紫外可见分光光度法专家讲座.pptx

第二章第二章紫外紫外-可见分光光度法可见分光光度法(UltravioletandVisibleSpectrophotometry,UV-Vis)2.1紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱2.2吸收光谱测量吸收光谱测量-Lambert-Beer定律定律2.3紫外紫外-可见光度计仪器组成可见光度计仪器组成2.4分析条件选择分析条件选择2.5UV-Vis分光光度法应用分光光度法应用UV-Vis方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射选择性吸收特征。方法是分子光谱方法，它利用分子对外来辐射选择性吸收特征。UV-Vis包括分子外层电子能级跃迁；光谱区在包括分子外层电子能级跃迁；光谱区在160780nm.UV-Vis主要用于分子定量分析，但紫外光谱主要用于分子定量分析，但紫外光谱(UV)为四大波谱之一，是判定为四大波谱之一，是判定许多化合物，尤其是有机化合物主要定性工具之一。许多化合物，尤其是有机化合物主要定性工具之一。紫外可见分光光度法第1页2.1紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱一、分子吸收光谱形成一、分子吸收光谱形成1.过过程程：运运动动分分子子外外层层电电子子-吸吸收收外外来来辐辐射射-产产生生电电子子能能级级跃迁跃迁-分子吸收谱。分子吸收谱。2.能能级级组组成成：除除了了电电子子能能级级(Electronenergylevel)外外，分分子子吸吸收收能能量量将将伴伴伴伴随随分分子子振振动动和和转转动动，即即同同时时将将发发生生振振动动(Vibration)能能级级和和转转动动(Rotation)能能级级跃跃迁迁！据据量量子子力力学学理理论论，分分子子振振-转转跃跃迁迁也也是是量量子子化化或或者者说将产生非连续谱。所以，分子能量改变说将产生非连续谱。所以，分子能量改变 E为各种形式能量改变总和：为各种形式能量改变总和：其中其中 Ee最大：最大：1-20eV;Ev次之：次之：0.05-1eV;Er最小：最小：0.05eV可可见见，电电子子能能级级间间隔隔比比振振动动能能级级和和转转动动能能级级间间隔隔大大12个个数数量量级级，在在发生电子能级跃迁时，伴有振发生电子能级跃迁时，伴有振-转能级跃迁，形成所谓转能级跃迁，形成所谓带状光谱带状光谱。紫外可见分光光度法第2页不不一一样样物物质质结结构构不不一一样样或或者者说说其其分分子子能能级级能能量量(各各种种能能级级能能量量总总和和)或或能能量量间间隔隔各各异异，所所以以不不一一样样物物质质将将选选择择性性地地吸吸收收不不一一样样波波长长或或能能量量外外来来辐辐射射，这是这是UV-Vis定性分析基础。定性分析基础。定定性性分分析析详详细细做做法法是是让让不不一一样样波波长长光光经经过过待待测测物物，经经待待测测物物吸吸收收后后，测测量量其其对对不不一一样样波波长长光光吸吸收收程程度度(吸吸光光度度A)，以以吸吸光光度度A为为纵纵坐坐标标，辐辐射射波波长长为为横横坐坐标标作作图图，得得到到该该物物质质吸吸收收光光谱谱或或吸吸收收曲曲线线，据据吸吸收收曲曲线线特特征征(峰峰强强度度、位位置置及及数数目等目等)研究分子结构。研究分子结构。紫外可见分光光度法第3页-胡罗卜素胡罗卜素咖啡因咖啡因阿斯匹林阿斯匹林丙酮丙酮几几个个有有机机化化合合物物分分子吸收光谱图。子吸收光谱图。紫外可见分光光度法第4页有机分子能级跃迁有机分子能级跃迁1.可能跃迁类型可能跃迁类型有机分子包含有机分子包含:成键轨道成键轨道、；反键轨道反键轨道*、*非键轨道非键轨道n比如比如H2O分子轨道：分子轨道：CHHOoooo=o=n二、分子吸收光谱跃迁类型二、分子吸收光谱跃迁类型紫外可见分光光度法第5页各轨道能级高低次序：各轨道能级高低次序：n*（分子轨道理论计算结果）（分子轨道理论计算结果）；可能跃迁类型：可能跃迁类型：-*；-*；-*；n-*；-*；n-*紫外可见分光光度法第6页-*：C-H共价键，如共价键，如CH4（125nm）；C-C键，如键，如C2H6(135nm)，处于，处于真空紫外区；真空紫外区；-*和和-*跃跃迁迁：尽尽管管所所需需能能量量比比上上述述-*跃跃迁迁能能量量小小，但但波波长长仍仍处处于于真空紫外区；真空紫外区；n-*：含有孤对电子分子，如含有孤对电子分子，如H2O(167nm)；CH3OH(184nm)；CH3Cl(173nm);CH3I(258nm)；(CH3)2S(229nm)；(CH3)2O(184nm)CH3NH2(215nm)；(CH3)3N(227nm)，可见，大多数波长仍小于可见，大多数波长仍小于200nm，处于近紫外区。，处于近紫外区。以以上上四四种种跃跃迁迁都都与与 成成键键和和反反键键轨轨道道相相关关（-*，-*，-*和和n-*），跃跃迁迁能能量量较较高高，这这些些跃跃迁迁所所产产生生吸吸收收谱谱多多位位于于真真空空紫紫外外区区，因因而而在此不加讨论。在此不加讨论。只只有有-*和和n-*两两种种跃跃迁迁能能量量小小，对对应应波波长长出出现现在在近近紫紫外外区区甚甚至至可可见光区，且对光吸收强烈，是我们研究重点。见光区，且对光吸收强烈，是我们研究重点。紫外可见分光光度法第7页例子：例子：1）乙醛分子在）乙醛分子在160,180,290nm处产生吸收，它们对应电子跃迁类型分别是：处产生吸收，它们对应电子跃迁类型分别是：2）环戊烯（）环戊烯（190nm）、甲醚（）、甲醚（185nm）、三乙胺（）、三乙胺（195nm）分别对应跃迁类型）分别对应跃迁类型是：是：3）一化合物可能是）一化合物可能是=N-CH2-CH2-CH3或或=N-CH2-CH=CH2其紫外吸收光谱为：其紫外吸收光谱为：该化合物是何种化合物？该化合物是何种化合物？170200250171nm/A紫外可见分光光度法第8页2.几个概念：几个概念：生色团生色团（Chromogenesisgroup）：）：分分子子中中含含有有非非键键或或 键键电电子子体体系系，能能吸吸收收特特征征外外来来辐辐射射时时并并引引发发n-*和和-*跃迁，可产生这类跃迁或吸收结构单元，称为生色团。跃迁，可产生这类跃迁或吸收结构单元，称为生色团。助色团助色团（Auxochromousgroup）：含含有有孤孤对对电电子子，可可使使生生色色团团吸吸收收峰峰向向长长波波方方向向移移动动并并提提升升吸吸收收强强度一些官能团，称之为助色团。常见助色团助色次序为：度一些官能团，称之为助色团。常见助色团助色次序为：-F-CH3-Br-OH-OCH3-NH2-NHCH3-NH(CH3)2-NHC6H5 i，测得吸光度比在，测得吸光度比在“单色光单色光”x处测得低，产生负偏离；反之，当处测得低，产生负偏离；反之，当 x i，则产生正偏离。，则产生正偏离。紫外可见分光光度法第18页b）谱谱带带宽宽度度与与狭狭缝缝宽宽度度：“单单色色光光”仅仅是是理理想想情情况况，经经分分光光元元件件色色散散所所得得“单单色色光光”实实际际上上是是有有一一定定波波长长范范围围光光谱谱带带(即即谱谱带带宽宽度度)。单单色色光光“纯纯度度”与与狭缝宽度相关，狭缝越窄，它所包含波长范围越小，单色性越好。狭缝宽度相关，狭缝越窄，它所包含波长范围越小，单色性越好。紫外可见分光光度法第19页2.3紫外紫外-可见光度计仪器组成可见光度计仪器组成紫外紫外-可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。可见光度计仪器由光源、单色器、吸收池和检测器四部分组成。一、光源一、光源对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长改变小。对光源基本要求：足够光强、稳定、连续辐射且强度随波长改变小。1.钨及碘钨灯：钨及碘钨灯：3402500nm，多用在可见光区；，多用在可见光区；2.氢灯和氘灯：氢灯和氘灯：160375nm，多用在紫外区。，多用在紫外区。二、单色器二、单色器(Mnochromator)与与原原子子吸吸收收光光度度仪仪不不一一样样，在在UV-Vis光光度度计计中中，单单色色器器通通常常置置于于吸吸收池前面！收池前面！（可预防强光照射引发吸收池中一些物质分解）（可预防强光照射引发吸收池中一些物质分解）三、吸收池三、吸收池(Cell，Container)：用用于于盛盛放放样样品品。可可用用石石英英或或玻玻璃璃两两种种材材料料制制作作，前前者者适适于于紫紫外外区区和和可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。可见光区；后者只适于可见光区。有些透明有机玻璃亦可用作吸收池。四、检测器：硒光电池、四、检测器：硒光电池、PMT、PDA紫外可见分光光度法第20页二、紫外可见光度计仪器二、紫外可见光度计仪器分分光光光光度度计计分分为为单单波波长长和双波长仪器。和双波长仪器。1.单波长分光光度计单波长分光光度计(a)单光束单光束(b)双光束（空间分隔）双光束（空间分隔）(c)双光束（时间分隔）双光束（时间分隔）(d)特点：特点：(e)双双光光束束方方法法因因光光束束几几乎乎同同时时经经过过样样品品池池和和参参比比池池，所所以以可可消消除除光光源源不不稳稳产生误差。产生误差。紫外可见分光光度法第21页光源光源检测器检测器单色器单色器单色器单色器切光器切光器吸收池吸收池双波长分光光度计示意图双波长分光光度计示意图2.双波长分光度计双波长分光度计经过切光器使两束不一样波长光交替经过吸收池，测得吸光度差经过切光器使两束不一样波长光交替经过吸收池，测得吸光度差 A。AB1和和 AB2分分别别为为在在 1和和 2处处背背景景吸吸收收，当当 1和和 2相相近近时时，背背景景吸吸收收近近似似相相等等。二二式式相相减减，得得这表明，试样溶液浓度与两个波优点吸光度差成正比。这表明，试样溶液浓度与两个波优点吸光度差成正比。特特点点：可可测测多多组组份份试试样样、混混浊浊试试样样、而而且且可可作作成成导导数数光光谱谱、不不需需参参比比液液(消消除除了了因因为为参参比比池不一样和制备空白溶液等产生误差池不一样和制备空白溶液等产生误差)、克服了电源不稳而产生误差，灵敏度高。、克服了电源不稳而产生误差，灵敏度高。紫外可见分光光度法第22页3.分光光度计校正分光光度计校正当当光光度度计计使使用用一一段段时时间间后后其其波波长长和和吸吸光光度度将将出出现现漂漂移移，所所以以需需要要对对其进行校正。其进行校正。波长标度校正：波长标度校正：使使用用镨镨-钕钕玻玻璃璃（可可见见光光区区）和和钬钬玻玻璃璃（紫紫外外光光区区）进进行行校校正正。因因为为二者都有其各自特征吸收峰。二者都有其各自特征吸收峰。吸光度标度校正：吸光度标度校正：采采取取 K2CrO4标标准准液液校校正正（在在25oC时时，于于不不一一样样波波优优点点测测定定0.04000g/LKOH溶溶液液（0.05mol/L）吸吸光光度度A，调调整整光光度度计计使使其其A到到达达教教材材P31中表中表2.1所列吸光度。所列吸光度。紫外可见分光光度法第23页2.4分析条件选择分析条件选择一、仪器测量条件一、仪器测量条件因因为为光光源源不不稳稳定定性性、读读数数不不准准等等带带来来误误差差。当当分分析析高高浓浓度度样样品品时时，误差更大。误差更大。由由L-B定律：定律：微分后得：微分后得：将上两式相比，并将将上两式相比，并将dT和和dc分别换为分别换为 T和和 c，得，得当当相相对对误误差差 c/c最最小小时时，求求得得T=0.368或或A=0.434。即即当当A=0.434时时，吸光度读数误差最小！吸光度读数误差最小！通通常常可可经经过过调调整整溶溶液液浓浓度度或或改改变变光光程程b来来控控制制A读读数数在在0.151.00范范围围内。内。紫外可见分光光度法第24页二、反应条件选择二、反应条件选择1.显色剂选择标准：显色剂选择标准：2.使使配配合合物物吸吸收收系系数数 最最大大、选选择择性性好好、组组成成恒恒定定、配配合合物物稳稳定定、显显色色剂剂吸吸收波长与配合物吸收波长相差大等。收波长与配合物吸收波长相差大等。2.显色剂用量：显色剂用量：配位数与显色剂用量相关；在形成逐层配合物，其用量更要严格控制。配位数与显色剂用量相关；在形成逐层配合物，其用量更要严格控制。3.溶液酸度：配位数和水解等与溶液酸度：配位数和水解等与pH相关。相关。4.显色时间、温度、放置时间等。显色时间、温度、放置时间等。三、参比液选择三、参比液选择1.溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直溶剂参比：试样组成简单、共存组份少（基体干扰少）、显色剂不吸收时，直2.接采取溶剂（多为蒸馏水）为参比；接采取溶剂（多为蒸馏水）为参比；2.试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波优点有吸收时，采取试剂作参比（不试剂参比：当显色剂或其它试剂在测定波优点有吸收时，采取试剂作参比（不加待测物）；加待测物）；3.试样参比：如试样基体在测定波优点有吸收，但不与显色剂反应时，能够试样试样参比：如试样基体在测定波优点有吸收，但不与显色剂反应时，能够试样作参比（不能加显色剂）。作参比（不能加显色剂）。紫外可见分光光度法第25页四、干扰消除四、干扰消除1.控制酸度：控制酸度：配配合合物物稳稳定定性性与与pH相相关关，能能够够经经过过控控制制酸酸度度提提升升反反应应选选择择性性，副副反反应应降降低低，而而主主反反应应进进行行完完全全。如如在在0.5MH2SO4介介质质中中，双双硫硫腙腙与与Hg2+生生成成稳稳定定有有色色配配合合物物，而而与与Pb2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+等离子生成有色物不稳定。等离子生成有色物不稳定。2.选择掩蔽剂选择掩蔽剂3.适当测量波长适当测量波长4.干扰物分离干扰物分离5.导数光谱及双波长技术导数光谱及双波长技术紫外可见分光光度法第26页2.5UV-Vis分光光度法分光光度法应用应用一、定性分析一、定性分析1.制制作作试试样样吸吸收收曲曲线线并并与与标标准准紫外光谱对照；紫外光谱对照；2.利利用用Woodward-Fieser 和和Scott经经验验规规则则求求最最大大吸吸收收波波长。长。即即，当当经经过过其其它它方方法法取取得得一一系系列列可可能能分分子子结结构构式式后后，可可经经过过这这类类规规则则估估算算最最大大吸吸收收波波长并与实测值对比。长并与实测值对比。Woodward-Fieser规则规则紫外可见分光光度法第27页Woodward-Fieser规则估算最大吸收波长几个实例：规则估算最大吸收波长几个实例：四四紫外可见分光光度法第28页二、定量分析二、定量分析1.1.单组份定量方法单组份定量方法1）标准曲线法（略）标准曲线法（略）2）标准对比法：）标准对比法：该该法法是是标标准准曲曲线线法法简简化化，即即只只配配制制一一个个浓浓度度为为cs标标准准溶溶液液，并并测测量量其吸光度，求出吸收系数其吸光度，求出吸收系数k，然后由，然后由Ax=kcx求出求出cx该该法法只只有有在在测测定定浓浓度度范范围围内内恪恪守守L-B定定律律，且且cx与与cs大大致致相相当当初初，才才可得到准确结果。可得到准确结果。紫外可见分光光度法第29页2.2.多组分定量方法多组分定量方法因为吸光度含有加合性，所以能够在同一试样中测定多个组份。因为吸光度含有加合性，所以能够在同一试样中测定多个组份。设设试试样样中中有有两两组组份份X和和Y，将将其其显显色色后后，分分别别绘绘制制吸吸收收曲曲线线，会会出出现现如如图图所所表示三种情况：表示三种情况：图图a)：X,Y组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，能够按两个单一组份处理。组份最大吸收波长不重迭，相互不干扰，能够按两个单一组份处理。图图b)和和c)：X,Y相互干扰，此时可经过解联立方程组求得相互干扰，此时可经过解联立方程组求得X和和Y浓度：浓度：其其中中，X,Y组组份份在在波波长长 1和和 2处处摩摩尔尔吸吸光光系系数数 可可由由已已知知浓浓度度X,Y纯纯溶溶液液测测得得。解上述方程组可求得解上述方程组可求得cx及及cy。紫外可见分光光度法第30页3.3.双波长法双波长法-等吸收点法等吸收点法当混合物吸收曲线重迭时，如右下列图所表示，可利用双波长法来测定。当混合物吸收曲线重迭时，如右下列图所表示，可利用双波长法来测定。详细做法：将详细做法：将a视为干扰组份，现要测定视为干扰组份，现要测定b组份。组份。a)分别绘制各自吸收曲线分别绘制各自吸收曲线a,b；b)画一平行于横轴直线分别交于画一平行于横轴直线分别交于a组份曲线上两点，并与组份曲线上两点，并与b组分相交；组分相交；c)以以交交于于a上上一一点点所所对对应应波波长长 1为为参参比比波波长长，另另一一点点对对应应为为测测量量波波长长 2，并并对对混合液进行测量，得到：混合液进行测量，得到：A1=A1a+A1b+A1sA2=A2a+A2b+A2s若两波优点背景吸收相同，即若两波优点背景吸收相同，即A1s=A2s二式相减，得，二式相减，得，A=(A2a-A1a)+(A2b-A1b)因为因为a组份在两波优点吸光度相等，所以，组份在两波优点吸光度相等，所以，A=(A2b-A1b)=(2b-1b)lcb从中可求出从中可求出cb同理，可求出同理，可求出ca.紫外可见分光光度法第31页4.4.系数倍率法系数倍率法情情况况同同3。但但若若其其中中一一干干扰扰组组份份b在在测测量量波波长长范范围围内内无无吸吸收收峰峰时时，或或者者说说没没有等吸收点时可采取该法。有等吸收点时可采取该法。详细做法：同前法可得到下式，详细做法：同前法可得到下式，A1=A1a+A1bA2=A2a+A2b两式分别乘以常数两式分别乘以常数k1、k2并相减，得到，并相减，得到，S=k2(A2a+A2b)-k1(A1a+A1b)=(k2A2b-k1A1b)+(k2A2a-k1A1a)调整信号放大器，使之满足调整信号放大器，使之满足k2/k1=A1b/A2b，则，则S=(k2A2a-k1A1a)=(k2 2-k1 1)lca所以，差示信号只与所以，差示信号只与ca相关，从而求出相关，从而求出ca。一样可求出。一样可求出cb。紫外可见分光光度法第32页5.5.示差分光光度法示差分光光度法测测量量原原理理：当当试试样样中中组组份份浓浓度度过过大大时时，则则A值值很很大大，会会产产生生读读数数误误差差。此此时时若若以以一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有：一浓度略小于试样组份浓度作参比，则有：详详细细做做法法：以以浓浓度度为为cs标标准准溶溶液液调调T=100%或或A=0（调调零零），所所测测得得试试样样吸吸光光度度实际就是上式中实际就是上式中 A，然后求出，然后求出 c，则试样中该组份浓度为，则试样中该组份浓度为(cs+c)。紫外可见分光光度法第33页6.6.导数光谱法导数光谱法1）定义：将吸光度信号转化为对波长导数信号方法。导数光谱是处理干）定义：将吸光度信号转化为对波长导数信号方法。导数光谱是处理干扰物质与被测物光谱重合，消除胶体等散射影响和背景吸收，提升扰物质与被测物光谱重合，消除胶体等散射影响和背景吸收，提升光谱分辨率一个数据处理技术。光谱分辨率一个数据处理技术。2）原理：）原理：已知已知，对波长求一阶导数，得对波长求一阶导数，得控制仪器使控制仪器使I0在整个波长范围内保持恒定，即在整个波长范围内保持恒定，即dI0/d=0，则，则可见，一阶导数信号与浓度成正比。可见，一阶导数信号与浓度成正比。一样可得到二阶、三阶一样可得到二阶、三阶.n阶导数信号亦与浓度成正比。阶导数信号亦与浓度成正比。紫外可见分光光度法第34页随随导导数数阶阶数数增增加加，峰峰形形越越来来越越尖尖锐锐，因因而而导导数光谱法分辨率高（右图）。数光谱法分辨率高（右图）。吸收峰数为：导数阶数吸收峰数为：导数阶数+1，即，即n+110ppm苯乙醇液苯乙醇液1ppm苯乙醇液苯乙醇液0ppm纯乙醇纯乙醇1ppm苯乙醇溶液，苯乙醇溶液，一阶导数光谱一阶导数光谱基本光谱基本光谱1ppm苯乙醇溶液，苯乙醇溶液，四阶导数光谱四阶导数光谱选选择择性性及及灵灵敏敏度度均均提提高高（苯导数信号）（苯导数信号）紫外可见分光光度法第35页3）导数峰高测量方法）导数峰高测量方法测量方法有三，以下列图：测量方法有三，以下列图：正切法：相邻峰正切法：相邻峰(极大或极小极大或极小)切线中点至相邻峰切线切线中点至相邻峰切线(极小或极大极小或极大)距离距离d；峰谷法：两相邻峰值峰谷法：两相邻峰值(极大或极小极大或极小)间距离间距离p1或或p2；峰零法：极值峰至零线间距离。峰零法：极值峰至零线间距离。紫外可见分光光度法第36页7.7.配合物组成和稳定常数测定配合物组成和稳定常数测定1）摩尔比法）摩尔比法(饱和法饱和法)设配合物显色反应为：设配合物显色反应为：详详细细做做法法：固固定定cM，增增加加cR，并并测测定定一一系系列列MRn吸吸光光度度A，以以cR/cM比比值值对对A作作图图，得如图所表示曲线。其中，曲线拐点处对应值为配合比得如图所表示曲线。其中，曲线拐点处对应值为配合比n。设设MRn电离度为电离度为，则，则紫外可见分光光度法第37页2）等摩尔连续改变法）等摩尔连续改变法(Job法法)详详细细做做法法：保保持持cR+cM=c恒恒定定，但但改改变变cM与与cR相相对对百百分分比比，若若以以cM/c对对吸吸光光度度A作作图图，当当达达最最大大吸吸光光度度时时cM/cR之之比比即即为为配配位位比比。由由两两曲曲线线外外推推交交点点所所对对应应cM/c亦亦可可得得出出配配位位比比。若若比比值值为为0.5，则则配配位位比比n为为1:1；若若比比值值为为0.33，则则配配位位比比n为为1:2或者或者n=(1-cM/c)/(cM/c)设设cM/c=f，则，则该法适于离解度小、配合比低配合物组成测定。该法适于离解度小、配合比低配合物组成测定。00.20.40.60.81.0AAAcM/c紫外可见分光光度法第38页8.8.弱酸离解常数测定弱酸离解常数测定设有一元弱酸设有一元弱酸HB，其离解反应以下：，其离解反应以下：若测出若测出B-和和HB，即可求出，即可求出Ka。测测定定时时，配配制制三三份份不不一一样样pH值值溶溶液液。一一份份为为强强碱碱性性，一一份份为为强强酸酸性性，分分别别在在B-和和HB最最大大吸吸收收波波优优点点测测定定吸吸光光度度，求求出出各各自自摩摩尔尔吸吸光光系系数数。第第三三份份为为已已知知pH值值缓缓冲冲溶溶液液，分分别别在在B-和和HB最最大大吸吸收收波波优优点点测测得得总总吸吸光光度度，解解联联立立方方程程求求得得B-和和HB，然后按前式求出，然后按前式求出pKa或或Ka。紫外可见分光光度法第39页