛋白的分泌，但国内外对 较多研究集中在纤维化疾病、瘢痕形成等方面，在 中的研究方面少有报道 ，近期，等 和 等 研究证明 涂层的静电纺丝纤维网在老年大鼠的腹部损伤模型中山西医科大学学报，年 月，第 卷 第 期表现出良好的修复作用，生物相容性好且无网状补片相关并发症，基因表现出显著的胶原修复功能，因此 在组织修复过程中起着不可忽视的作用。我们在转录组测序结果中观察到 在 骶韧带组织中显著低表达，在结缔组织疾病中通过促进纤维化发挥着重要作用 ，另外，基因还参与调节细胞增殖、组织修复、肿瘤发生等的相关基因转录过程 ，既往也有研究证实 基因的下调与动脉瓣脱垂相关 ，也曾有研究发现 可能参与阴道脱垂的发生 ，但未有研究证实其在 患者子宫韧带组织中的表达异常。本研究通过 及 实验发现 、及 在蛋白表达及 转录水平上 组较对照组主、骶韧带均出现显著降低，差异具有统计学意义（），、及 基因同时出现的低表达状态可能促使 发生。我们对 相对表达水平进行相关性分析发现 与 、基因转录水平呈正相关（），可能通过影响 基因通路对胶原代谢途径进行调控。然而，本实验未进行基因通路上下游关系的验证，且并未进行动物实验进一步验证上调 、及 基因是否对盆底脱垂组织有修复作用。在本研究中，我们发现 可能对 、基因和胶原代谢具有正调控作用，进一步研究 与 、的关系，实现在分子水平上调节胶原代谢，可为 的基因治疗打开新的思路。参考文献：，（）：马双玲 、和 在女性压力性尿失禁患者阴道壁组织中的表达及意义 郑州：郑州大学，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：，：，：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，：，：，：，：，（）：，：，（）：，