柴胡皂苷D对脑出血大鼠神经保护作用的机制研究.pdf

论著JClinNeurol.June2023Vol.36.No.3208柴胡皂苷D对脑出血大鼠神经保护作用的机制研究王喜梅，单艳华，徐雅芳，朱岩【摘要】目的诊评价柴胡皂苷D对脑出血大鼠神经元损伤的影响，并初步探讨其作用机制。方法SD大鼠通过尾状核注尾静脉自体血建立大鼠脑出血模型，分为假手术组、模型组、柴胡皂苷D组（8 mg/kg）、Toll样受体4（TLR4）激活剂（RS09）组（2 5g/只）、TLR4抑制剂（TAK-242）组（0.5mg/kg）、柴胡皂苷D+TLR4激活剂组，每组2 0 只。各组干预给药结束后，进行神经功能缺损评分；干-湿重法检测脑含水量；伊文思蓝法检测血-脑屏障通透性；取血肿周围组织,ELISA法检测凝血酶-抗凝血酶（TAT)复合物水平；HE染色及TUNEL染色检测神经元损伤及调亡率；免疫荧光共定位法检测M1型激活小胶质细胞（标记抗体为CD11b）与小胶质细胞（标记抗体为Iba-1）共表达水平；Westernblotting法检测IL-1、IL-6、IL-10、T LR4、髓样分化因子8 8（MyD-88）、核转录因子-kB（NF-k B）、蛋白酶激活受体-1（PAR-1）、B类清道夫受体（CD36）表达水平。结果与假手术组相比，模型组EB含量、脑含水量、神经功能缺损评分、TAT复合物水平均明显升高，CD11b+Iba-1+水平、IL-10、CD 36 表达明显降低,TLR4、M y D-8 8、p-NF-k B/NF-k B、PA R-1蛋白表达明显升高（均P0.05）。阻断TLR4活化及给予柴胡皂苷D干预处理,均可同等程度的改善脑出血大鼠病理症状,M1促炎相关因子IL-6、IL-1表达明显下降，M2型抗炎相关因子IL-10、CD 36 表达明显升高（均P0.05）。T LR4激活剂可明显削弱柴胡皂苷D的上述作用（P0.05）。结论柴胡皂苷D可改善脑出血大鼠脑水肿、神经元炎性损伤调亡等病理症状,且其改善作用可能与阻断TLR4通路介导的小胶质细胞M1型活化有关。【关键词】柴胡皂苷D；脑出血；小胶质细胞M1型活化；Toll样受体4；神经元炎性损伤【中图分类号】R743.3【文献标识码】A【文章编号】10 0 4-16 48(2 0 2 3)0 3-0 2 0 8-0 8Study on the neuroprotective mechanism of saikosaponin D on rats with cerebral hemorrhageWANWANG Xi-mei,SHAN Yan-hua,XU Ya-fang,et al.Department of SICU,Zhumadian Central Hospital,Zhumadian 463000,ChinaAbstract:ObjectiveTo evaluate the effect of Saikosaponin D on neuronal damage in rats with cerebralhemorrhage,and to preliminarily explore its mechanism of action.Methods SD rats were taken,and were injectedwith autologous blood into the tail vein through the caudate nucleus to establish a rat cerebral hemorrhage model,thenthey were divided into sham operation group,model group,saikosaponin D group(8 mg/kg),Toll-like receptor 4(TLR4)activator（RS0 9)g r o u p(2 5 g/mouse),TLR4 inhibitor（T A K-2 42)g r o u p （0.5 mg/k g),Sa i k o s a p o n i nD+TLR4 activator group,with 20 rats in each group.After the intervention and administration of each group,theneurological deficit was scored;the brain water content was detected with dry-wet weight method;the permeability ofthe blood-brain barrier was detected with Evans blue method;the tissue around the hematoma was taken and the levelof thrombin-antithrombin(TAT)complex was detected with ELISA;the neuronal damage and apoptosis rate weredetected with HE staining and TUNEL staining;the co-expression level of M1 activated microglia(labeled antibodywas CD11b)and microglia（l a b e l e d a n t i b o d y w a s Ib a-1)w a s d e t e c t e d w i t h i m m u n o f l u o r e s c e n c e c o-l o c a l i z a t i o nmethod;and the expression levels of IL-1,IL-6,IL-10,TLR4,myeloid differentiation factor 88(MyD-88),nuclear transcription factor-kB（NF-k B),p r o t e a s e a c t i v a t e d r e c e p t o r-1（PA R-1),Cl a s s B s c a v e n g e r r e c e p t o r(CD36)were detected with Western blot.Results Compared with the sham operation group,EB content,brainwater content,neurological deficit score,and TAT complex levels were significantly increased in the model group,thelevel of CD11b+Iba-1+and the expression of IL-10 and CD36 were significantly decreased,the protein expressionsof TLR4,MyD-88,p-NF-kB/NF-kB and PAR-1 were significantly increased(all P 0.05).Blocking TLR4activation and giving saikosaponin D intervention treatment could all improve the pathological symptoms of cerebralhemorrhage rats to the same extent,the expression of M1 pro-inflammatory related factors IL-6 and IL-1 decreased,the expression of M2-type anti-inflammatory related factors IL-10 and CD36 increased(all P0.05).TLR4 activatorcould significantly weaken the above-mentioned effects of saikosaponin D(P 0.05).ConclusionSaikosaponin D作者单位：46 30 0 0 驻马店市中心医院综合重症医学科209.临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期can improve the pathological symptoms of cerebral hemorrhage rats,such as cerebral edema,neuronal inflammatorydamage and apoptosis,and its improvement effect may be related to the blocking the M1 type activation of microgliamediated by the TLR4 pathway.Key words:Saikosaponin D;cerebral hemorrhage;microglia M1 type activation;Toll-like receptor 4;neuronal inflammatory damage脑出血是神经内科的常见疾病,具有较高的致死率及致残率1。脑出血后神经损伤机制复杂，目前研究2 发现,脑出血后血肿成分如凝血酶、纤维蛋白、亚铁血红素等刺激小胶质细胞活化，介导的炎症反应，是导致神经元损伤及调亡的关键机制之一。Toll样受体4（TLR4）活化可通过髓样分化因子8 8（M y D-8 8）来激活炎症通路-核转录因子-kB(NF-kB）活化释放促炎因子，来加剧炎症反应的产生，且TLR4/MyD-88/NF-kB反应活化参与小胶质细胞向M1型极化介导的神经元损伤过程3。预示TLR4/MyD-88/NF-kB通路活化可能是介导脑出血后神经元炎性损伤的关键通路。柴胡皂苷D为柴胡干燥根中提取的三帖皂苷类活性成分,现代药理研究4 发现,其具有抗炎、抗癌及抗肝纤维化等多种药理作用。近来研究5-6 发现，柴胡皂苷D对抑郁症及脑缺血动物神经元损伤有一定的保护作用。预示柴胡皂苷D也可能通过调节炎症通路，发挥抗脑出血后神经元损伤作用。本研究建立大鼠脑出血模型，从TLR4/MyD-88/NF-kB通路方面对此进行探究验证，以期为柴胡皂苷D在脑出血领域的开发应用提供实验依据。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物SD大鼠12 8 只，体重2 2 0 2 40g,清洁级,雄性，购自徐州医科大学,SCXK（苏)2 0 2 0-0011。试验符合3R原则，经本院伦理委员会批准IACUC-01(202003113)。1.1.2常用实验试剂及仪器，柴胡皂苷D（货号：D0163，上海宝曼生物科技有限公司）；TLR4激活剂RS09（货号：HY-P1439，美国MCE公司）；TLR4抑制剂TAK-242（货号：M04333-QRC，北京百奥莱博科技有限公司）；伊文思蓝（EB，货号：SY2400，北京伊塔生物科技有限公司）;凝血酶-抗凝血酶（TAT)复合物ELISA试剂盒（货号：ys423，上海广锐生物科技有限公司）;HE及原位末端标记法（TUNEL）染色液（货号：PH0516，福州飞净生物科技有限公司）；小鼠抗大鼠M1型激活小胶质细胞（标记抗体为CD11b）（货号：ab238658）、兔抗大鼠小胶质细胞（标记抗体为Iba-1）（货号：ab17886）、兔抗大鼠IL-1（货号：ab254360）、兔抗大鼠IL-6（货号：ab259341）、兔抗大鼠IL-10（货号：ab192271）、兔抗大鼠TLR4（货号：ab13867）、兔抗大鼠髓样分化因子8 8（MyD-88）（货号：ab219413）、兔抗大鼠核转录因子-kB（NF-k B）（货号：ab16502）、磷酸化，NF-kB（p-NF-k B）（货号：ab76302）、兔抗大鼠蛋白酶激活受体-1（PAR-1）（货号：ab64646）、兔抗大鼠B类清道夫受体（CD36）（a b 2 52 9 2 3）等多克隆抗体均购自美国abcam公司。1.2方法1.2.1大鼠脑出血模型建立及分组给药取10 0 只大鼠,参照文献7 将大鼠麻醉后,取尾静脉血50 l,暴露颅骨前卤及冠状缝，于右侧尾状核钻孔，并缓缓注入尾静脉血,建立脑出血模型,造模2 h后用Longa评分法对大鼠神经功能缺损行为进行评分，若评分为3分左右，视为造模成功。将造模成功的大鼠随机分为5组：模型组、柴胡皂苷D组、TLR4激活剂组、TLR4抑制剂组、柴胡皂苷D+TLR4激活剂组，每组20只。另取2 0 只大鼠，经右侧尾状核部位注入等量生理盐水，作为假手术组。各组均于造模成功后开始给药，柴胡皂苷D参照文献8 设置剂量8 mg/kg，用生理盐水溶解成浓度为0.8 mg/ml的混悬液，按10 ml/kg的剂量灌胃给药,1次/d；T LR4激活剂及抑制剂参照文献9-10 1用药，经腹腔注射TLR4激活剂RS09（2 5g/只）及TLR4抑制剂TAK-242（0.5m g/k g），1次/d；柴胡皂苷D+TLR4激活剂组灌胃给予柴胡皂苷D的同时，腹腔注射TLR4激活剂RS09进行干预处理。各组大鼠连续给药7 d,试验过程中若大鼠有死亡，则重新造模及干预并补足至2 0 只（本研究模型组及柴胡皂苷D+TLR4激活剂组各死亡2 只,TLR4激活剂组死亡4只）。1.2.2大鼠神经功能缺损评分参照文献1 中Longa五级评分法及Berderson评分法对大鼠神经功能缺损行为进行评分，总分以8 分计，分数越高预示神经功能缺损越严重。1.2.3干-湿重法测脑含水量各组随机取5只大鼠,麻醉后处死，断头取完整脑组织，精密称取湿重后，放置于10 0 烘烤箱内烘烤2 4h称取干重，根据公式：脑组织含水量=（湿重-干重）/湿重10 0%。1.2.4血-脑屏障通透性检测随机取5只大鼠，参J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3210照文献7 经尾静脉注射2%EB,3h后麻醉处死，取脑组织，制备脑组织匀浆液,取脑组织匀浆液上清液，于6 32 nm分光光度计下测定吸光度值，并计算脑组织EB含量，以EB含量变化代表血-脑屏障通透性改变。1.2.5HE及TUNEL染色观察海马神经元损伤及调亡再随机取5只大鼠，麻醉后，生理盐水+4%多聚甲醛，经左心室灌注至全身僵硬后，断头取脑，取右侧尾状核（注射部位）血肿周围约3mm组织，制备成厚度为2 0 m的冰冻切片，随机取相同部位切片，分别按HE及TUNEL染色液说明书方法染色处理后，于显微镜下观察拍照。TUNEL染色切片，随机取5个视野，用Image-ProPlus6.0软件记录分析，每视野下凋亡细胞比例（%）=阳性染色为红棕色细胞/每视野下总细胞10 0%。1.2.6免疫荧光共聚焦法测小胶质细胞M1型极化标记物（CD11b）在Iba-1标记的小胶质细胞中阳性共表达水平取血肿周围组织冰冻切片，曲拉通破膜、羊血清封闭及抗原灭活处理后，加人1：2 0 0 的CD11b（兔抗大鼠）、Iba-1（羊抗大鼠）一抗4孵育过夜，用1：8 0 0 的二抗（山羊抗兔FITC，驴抗兔TRITC)室温孵育1.5h,DAPI核染处理后，于荧光共聚焦显微镜下观察拍照。Image-ProPlus6.0软件计算每视野下CD11b与Iba-1阳性共染色区域面积，以此表示M1型小胶质细胞活性水平。1.2.7ELISA法检测血肿周围组织TAT复合物的水平剩余5只大鼠，麻醉后，经心脏灌流术处死，解剖取血肿周围约3mm组织，机械粉碎制备匀浆液，取适量匀浆液，按ELISA法检测TAT复合物水平。1.2.8Westernblotting法检测血肿周围组织蛋白表达取冰冻血肿周围组织,4解冻，粉碎及匀浆处理后，提取胞浆蛋白,BCA法测蛋白浓度，取10 0 g蛋白样品行电泳、转膜反应，4孵育盒中滴加1:8 0 0的IL-1、IL-6、IL-10、T LR4、M y D-8 8、NF-k B、p-NF-kB、PA R-1、CD 36 一抗及1:10 0 0 的-actin内参抗体孵育过夜，次日滴加HRP山羊抗兔二抗（1:140 0）继续孵育30 min,增强化学发光法显影曝光后,Image-J软件分析计算条带相对灰度值。1.2.9统计学方法使用SPSS22.0软件统计数据，表示符合正态分布的数据，Image-ProPlus6.0软件处理图像;t检验、单因素方差及snk-q检验分析行两组间、多组间及两组间多重比较,P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1柴胡皂苷D对大鼠脑含水量、血-脑屏障通透性、神经功能缺损评分、TAT复合物水平的影响见表1。与假手术组相比,模型组大鼠脑含水量、血-脑屏障通透性、神经功能缺损评分、TAT复合物水平均明显升高（均P0.05）。与模型组相比，柴胡皂苷D组及TLR4抑制剂组大鼠脑含水量、血-脑屏障通透性、神经功能缺损评分、TAT复合物水平均明显降低（均P0.05）;T LR4激活剂组大鼠脑含水量、血-脑屏障通透性、神经功能缺损评分、TAT复合物水平均明显升高（均P0.05）。与柴胡皂苷D组相比,柴胡皂苷D+TLR4激活剂组大鼠脑含水量、血-脑屏障通透性、神经功能缺损评分、TAT复合物水平均明显升高(均P0.05)。表1大鼠脑含水量、血-脑屏障通透性、神经功能缺损评分、TAT复合物水平比较（n=5，x s)血-脑屏障通透性神经功能缺损评分TAT复合物水平组别脑含水量(%）(EB含量,g/g)（芬）(g/g)假手术组76.02 0.7112.07 1.030.11 0.0186.81 11.01模型组80.09 0.74#35.26 3.24#6.03 0.41#116.03 9.99#柴胡皂苷D组77.07 0.74*20.34 2.05*3.33 0.35*89.33 8.01*TLR4抑制剂组77.42 0.52*21.22 2.04*3.42 0.34*89.72 8.14*TLR4激活剂组85.36 0.79*65.44 6.03*7.26 0.73*146.26 11.55*柴胡皂苷D+TLR4激活剂组80.17 0.80436.47 3.2046.07 0.604117.25 9.464注：与假手术组比较*P0.05;与模型组比较*P0.05;与柴胡皂苷D组比较 P0.052.2柴胡皂苷D对大鼠血肿周围组织病理损伤的影响见图1。HE染色可见假手术组大鼠血肿周围组织结构清晰、神经细胞胞体排列规律，胞浆染色；模型组大鼠血肿周围组织细胞核固缩、液化明显，细胞间隙结构紊乱,组织结构疏松、局部出血、炎性细胞浸润及胶质细胞浸润明显。柴胡皂苷D组及TLR4抑制剂组大鼠神经细胞液化、坏死等上述病理损伤均有所改善；TLR4激活剂组大鼠上述病理损伤进一步加重。柴胡皂苷D+TLR4激活剂组大鼠上述病理损伤较柴胡皂苷D组加重。211临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期2.3柴胡皂苷D对大鼠血肿周围组织神经元凋亡的影响见图2。TUNEL染色显示，与假手术组（1.550.14）相比，模型组（2 3.112.12）大鼠神经元凋亡率明显升高（P0.05）。与模型组相比,柴胡皂苷D组(5.0 40.47）及TLR4抑制剂组（5.0 8 0.51）大鼠神经元凋亡率明显降低（P0.05）；T LR4激活剂组（36.133.32）大鼠神经元凋亡率明显升高(P0.05)。与柴胡皂苷D组相比,柴胡皂苷D+TLR4激活剂组（2 4.2 32.30）大鼠神经元凋亡率明显升高（P0.05）DF图1大大鼠血肿周围组织E染色图片A：假手术组；B：模型组；C:柴胡皂苷D组；D：T LR4抑制剂组；E：T LR4激活剂组；F：柴胡皂苷D+TLR4激活剂组。B、F：细胞核固缩、液化严重；C、D：细胞核固缩、液化缓解；E：细胞核固缩、液化最严重（HE染色，2 0 0）BE图2大鼠血肿周围组织TUNEL染色图片A：假手术组；B：模型组；C:柴胡皂苷D组；D：T LR4抑制剂组；E：T LR4激活剂组；F：柴胡皂苷D+TLR4激活剂组。B、F：棕黄色染色严重；C、D：棕黄色染色缓解；E：棕黄色染色最严重（TUNEL染色，40 0）2.4柴胡皂苷D对大鼠血肿周围组织小胶质细胞M1型活化的影响见图3。CD11b标记的小胶质细胞为荧光红色；Iba-1标记的小胶质细胞为荧光绿色。与假手术组相比，模型组（50.0 15.0 0)大鼠血肿周围组织CD11b与Iba-1阳性共表达（CD11b+Iba-1+）水平明显升高（P0.05）。与模型组相比，大鼠CD11b+Iba-1+水平在柴胡皂苷D组（9.440.97)及TLR4抑制剂组（9.7 8 1.0 1）均明显降低（均P0.05）；而TLR4激活剂组（7 9.0 0 7.30）明显升高（P0.05）。与柴胡皂苷D组比较,柴胡皂苷D+TLR4激活剂组(51.354.40)大鼠CD11b+Iba-1+水平明显升高(P0.05）。J Clin Neurol,June 2023,Vol.36,No.3212CD11bIba-1MergeBE图3大鼠血肿周围组织CD11b、Ib a-1免疫荧光染色图A：假手术组；B：模型组；C：柴胡皂苷D组；D：TLR4抑制剂组；E：T LR4激活剂组；F：柴胡皂苷D+TLR4激活剂组。B、F：橙黄色染色（共表达颜色）严重：C.D：橙黄色染色缓解：E：橙黄色染色最严重2.5柴胡皂苷D对大鼠血肿周围组织小胶质细胞M1型促炎及M2型抗炎相关因子表达的影响见图4,表2。与假手术组相比,模型组大鼠血肿周围组织M1促炎相关因子IL-6、IL-1蛋白表达明显升高（均P0.05）、M 2 型抗炎相关因子IL-10、CD 36 蛋白表达明显降低（均P0.05）。与模型组相比,柴胡皂苷D组及TLR4抑制剂组大鼠血肿周围组织IL-6、IL-1蛋白表达明显降低（均P0.05）、IL-10、CD 36 蛋白表达明显升高（均P0.05）;T LR4激活剂组大鼠IL-6、IL-1蛋白表达明显升高（均P0.05）、I L-10、CD 36蛋白表达明显降低（均P0.05）。与柴胡皂苷D组比较，柴胡皂苷D+TLR4激活剂组大鼠IL-6、IL-1213临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期蛋白表达明显升高，IL-10、CD 36 蛋白表达明显降低(均P0.05)。CD3675KDaIL-1020 KDaIL-1630KDaIL-621 KDa-actin42KDaABCDEF图4大鼠血肿周围组织IL-6、IL-1、IL-10、CD 36 蛋白表达免疫印迹图A：假手术组；B：模型组；C：柴胡皂苷D组；D：T LR4抑制剂组；E：T LR4激活剂组；F：柴胡皂苷D+TLR4激活剂组2.6柴胡皂苷D对大鼠血肿周围组织TLR4/MyD-88/NF-kB/PAR-1蛋白表达的影响见图5、表3。与假手术组相比，模型组大鼠血肿周围组织TLR4、MyD-88、p-NF-k B/NF-k B、PA R-1蛋白表达明显升高（均P0.05）。与模型组相比,柴胡皂苷D组及TLR4抑制剂组大鼠上述蛋白表达明显降低（均P0.05）；T LR4激活剂组大鼠上述蛋白表达明显升高（均P0.05）。柴胡皂苷D+TLR4激活剂组大鼠的上述蛋白表达均明显高于柴胡皂苷D组（均P0.05)。PAR-150KDap-NF-KB75KDaNF-kB75KDaMyD-8835KDaTLR466KDa-actin42KDaABCDEF图5大鼠血肿周围组织TLR4、M y D-8 8、p-NF-k B、NF-k B、PAR-1蛋白表达免疫印迹图日A：假手术组；B：模型组；C：柴胡皂苷D组；D：T LR4抑制剂组；E：T LR4激活剂组；F：柴胡皂苷D+TLR4激活剂组表2大鼠血肿周围组织IL-6、I L-1、I L-10、CD 36 蛋白表达比较(n=5，x s)组别IL-6/-actinIL-1/-actinIL-10/-actinCD36/-actin假手术组1.01 0.081.07 0.071.02 0.091.15 0.09模型组1.76 0.14#1.64 0.16#0.49 0.04#0.40 0.04#柴胡皂苷D组1.33 0.13*1.28 0.10*0.96 0.08*0.89 0.08*TLR4抑制剂组1.35 0.12*1.31 0.12*0.97 0.09*0.85 0.07*TLR4激活剂组2.14 0.20*2.33 0.21*0.16 0.01*0.10 0.01*柴胡皂苷D+TLR4激活剂组1.74 0.1941.63 0.1740.51 0.04 40.38 0.03 4注：与假手术组比较#P0.05;与模型组比较*P0.05；与柴胡皂苷D组比较P0.05表3大鼠血肿周围组织TLR4、M y D-8 8、p-NF-k B/NF-k B、PA R-1蛋白表达比较（n=5，x s）组别TLR4/-actinMyD-88/-actinp-NF-kB/NF-kBPAR-1/-actin假手术组1.03 0.071.10 0.091.19 0.131.17 0.09模型组2.06 0.16#1.90 0.15#2.13 0.24#1.81 0.18#柴胡皂苷D组1.57 0.13*1.40 0.13*1.25 0.12*1.36 0.11*TLR4抑制剂组1.50 0.11*1.44 0.12*1.23 0.11*1.30 0.12*TLR4激活剂组2.84 0.22*2.70 0.21*2.98 0.21*2.67 0.22*柴胡皂苷D+TLR4激活剂组2.04 0.20 41.94 0.14 42.17 0.2241.89 0.174注：与假手术组比较P0.05;与模型组比较*P0.05;与柴胡皂苷D组比较 P0.053讨论脑出血是指非外伤性脑实质内出血。脑出血后血肿压迫、血-脑屏障破坏、脑组织水肿等是影响患者恢复的重要原因。脑出血后,血肿周围脑组织中某些物质如凝血酶，不仅可与脑组织中相应配体结合，引起神经细胞凋亡、血-脑屏障通透性改变，导致血管源性脑水肿，还可导致炎细胞浸润而产生局部炎症反214JClinNeurol.June 2023,Vol.36,No.3应,加重脑细胞凋亡和脑水肿1。将血液或者凝血酶于动物脑内定量注射,可引起血-脑屏障改变、炎症反应及脑水肿,而模拟人类脑出血病理症状12 。本研究用大鼠尾静脉自体血注人脑尾状核部位，建立大鼠脑出血模型后发现,大鼠右侧尾状核区血肿周围区域红细胞及炎性细胞浸润明显，血-脑屏障通透性、脑含水量均显著高于假手术组，提示造模成功。另外血肿成分如凝血酶、亚铁血红素等均可刺激小胶质细胞向M1型极化，而释放IL-1、I L-6 等促炎因子，而诱发炎症瀑布反应，导致神经元损伤调亡，引起患者神经系统损伤13。本研究也发现,模型组大鼠脑血肿周围组织TAT复合物含量升高的同时，M1型极化标记抗CD11b阳性表达升高,IL-1、IL-6 等促炎因子、神经元调亡率、神经功能缺损评分均显著升高，进一步表明造模成功。脑出血的治疗非常有限，找到切实有效的药物，抑制脑出血后炎症反应引起的继发性损伤,对促进脑出血患者生存及神经功能修复有重要意义14。柴胡皂D具有较好的抗炎及神经保护作用。研究15 发现，柴胡皂苷D可抑制体外培养的小胶质细胞活化，抑制NF-kB炎症通路表达，发挥抗炎作用。张云等5 发现，柴胡皂苷D可抑制抑郁症大鼠神经元炎性损伤。本研究给予脑出血大鼠一定剂量的柴胡皂苷D干预治疗后,大鼠右侧尾状核区血肿形成减小，血肿周围区域红细胞及炎性细胞浸润减轻,血-脑屏障通透性、脑含水量、血肿周围神经元凋亡率均降低，且TAT降低的同时，M1型极化标记抗体CD11b阳性表达、IL-1、IL-6 等促炎因子表达及神经功能缺损评分也显著降低，证实柴胡皂苷D也可能为治疗脑出血后神经元损伤的潜在药物。脑出血后脑组织神经元炎症反应机制复杂。近来研究16 发现,脑出血后凝血酶除了通过PAR-1 通路激活小胶质细胞活化，介导神经炎性反应外，还通过TLR4/NF-kB通路促进小胶质细胞向M1型极化，参与炎症反应的发生发展。大量研究17 发现，炎症、感染、凋亡、微环境改变及细胞因子刺激细胞引起细胞损伤过程中,TLR4可迅速识别细胞损伤释放的内源性配体，并与MyD-88形成蛋白复合体，诱导炎症开关调控因子NF-kB人核活化，来促进IL-1、I L-6等炎症因子的转录释放而介导炎症瀑布反应的发生。另外,TLR4的活化，还可促进诱导免疫效应细胞-小胶质细胞向M1型促炎表型活化及转录，而进一步促进IL-1、IL-6 等促炎因子释放而加剧炎症损伤18 。Fang等19 发现，抑制TLR4表达，可提高M2型小胶质细胞表型CD36表达,来诱导红细胞在内的炎症细胞受损及调亡，发挥抗炎及促血肿吸收作用，提示干预TLR4表达可能是防治脑出血后小胶质细胞极化及神经炎性损伤的潜在靶标分子。本研究也在脑出血模型组大鼠血肿周围组织中检测到TLR4阳性表达于M1型小胶质细胞中，进一步促进TLR4表达后，大鼠小胶质细胞M1型活化及促炎反应进一步加重，脑出血症状也进一步恶化。反之,给予大鼠TLR4抑制剂,阻断TLR4-MyD-88-NF-kB炎症反应活化后，小胶质细胞M1型活化降低，M2型抗炎表型相关因子IL-10及CD36表达升高,大鼠脑出血病理症状明显减轻，提示干预TLR4表达，可能是阻断M1型小胶质细胞介导的促炎反应活化,防治脑出血后神经损伤的关键机制。柴胡皂苷D组大鼠脑出血症状减轻的同时,TLR4-MyD-88-NF-kB及炎症反应处于抑制状态，小胶质细胞M1型活化降低，M2型活化相关因子IL-10及CD36表达升高，提示柴胡皂苷D改善脑出血病理症状的作用,可能与抑制TLR4表达,降低M1型活化介导的促炎反应，提高M2型活化介导的抗炎反应有关。柴胡皂苷D与TLR4激活剂联合应用后,柴胡皂苷D抑制TLR4表达及改善脑出血病理症状的作用被削弱。综上所述，柴胡皂苷D可改善脑出血大鼠脑水肿、神经元炎性损伤调亡等病理症状，且其改善作用，可能与阻断TLR4通路活化介导的小胶质细胞M1型活化有关。这为阐明柴胡皂苷D治疗脑出血后神经元损伤机制提供一定依据。但脑出血后神经系统损伤机制复杂，需要多个细胞因子、多条途径共同调节，柴胡皂苷D改善脑出血大鼠病理损伤的其他机制，还需进一步探究。参考文献1 Kitamura M,Tateishi Y,Sato S,et al.Lower serum calcium and pre-onset blood pressure elevation in cerebral hemorrhage patients under-going hemodialysis J.Clin Exp Nephrol,2020,24(5):465-473.2马志海.炎症反应在脑出血后继发性脑损伤中作用机制的研究进展J.中国临床神经外科杂志，2 0 2 0,2 5（2）：12 4-12 6.3 Yang CC,Gong SL,Chen XP,et al.Analgecine regulates microgliapolarization in ischemic stroke by inhibiting NF-kB through theTLR4MyD88pathwayJ.Int Immunopharmacol,2021,99:107930.4余刘勤，贾爱梅，宋永砚.柴胡皂苷抗炎、抗氧化和降脂研究进展J.中国动脉硬化杂志，2 0 2 0,2 8（1）：8 7-9 2.5】张云，高博，许海军.柴胡皂苷D基于PI3K/AKT/FoxO1调节神经炎症发挥抗抑郁作用J.实用药物与临床，2 0 2 1,2 4（5）：395-399.6崔玉环,董利平，赵宝民，等.柴胡皂苷d联合黄芩苷对脑缺血再灌注损伤大鼠抗氧化酶的影响J.河北北方学院学报（自然科学版）,2 0 17,33(2):11-14.7周子薇,郑晓梅，先耀，等.虾青素对脑出血大鼠的神经保护作用及机制J.山东医药，2 0 2 0,6 0（2 6）：6-9.修回日期2 0 2 2-0 7-10）（收稿日期2 0 2 2-0 6-2 2上接第2 0 7 页）（收稿日期2 0 2 1-0 9-2 8修回日期2 0 2 1-12-2 0）215.临床神经病学杂志2 0 2 3年第36 卷第3期8 Kim E,Erdos G,Huang SH,et al.Microneedle array delivered re-combinant coronavirus vaccines:immunogenicity and rapid transla-tional developmentJ.EBioMedicine,2020,55:102743.9李治松，韩学敏，曹靖，等.TLR4/NF-kB信号通路在大鼠术后慢性痛形成中的作用：与背根神经节Nav1.7表达的关系J.中华麻醉学杂志，2 0 19,39（6）：7 18-7 2 1.10 Li G,Wang QS,Lin TT,et al.Effect of thrombin injection on cere-bral vascular in rats with subarachnoid hemorrhage J.J Int MedRes,2019,47(7):2819-2831.11】束坤，林涛，刘卓,等.血清MMP-9、蛋白激酶B和Cyt-C联合检测在脑出血大鼠模型中的诊断价值J.疑难病杂志,2 0 19,18(3):297-302.12郑嘉荣,邓剑玲.实验动物脑出血模型的研究进展J.医学综述,2 0 2 0,2 6(5):96 0-96 4.,13 Tschoe C,Bushnell CD,Duncan PW,et al.Neuroinflammation afterintracerebral hemorrhage and potential therapeutic targets J.JStroke,2020,22(1):29-46.14艾池波.脑出血继发性水肿及血肿扩大治疗的临床研究进展示CSF压力正常17 5mmH,0(1mmH,0=0.0098kPa），白细胞计数97 10/L（正常值0 8 10%/L），蛋白轻度升高：0.34g/L（正常值0.0 8 0.32 g/L），CSF细胞学示以淋巴细胞为主的混合细胞学反应。复查腰穿（2 0 2 1-10-0 8）示CSF压力135mmH,0，白细胞计数5410/L，生化正常，细胞学示以淋巴细胞反应为主，可见16%嗜中性粒细胞。余实验室检查未见异常。头颅MR增强扫描（2 0 2 1-0 9-2 9）未见异常。EEG(2021-09-28）示轻度异常，左侧前头部多量3 5Hz慢波发放。自身免疫性脑炎谱(CSF+血清）：阴性。CSF二代测序示人型支原体，特异序列数2，置信度中。阴道分泌物培养示人型支原体。综合以上，初步诊断：（1）人型支原体脑炎；（2)癫痫发作。给予口服左乙拉西坦控制癫痫，甘露醇及甘油果糖脱水降颅压，静脉滴注阿奇霉素抗支原体等治疗。住院14d后，患者自诉症状消失，无发热，CSF常规生化好转，予以出院。嘱院外继续静脉滴注阿奇霉素0.5g,1次/d7d，总疗程共计2 1d。随访至今，患者未诉不适，后续将继续关注患者的病情变化。2讨论人型支原体是生殖道的共生菌，可导致泌尿生殖系统和生殖道外感染，包括新生儿感染、脓毒性关节炎、假体关节感染、CNS感染、感染性心内膜炎和脓肿形成，主要与患者免疫功能低下相关2 。迄今所描述的大多数人型支原体CNS感染中，以脑脓肿为最常见，其次为脑膜炎、脊髓脓肿和硬膜下积脓等，患者通