毕业设计(论文)-浓香型白酒酵母对发酵糟醅中酯含量的影响.doc

宜宾学院2015届毕业设计（论文）

Yibin University

本科生毕业论文（设计）

题 目 浓香型白酒酵母对发酵糟醅中酯含量的影响
院 别 生命科学与食品工程学院
专 业 生物工程
学生姓名 　
学 号 年级 2011
指导教师 　 职称 助理研究员

教务处制表
2015 年 5 月 15 日

摘 要

为探究浓香型白酒酵母对发酵糟醅中主要酯类物质的影响，将24株分离自浓香型白酒酿造诸环节的酵母分别接种到入窖粮糟（固态）及其液态体系中，并分别设立空白对照，发酵结束后检测发酵糟醅中总酯及四大酯的含量。结果显示，固态发酵时，供试的24株酵母中能促进增加发酵糟醅总酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯含量的分别有15株、13株、12株、3株、15株；液态发酵时对应为19株、15株、18株、3株、4株，不同发酵方式下酵母对酯类物质的影响有所不同。供试的24株酵母中，菌株Z8Y-15和G8M-28可应用于浓香型白酒酿造；菌株Z8Y-91和H6Y-22可应用于清香型白酒酿造。此外,这些菌株在其他液体饮料（如：啤酒、果醋）及调味品（如：酱油、食醋）的生产中也具有一定的应用前景。

关键词 浓香型白酒；酵母菌；固态发酵；总酯；影响
1

Abstract

In order to explore the influence of main esters in fermentation distilled grains by the yeast of Luzhou-flavor liquor. 24 strains of yeast who isolated from the Luzhou-flavor liquor environment were respectively inoculated to grains (solid) and it's liquid system, and the blank control been set respectively. After the fermentation, the content of follows and four main kinds of esters in the fermentation distilled grains had been detected. The result showed that in the SSF(solid state fermentation), there were 15 strains, 13 strains, 12 strains, 3 strains and 15 strains of yeast who can increase the follows, ethyl caproate, ethyl acetate, ethyl butyrate and ethyl lactate content respectively. As for 19 strains, 15 strains, 18 strains, 3 strains and 4 strains in the SmF(Submerged Fermentation). The influence of each strain under different fermentation methods on ester content was different. Strain Z8Y-15 and G8M-28 could be used to produce Luzhou-flavor liquor. Strain Z8Y-91 and H6Y-22 could be used to produce Chinese light-style liquor. These strains could be used to produce other liquid beverages (such as beer and fruit vinegar) and spices (such as soy sauce and vinegar) production.

Key words Luzhou-flavor liquor yeasts solid state fermentation follows influence
1

目 录

摘要 I
Abstract II

第1章 绪论 1
1.1 课题背景 1
1.2 相关研究概况 1
1.3 主要研究内容 2
1.3.1 浓香型白酒酵母对酯类物质的影响 2
1.3.2 酵母菌株的筛选 2
第2章 材料与方法 3
2.1 材料 3
2.1.1 供试菌株 3
2.1.2 糟醅与培养基 4
2.1.3 仪器与试剂 4
2.2 方法 4
2.2.1 菌悬液制备 4
2.2.2 接种与发酵 5
2.2.3 样品检测 5
第3章 结果与分析 6
3.1 发酵情况 6
3.2 供试酵母对发酵糟醅中总酯及四大酯含量的影响 6
3.2.1 总酯 8
3.2.2 己酸乙酯 8
3.2.3 乙酸乙酯 9
3.2.4 丁酸乙酯 9
3.2.5 乳酸乙酯 10
第4章 结论与讨论 11
4.1 结论 11
4.2 讨论 11

参考文献 12
致 谢 13

第1章 绪论
1.1 课题背景
浓香型白酒作为中国白酒的主导产品，约占有70 %的市场份额[1]，其酿造是一个由多种微生物参与的固态发酵过程，这些微生物来自原料、曲药、窖泥、空气、工具及人员等酿造环境的方方面面，涵盖了霉菌、细菌（古菌）、酵母菌、放线菌等多种微生物，其中酵母菌在酿造过程中扮演着重要角色，除发酵产生乙醇外，还与多种呈香呈味物质的生成有关[2]。
酯类物质作为浓香型白酒中最主要的香味成分，对形成酒体的典型风格起着决定性作用[3]。1964年，己酸乙酯被确定为浓香型白酒的主体香味成分，其含量居酒体中微量成分之首，与乙酸乙酯、丁酸乙酯、乳酸乙酯一同被称为浓香型白酒中的“四大酯”[4-5]。酿造过程中酵母可通过脂肪酶（酯酶）、醇酰基转移酶、醇脱氢酶等酶类生成酯类物质及其前体[6]。
宜宾作为浓香型白酒主产区之一，拥有千百年的酿酒历史与文化，在长期的生产实践中，传承并改进了浓香型白酒酿造技艺，孕育了独特的浓香型白酒酿造生态因子[7]。在这一特殊环境中，蕴含了许多具有潜在应用价值的微生物，特别是对白酒酿造极为重要的酵母菌。为此，开展关于宜宾浓香型白酒酵母对发酵糟醅中酯类物质影响的研究，不仅能初步了解这些菌株的酿造特点，同时也能筛选出部分具有潜在应用价值的菌株，在一定程度上丰富对浓香型白酒酿造机理研究的数据，为进一步探明浓香型白酒复杂的酿造机理、改进生产工艺、稳定或提高优质白酒产量提供参考。
1.2 相关研究概况
国外对中国白酒酿造微生物及呈香呈味物质的研究相对较少。相关报道也主要集中于对酿酒微生物区系（种类、数量及多样性）、酶种类及活力、酒曲化学成分等的研究[8]。
国内对酿酒微生物的研究始于20世纪30年代初[8]，对产酯酵母的研究则在1964年的陵川试点首先被报道，研究人员在之后的多个试点（及研究）中选育了大量优良菌种，如：1274酵母（可产己酸乙酯、丁酸乙酯、丙酸乙酯，但不产乙酸乙酯）、1312酵母（产酒、产酯能力高，同时酯分解能力也高）等[9]。1990年至今，李国红，许玲，李锐利，李向阳等人对酵母产酯条件及应用进行了研究，但这些研究都仅针对乙酸乙酯[10]。2008年以来，本课题组首次将酵母接种于入窖粮糟并窖外发酵，就酵母对发酵糟醅中己酸乙酯、乙酸乙酯的影响进行了探讨[11-12]。在此基础上，本文将以宜宾浓香型白酒酵母为对象，进一步探讨其对发酵糟醅中总酯及四大酯含量的影响，以更加系统的了解各供试菌株的酿造特性，丰富相关研究数据。
就白酒风味物质分析而言，相关研究受限于检测手段和风味化学技术，尽管现有技术的不断创新尚不能充分解析浓香型白酒中复杂的风味成分，但对酒体中色谱骨架成分的研究已取得了一定成果[5，13]。早期，人们主要通过感官（嗅觉、味觉和视觉等）对酒体风味物质进行初步的认识。随着无机化学分析技术的出现，酒体中的总酸、总酯和杂醇油等成分可以得到测定，并以数值的形式直观的呈现出来。1964年以后，色谱定量检测技术的发展，气相色谱、气相色谱-质谱联用技术、高效液相色谱、顶空-固相微萃取、全二维气相色谱-飞行时间质谱、多维气相色谱-质谱、气相色谱-闻香法等技术相继出现，并应用于对白酒酒体中风味物质的分析[14]；其中气相色谱技术被各科研院所、白酒生产企业广泛的用来分析酒体中主要酯类物质的含量。本文也将利用这一技术检测样品中四大酯的含量，同时结合无机化学分析技术对样品中总酯含量进行分析。
1.3 主要研究内容
1.3.1 浓香型白酒酵母对酯类物质的影响
浓香型白酒酿造环境中，酵母菌不仅分布于酿造工艺的各个环节，而且具有一定的数量优势及种属（分类）多样性，同时在白酒酿造过程中与其他微生物协同完成边糖化边发酵的过程，生成多种风味物质及其前体，对发酵的进行（特别是酯类物质的积累）及原酒品质起着重要作用。
本文将通过接种浓香型白酒酵母于入窖粮糟（固态、液态）的方式，探讨酵母对发酵糟醅总酯及四大酯含量的影响。旨在对供试酵母的酿造特性（酯类物质）有一个初步的认识，同时对其分离来源特点做简要的分析，为浓香型白酒相关机理研究提供基础数据。
1.3.2 酵母菌株的筛选
在浓香型白酒酿造环境的众多酵母中，极有可能蕴含一些发酵特性优异、具有提升发酵糟醅质量的菌株。研究表明，部分酵母菌在酿造过程中除发酵产生乙醇外，还利用自身酶系生成多种风味物质，特别是利用其胞内酶生成己酸乙酯、乙酸乙酯等酯类物质[2]。这类酵母被形象的称为产酯酵母，它们应用于浓香型白酒的生产,能在一定程度上克服白酒香气不足及后味淡薄的缺点，提高浓香型白酒的原酒品质。
为此，本研究将在对发酵糟醅检测结果分析的基础上，根据白酒生产工艺要求，拟筛选得到3～4株具有潜在应用价值的酵母，作下一步研究的对象，并就其可能的应用方向进行探讨。
第2章 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 供试菌株
从浓香型白酒酿造诸环节中分离获得的24株酵母菌，均保存于固态发酵资源利用四川省重点实验室，相关信息见表2-1。
表2-1 供试的24株酵母菌
菌株编号
分离来源
种属
G8M-28
窖房空气
Debaryomyces
H1Y-24
窖泥
Zygosaccharomyces
H4Y-33
糟醅
Wickerhamomyces
H5Y-26
糟醅
Wickerhamomyces
H6Y-19
糟醅
Wickerhamomyces
H6Y-22
糟醅
Zygosaccharomyces
H9Y-16-A
曲房空气
Wickerhamomyces
H9Y-30-2
曲房空气
Debaryomyces
S432Y-42
糟醅
Pichia
S433Y-17
糟醅
Wickerhamomyces
S442Y-9
糟醅
Wickerhamomyces
S532Y-32
糟醅
Debaryomyces
S632Y-20
糟醅
Debaryomyces
S632Y-24
糟醅
Debaryomyces
SZ8Y-2
窖房空气
Trichosporonoides
W8Y-10
窖房空气
Wickerhamomyces
W8Y-18-1
窖房空气
Lodderomyces
W8Y-4
窖房空气
Debaryomyces
Z4Y-31
糟醅
Pichia
Z8Y-15
窖房空气
Pichia
Z8Y-19
窖房空气
Debaryomyces
Z8Y-23
窖房空气
Wickerhamomyces
Z8Y-91
窖房空气
Debaryomyces
Z9Y-91
曲房空气
Lodderomyces
2.1.2 糟醅与培养基
入窖粮糟（糟醅）取自四川宜宾某知名多粮浓香型白酒企业（已添加20 %的曲粉），黄水为同批糟醅上一轮发酵黄水。
培养基为YPD固体（与液体）培养基，配方：1 %酵母膏，2 %蛋白胨，2 %葡萄糖，2 %琼脂粉（不加为液体培养基），1000 mL蒸馏水；灭菌条件：121℃，30 min。
2.1.3 仪器与试剂
实验中使用的主要仪器与设备信息见表2-2。
表2-2 主要仪器与设备
设备名称
型号
生产厂家
电子分析天平
AR2130
德国赛多利斯集团
高温湿热灭菌锅
LDZX-75KBS
中国上海申安医疗器械厂
超净工作台
JJ060387
中国吴江市净化设备总厂
摇床（卧式）
HZQ-QX
中国哈尔滨东联电子技术开发有限公司
冰箱（菌种保藏用）
BCD-213TDA/AX1
海信（北京）电器有限公司
冷冻高速离心机
EPPENDORF 5810R
德国艾本德股份有限公司
旋转蒸发仪
HEIDOIPH HEI-VAPPRECISION
德国HEIDOLPH有限公司
真空泵（旋转蒸发仪用）
WELCH DREFAST ULTRA 2034C-02
中国上海君翼仪器设备有限公司
气相色谱仪
AGILENT 7890A
美国安捷伦科技有限公司
注：气相色谱仪使用色谱柱为郑州谱析（LZP-930：300 mm×0.5 μm×0.25 μm）。
实验中使用的酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、琼脂、酚酞、氢氧化钠、硫酸均为国产分析纯，乙酸正丁酯为色谱纯（优级纯）。
2.2 方法
2.2.1 菌悬液制备
斜面菌种接种至50 mLYPD液体培养基中活化，再转接至YPD固态培养基上，28℃恒温培养至形成单菌落，然后挑取单菌落接种至YPD液体培养基中，28℃恒温扩培2 d。将扩培后的培养液在8000 r/min条件下，低温离心5 min，取沉淀以无菌水洗涤离心3次后，调节菌体浓度为108 个/mL，4℃保存备用。
2.2.2 接种与发酵
固态发酵体系：在浓香型白酒酿造车间，入窖粮糟加1 %（V/V）黄水混匀后，分装入1 L的玻璃坛（每坛0.83 kg），每个玻璃坛接种50 mL菌悬液，充分混匀后封口（封口材料自内向外依次为窖皮泥、坛盖、保鲜膜、牛皮纸）。
液体发酵体系：在浓香型白酒酿造车间，入窖粮糟加1 %（V/V）黄水混匀后，再加入等体积的无菌水混匀，并分装至1 L三角瓶中，每个三角瓶接种50 mL菌悬液，充分混匀后封口（封口材料自内向外依次为橡胶塞、保鲜膜、牛皮纸）。
两种发酵方式均以50 mL无菌水取代菌悬液接种为空白对照，每株菌和空白对照均做3个重复。室温条件下遮光发酵50 d（时间：2014年4月6日至5月26日）。
2.2.3 样品检测
样品总酯含量（以乙酸乙酯计）检测采用中和滴定法（皂化反滴定）[9]。
样品制备，固态发酵体系：在实验室，开坛去窖泥后，无菌条件下混匀全部糟醅，每坛取200 g糟醅加等体积无菌水，利用旋转蒸发仪在150 r/min、150 mbar、80℃恒温水浴条件下蒸馏出100 mL馏分，冷却至室温后，4℃保存备用。液态发酵体系：在无菌条件下，直接混匀全部样品，取400 g进行蒸馏，蒸馏条件及后续操作同固态发酵组。检测时，取馏分50 mL于250 mL三角瓶，滴加2滴酚酞，以0.1 mol/L氢氧化钠溶液中和，再滴加该氢氧化钠溶液25 mL，摇匀后沸水浴回流30 min，冷却后以0.1 mol/L硫酸溶液滴定至终点（微红色刚好消失，且半分钟内颜色无变化），计算总酯含量。
样品中己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯及乳酸乙酯含量检测均采用气相色谱法。样品蒸馏条件同总酯检测样品制备，待馏分冷却至室温后，添加乙酸正丁酯作气相色谱分析的内标物，使其浓度为0.3485 g/L，再装入1.5 mL的气相色谱进样瓶，4℃保存备用。气相色谱检测条件：载气为高纯氮气，柱温50℃（保持3 min），以5 ℃/min 的速率升温至150℃（保持5 min）；以5 ℃/min 的速率升温至190℃（保持5 min），以3 ℃/min 的速率升温至220 ℃（保持10 min）；进样口温度220℃，进样量0.2 μL，分流比20∶1。
第3章 结果与分析
3.1 发酵情况
固态发酵体系，发酵过程中坛底水分缓慢增加，结束时坛底液体高度1 cm左右，糟醅颜色均一为泥黄色，无霉菌污染，具有浓香型白酒典型香味。
液态发酵体系，初期有大量气泡产生，部分糟醅上浮，随着发酵的进行，气泡产生量逐渐减少至零，同时糟醅下沉，去掉密封材料后，可闻见特殊酒味与发酵香。显示本次发酵过程正常。
3.2 供试酵母对发酵糟醅中总酯及四大酯含量的影响
两种发酵方式下供试的24株酵母对发酵糟醅中总酯及四大酯含量的影响见表3-1（固态）与表3-2（液态）。
表3-1 固态发酵时24株酵母对发酵糟醅中总酯及四大酯含量的影响（g/L）
菌株编号
己酸乙酯
乙酸乙酯
丁酸乙酯
乳酸乙酯
总酯
G8M-28
0.14
0.37
0.08
2.94
3.68
H1Y-24
0.16
0.34
0.06
3.70
4.39
H4Y-33
0.16
0.32
0.06
4.35
5.01
H5Y-26
0.14
0.43
0.11
5.87
6.67
H6Y-19
0.17
0.34
0.11
6.48
7.23
H6Y-22
0.14
0.34
0.06
4.07
4.71
H9Y-16-A
0.13
0.34
0.10
5.18
5.87
H9Y-30-2
0.16
0.27
0.09
3.18
3.82
S432Y-42
0.10
0.27
0.08
4.03
4.62
S433Y-17
0.17
0.41
0.08
3.47
4.26
S442Y-9
0.19
0.41
0.08
4.37
5.19
S532Y-32
0.21
0.40
0.08
6.36
7.18
S632Y-20
0.13
0.35
0.13
4.08
4.82
S632Y-24
0.12
0.22
0.07
3.08
3.62
SZ8Y-2
0.15
0.39
0.08
6.07
6.80
W8Y-10
0.08
0.24
0.09
5.18
5.73
W8Y-18-1
0.18
0.43
0.09
5.22
6.08
W8Y-4
0.11
0.35
0.06
5.78
6.41
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表3-1 续表
Z4Y-31
0.17
0.47
0.08
5.32
6.23
Z8Y-15
0.35
0.37
0.05
2.53
3.43
Z8Y-19
0.14
0.46
0.10
4.17
5.02
Z8Y-23
0.12
0.33
0.08
6.63
7.29
Z8Y-91
0.24
0.83
0.05
6.05
8.27
Z9Y-91
0.21
0.77
0.10
9.34
11.52
空白对照
0.14
0.36
0.10
4.14
4.88
表3-2 液态发酵时24株酵母对发酵糟醅中总酯及四大酯含量的影响（g/L）
菌株编号
己酸乙酯
乙酸乙酯
丁酸乙酯
乳酸乙酯
总酯
G8M-28
0.08
6.92
--
0.04
7.18
H1Y-24
0.04
5.22
--
0.02
5.41
H4Y-33
0.03
2.01
--
0.03
2.21
H5Y-26
0.03
1.61
--
0.02
1.83
H6Y-19
0.03
0.67
--
0.01
0.95
H6Y-22
0.06
7.05
--
0.05
7.39
H9Y-16-A
0.05
3.34
--
0.04
3.64
H9Y-30-2
0.04
3.20
--
0.04
3.42
S432Y-42
0.04
3.95
--
0.06
4.21
S433Y-17
0.04
3.94
--
0.07
4.22
S442Y-9
0.04
3.89
--
0.07
4.17
S532Y-32
0.02
3.33
0.06
0.04
3.61
S632Y-20
0.03
0.83
0.20
0.05
1.33
S632Y-24
0.04
3.68
--
0.04
3.90
SZ8Y-2
0.03
4.29
--
0.04
4.48
W8Y-10
0.03
4.71
--
0.04
4.95
W8Y-18-1
0.04
4.27
--
0.03
4.48
W8Y-4
0.05
3.83
--
0.03
4.09
Z4Y-31
0.04
2.79
0.13
0.11
3.17
Z8Y-15
0.04
4.56
--
0.03
4.79
Z8Y-19
0.03
4.94
--
0.04
5.09
Z8Y-23
0.04
4.75
--
0.05
4.99
转下一页
接上一页
表3-2 续表
Z8Y-91
0.03
2.76
--
0.01
2.88
Z9Y-91
0.04
4.33
--
0.04
4.53
空白
0.03
2.86
--
0.05
3.03
注：表3-2（含续表）中“--”表示该项物质含量低于仪器检测阈值。
3.2.1 总酯
由表3-1可知，固态发酵时，空白对照总酯含量4.88 g/L，24株酵母中有15株（占62.50 %）总酯含量高于空白对照，最高达11.52 g/L（Z9Y-91），这显示多数酵母菌株能促进增加发酵糟醅总酯含量，同时也显示了浓香型白酒酿造环境中的酵母对酯类物质积累有重要的影响。
由表3-2可知，液态发酵时，空白对照总酯含量3.03 g/L，24株酵母中有19株（占79.17 %）总酯含量高于空白对照，最高达7.39 g/L（H6Y-22），这显示液态发酵时多数酵母菌株也能促进增加发酵糟醅总酯含量。同时可以看出，在液态发酵时这一酵母菌株数量较固态发酵时多，可能是由于液态发酵时物质分布更加均匀，更有利于生理生化反应的进行，使得更多的菌株能促进增加发酵糟醅总酯含量。
24株酵母中有11株在两种发酵方式下均能促进增加总酯含量，它们分别来自于糟醅（3株）、窖房空气（6株）、曲房空气（2株），其中来自环境空气的酵母菌占72.73 %，显示了环境空气中的酵母对不同的发酵方式有较好的适应性，可能是由于空气具有较好的流动性，酵母菌在生产过程中会分散到各工艺环节，使之能适应多种发酵环境。
3.2.2 己酸乙酯
固态发酵时，多数酵母己酸乙酯含量与空白对照接近（其中4株与之相同），丁酸乙酯含量也有类似现象，这可能与窖池发酵有关，窖池作为以己酸菌、丁酸菌等为代表的厌氧菌群的栖息地[15]，在酿造过程中对己酸、丁酸等酯类物质前体的生成有重要的影响。本文以玻璃材质代替窖池发酵，在一定程度上减少了这些前体物的生成，也就影响了部分酸类与酯类物质的发酵。研究数据显示，24株酵母中己酸乙酯含量高最高为接种菌株Z8Y-15的发酵糟醅（己酸乙酯含量0.35 g/L，是空白对照的2.50倍），该菌株可应用于浓香型白酒酿造，促进增加发酵糟醅己酸乙酯含量，提升酒体窖香。
液态发酵时，24株酵母中除G8M-28（己酸乙酯含量0.08 g/L）外，其余酵母己酸乙酯含量均与空白对照（0.03 g/L）接近。可能是由于产己酸菌群对窖泥有较强的亲和性[16]，同时发酵体系中可能蕴含某种对己酸发酵的生长因子（如氨基苯甲酸和生物素）[17]，在液态发酵时，可能缺乏这种影响因子（或其含量较低），使得产己酸的微生物代谢受到一定的限制，进而出现绝大部分供试酵母己酸乙酯含量与空白对照接近的情况。
3.2.3 乙酸乙酯
固态发酵时，24株酵母中有12株（占50.00 %）乙酸乙酯含量高于空白对照（0.36 g/L），它们分别来自于糟醅（5株）、窖房空气（6株）、曲房空气（1株），其中来自窖房环境（糟醅、窖房空气）的酵母占91.67 %，显示了该环境中的酵母对乙酸乙酯含量有重要的影响。其中菌株Z8Y-91与Z9Y-91乙酸乙酯含量远高于空白对照，分别是空白对照的2.31、2.14倍，显示它们能有效促进增加发酵糟醅乙酸乙酯含量，可应用于清香型白酒酿造，以提升主体香。
液态发酵时，24株酵母中有18株（占75.00 %）乙酸乙酯含量高于空白对照（2.86 g/L），它们分别来自于糟醅（6株）、窖房空气（8株）、曲房空气（3株）以及窖泥（1株），其中窖房环境占77.78 %，进一步显示了这一环境中酵母菌对乙酸乙酯含量有重要的影响。可能是由于，乙醇作为醋酸菌发酵生成乙酸的前体物，其在窖房环境中含量相对较高，使得醋酸菌与酵母在长期的生产中形成了某种互利共惠的代谢关系，进而更有利于乙酸、乙酸乙酯的发酵。该发酵方式下，乙酸乙酯含量最高为接种菌株H6Y-22的发酵糟醅（乙酸乙酯含量为7.05 g/L），该菌株可应用于液态白酒生产以提升乙酸乙酯含量。
3.2.4 丁酸乙酯
固态发酵时，24株酵母中仅有3株（占12.50 %，H5Y-26、H6Y-19和S632Y-20）丁酸乙酯含量高于空白对照，这3株酵母菌来自糟醅，显示了糟醅中的部分酵母对促进增加丁酸乙酯含量有一定作用，可能是由于这些酵母在酿造过程中与丁酸菌之间有某种类似于己酸菌与甲烷菌一样的“种间氢转移”的协同作用，可通过进一步研究来予以论证。这三株酵母则可应用于浓香型白酒酿造以促进增加发酵糟醅丁酸乙酯含量。
液态发酵时，空白对照以及21株（占87.50 %）酵母丁酸乙酯含量低于仪器检测阔值，这显示液态发酵方式不利于体系中丁酸乙酯的发酵。1974年内蒙包头试点时，在对纯丁酸菌发酵的试验中，发现在没有泥的情况下不产丁酸乙酯，而向乙酸乙酯转化[18]，这与该发酵条件下乙酸乙酯含量普遍较高的现象相吻合。能检测到丁酸乙酯含量的3株酵母分别为S532Y-32、Z4Y-31和S632Y-20，这三株菌同样都是来自于糟醅，进一步显示糟醅中部分酵母菌株对丁酸乙酯发酵有重要影响。
3.2.5 乳酸乙酯
固态发酵时，有15株（占62.50 %）酵母乳酸乙酯含量高于空白对照（4.14 g/L），最高为9.34 g/L（Z9Y-91），这15株酵母分别来自于糟醅（6株）、窖房空气（7株）、曲房空气（2株），其中窖房环境占88.67 %，显示窖房环境中的酵母对乳酸乙酯积累有重要影响，这一现象与乙酸乙酯含量的现象相似。可能是由于乙酸乙酯与乳酸乙酯在发酵方式上具有一定的相似性，因为它们大多先由好氧或兼性厌氧微生物在发酵前期生成相应的前体物质乙酸和乳酸，再进一步与乙醇反应而来。24株酵母中，菌株Z8Y-15乳酸乙酯含量最低（2.53 g/L），在3.2.2中提到，其己酸乙酯含量为24株酵母中最高的，因此该菌株应用于浓香型白酒酿造，可以有效调节发酵糟醅中的“己乳比”，提升原酒质量。但考虑到适量乳酸乙酯可平衡白酒风味，使酒体醇厚、谐调[19]。因此，并不能一味追求乳酸乙酯含量的降低，对该酵母菌株的应用仍需进行更多研究。
液态发酵时，多数接种供试酵母的发酵糟醅乳酸乙酯含量接近于空白对照（其中3株与之相同），这与固态发酵时的情况截然不同，显示乳酸乙酯发酵受发酵方式的影响较大。24株酵母中有4株酵母（S432Y-42、S433Y-17、S442Y-9和Z4Y-31）乳酸乙酯含量高于空白对照（0.05 g/L），且这4株酵母均来自糟醅，进一步显示了窖房环境中的酵母对乳酸乙酯积累有重要影响。

第4章 结论与讨论
4.1 结论
1、 供试的24株酵母中分别有15株、19株在固态发酵、液态发酵时能促进增加发酵糟醅总酯含量。有11株能在两种方式下均促进增加发酵糟醅总酯含量，且这些酵母多来自酒厂空气。
2、 供试的24株酵母在两种发酵方式下，多数酵母己酸乙酯含量与空白对照接近。在一定程度上体现了窖池发酵对己酸乙酯有重要影响。
3、 供试的24株酵母中分别有12株、18株在固态发酵、液态发酵时能促进增加发酵糟醅乙酸乙酯含量，且这些酵母多来自窖房环境。
4、 供试的24株酵母在两种发酵方式下，各有3株（均来自糟醅）能促进增加发酵糟醅丁酸乙酯含量。
5、 供试的24株酵母中在固态发酵时有15株能促进增加发酵糟醅乳酸乙酯含量；在液态发酵时，多数酵母发酵糟醅乳酸乙酯含量则与空白对照接近，仅有4株能促进增加发酵糟醅乳酸乙酯含量。
4.2 讨论
研究发现，供试的24株酵母中，菌株Z8Y-15（窖房空气、Pichia属）和菌株G8M-28（窖房空气、Debaryomyces属）具有在浓香型白酒酿造中应用的潜力；菌株Z8Y-91（窖房空气、Debaryomyces属）与菌株H6Y-22（糟醅、Zygosaccharomyces属）具有在清香型白酒中应用的潜力。这些菌株可通过强化大曲生产、窖外生香等方式予以应用，其中菌株Z8Y-15和Z8Y-91更适于固态发酵方式，菌株G8M-28和H6Y-22更适于液态发酵方式。此外这些菌株在其他液体饮料（如：啤酒、果醋）及调味品（如：酱油、食醋）的生产中也具有一定的应用前景。
浓香型白酒酿造的影响因素众多，发酵过程具有不可重复性，为相关研究带来了不小的困难。本文以添加黄水的入窖粮糟为发酵基质，以玻璃坛为发酵载体，采用窖皮泥封窖、室温遮光发酵等方式，尽可能贴近生产实际，并设立三个重复及空白对照，减小实验误差。就供试酵母对发酵糟醅主要酯类物质的影响有了初步的了解，同时简要分析了不同分离来源的酿造特点，在一定程度上丰富了浓香型白酒相关机理研究的数据，并筛选得到4株具有一定应用前景的酵母菌株。但鉴于浓香型白酒酿造的复杂性，要充分了解酵母（不同分离来源）对酯类物质的影响，仍需进行进一步的研究。
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致 谢
本论文的顺利实施离不开游玲老师的精心指导。无论是论文的选题、实验方案的确定、实验工作的实施，还是论文的撰写与审阅，都倾注了游老师大量的心血。游老师以其严谨的科研态度、积极的工作热情、悉心的教导以及对中国白酒酿造技术及其市场发展方向的独到见解，在这四年时间里，不断激励着我，不仅让我学到了专业知识，更培养了我的科研意识与能力。在此，向游老师表示最深切的感谢！同时也特别感谢课题组的王涛老师、王松老师、侯茂老师在实验实施、毕业设计及论文撰写中给予的指导与帮助。
感谢课题组的杜洪、任羽、张迎丰等同学在我开展毕业设计过程中的帮助；同时感谢其他默默的关心和帮助我学习与生活的所有老师、同学以及朋友们，谢谢你们！
感谢父母及家人在20多年里对我一如既往的支持、信任及鼓励，你们既是我坚强的后盾，也是我奋发图强的动力！
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