指纹图谱及高效液相.pptx

指纹图谱文件查阅总结指纹图谱文件查阅总结指纹图谱及高效液相第1页查阅文件名称中药指纹图谱在中药质量控制中应用王乐高效液相色谱数字化定量指纹图谱评价维C银翘片中药组分物质均一性邵艳玲地黄基于HPLC指纹图谱质量评价及种质资源利用研究曹建军人参药材HPLC指纹图谱和高端保健品多维指纹图谱研究苑若瑶六味地黄浓缩丸HPLC指纹图谱研究高新彪黄芎抗栓胶囊指纹图谱研究_冯艺戎高效液相色谱法同时测定黄芎抗栓胶囊中5种大黄成份含量_韩燕全仙鹤草质量控制方法研究_丁蓓蓓指纹图谱及高效液相第2页查阅文件名称用HPLC指纹图谱对复方丹参片信息质量控制研究孙国祥复方丹参片指纹图谱质量评价研究曾令杰高效液相色谱法测定六味地黄浓缩丸特征图谱及4种主要成份含量罗云中药色谱指纹图谱研究及化学计量学方法应用徐小娜青藏高原红景天药材HPLC指纹图谱_李维卫红景天活性成份及药理作用_袁瑜青藏高原红景天药材高效液相色谱指纹图谱研究_吴启勋以上为主要查阅文件，还有一部分为选择性浏览或与以上文件有重复内容故没有全部列出。指纹图谱及高效液相第3页查阅内容总结1.对指纹图谱初步认识及对其在中药学领域应用了解2.依据今后试验方向重点了解高效液相色谱指纹图谱在中药学领域应用3.中药材用高效液相色谱法分析时详细操作方法4.高效液相色谱指纹图谱在详细成药质量控制方面应用指纹图谱及高效液相第4页指纹图谱概述中药指纹图谱是一个综合，可量化判定伎俩，它是建立在中药化学成份系统研究基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量真实性、优良性和稳定性。“整体性”和“含糊性”为其显著特点。指纹图谱及高效液相第5页中药指纹图谱研究意义色谱、波谱以及光谱技术是实现指纹图谱对复杂样本质量控制依靠；较于传统质量控制模式，指纹图谱表达是复杂样本整体化学成份完整谱图，即复杂样本内在化学成份整体性。因为中药存在许多次生代谢产物造成中药中各种化学成份组成不确定性，同一品种中药化学指纹图谱会含有含糊性。这二者作为指纹图谱基本属性，它表达不是个体特异性而是同一个中药群体相同性，即中药内“共有特征”，能表达指纹图谱相同性；指纹图谱解析不强调图谱精密计算和完全相同，而是强调图谱准确识别和相同。利用指纹图谱作为中药质量控制技术，并不要求检测出中药中每一组分化学结构，但要求其图谱应含有“指纹”特征，即要求其含有专属性。同时，作为中药质量控制有效方法之一，中药化学特征指纹图谱需含有重现性和可操作性。指纹图谱及高效液相第6页指纹图谱在评价中药质量中作用1.观察指纹图谱整体特征，判别生产前原料真伪，对原料药进行质量控制用以确保其质量稳定。2.可区分药材不一样部位，还可对不一样采摘期药材进行分析，确定最正确生终年限和采收季节。3.指纹图谱能够考查商品药材及成药质量，建立各药材或成药标准指纹图谱，可用于判断药材优劣，区分正品与伪品。也可区分不一样产地药材。指纹图谱及高效液相第7页指纹图谱在评价中药质量中作用4.可追踪制剂中一些化学成份改变，可利用指纹图谱考查中药中一些成份稳定性。5.可检测原料与成品之间及成品批次间质量稳定性。可规范生产工艺确保产品稳定性（对中间体或半成品进行指纹图谱）。指纹图谱技术利用中药特征指纹图谱差异实现中药真伪判别；而利用中药特征指纹图谱主要特征峰含量或百分比实现中药质量有效控制。指纹图谱及高效液相第8页指纹图谱中，各色谱峰所代表物质光吸收曲线不可能相同，而物质含量检测理想条件是取得待测物质光吸收曲线峰值或最大值，所以，固定单波长下准确检测色谱峰所代表各种物质含量是不可能。假如能够取得指纹图谱中个色谱峰代表物质光吸收峰值，就可准确测定这些物质含量，而二极管阵列检测器应用使同时准确测定各种物质含量成为可能。指纹图谱及高效液相第9页中药指纹图谱技术分类（1)色谱法，如薄层色谱(TLC)、气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、高效毛细管电泳(CE)和高速逆流色谱(HSCCC),等；（2)波谱法，如红外光谱(IR)和紫外-可见光谱(U-Vis)、X射线衍射法以及核磁共振谱(NMR)等；（3)色谱联用技术，如气相色谱-质谱联用(GC-MS)和液相色谱-质谱(LC-MS)等；（4)其它方法：电化学法、化学振荡技术、分子生物学方法等。色谱法和色谱-质谱联用技术因其实用性较强而成为众多研究方法中获取中药指纹图谱信息主要伎俩。不一样检测方法会使分析精密度、峰型、保留时间和分离度（即分离出成份多少）有所不一样。指纹图谱及高效液相第10页中药高效液相指纹图谱分析方法中药高效液相指纹图谱分析是以样品间色谱峰图共有峰不一样峰面积和保留时间为对象进行比对分析。分析时大多结合药材，制剂有效成份所在部位以对应溶剂提取该部位有效成份，而有些制剂或药材用一个溶剂不能完全获取全部代表性有效成份时则采取多色谱指纹图谱分析。以不一样溶剂提取取得多个色谱图。指纹图谱及高效液相第11页指纹图谱测定试验步骤1.供试品及对照品制备2色谱条件选择3.方法学考查线性关系考查精密度试验稳定性试验重现性试验（确保相对保留时间RSD1%,相对保留面积RSD3%）加样回收率试验4.指纹图谱建立和共有指纹图谱峰指认指纹图谱及高效液相第12页样品溶液制备选择方法样品溶液制备选择方法1.提取方法选择（冷浸，回流，超声，微波等），需要对试验图谱比较不一样提取液和提取方法对色谱峰影响来选择适当方法,最终还需要对选择溶液制备方法进行优化。2.不一样溶剂提取对色谱峰影响确定溶剂及提取方法后，观察不一样浓度溶剂对色谱峰影响和峰型影响，在确保提取时全部组分峰出现并稳定同时要确保样品溶液与初始流动相性质尽可能保持一致，这么可确保峰多同时畸形峰也少。HPLCHPLC流动相选择流动相选择乙腈-水，甲醇-水，乙腈-磷酸水溶液，乙腈-乙酸水溶液流动相组分溶液浓度对色谱峰影响流动相组分溶液浓度对色谱峰影响在选择流动相体系若酸度较大时，峰型好同时还须考虑色谱仪酸承载能力指纹图谱及高效液相第13页开始方法建立首次HPLC分离很好试验条件色谱柱C18、C8 5m 150.46cm流动相甲醇-水，甲醇-甲酸水（？不太确定）流速1.52.0ml/min 温度3545样品量体积25L 重量100g指纹图谱及高效液相第14页色谱柱冲洗和预平衡：先用纯溶剂冲洗平衡柱子，再使用自己所选取流动相冲柱子。若上次试验中有盐或对离子试剂需要先用含水流动相（试验用流动相）冲洗后再用纯溶剂平衡柱子。预防影响下次试验。惯用溶剂：酸：醋酸，磷酸，三氟乙酸（用于酸性化合物）胺：三乙胺（用于碱性化合物）醋酸、三乙胺（复杂化合物）指纹图谱及高效液相第15页若用硅胶色谱柱应保持流动相PH在3.08.0之间。柱子过夜要冲洗掉盐类和缓冲液，以纯流动相保留。为了防止漏检样品中可能存在化合物,提议用洗脱能力非常强流动相,做第一次预试验,然后按照一定速度(20%)降低强溶剂百分比。指纹图谱及高效液相第16页确定方法有效性在精密度、方法可重复性及样品稳定性分析中由五次进样所得共有峰峰面积和峰保留时间相对标准偏差来确定。由此确定仪器和进样精密度怎样，提取方法，仪器状态，色谱条件是否适用。并确保溶液在要求温度条件下48小时内稳定。指纹图谱及高效液相第17页分析方法评价方式精密度：取样品一定量按试验方法制备样品溶液，二十四小时内连续进样5次，分析仪器及进样精密度。重复性：取5份一样量样品，按试验方法（制备方法及色谱方法）进样分析，测分析方法可重复性。精密度：取同一样品溶液室温下放置，48小时内进样分析五次，分析样品溶液在室温下稳定性。指纹图谱及高效液相第18页图谱峰确实认共有指纹峰起源确认是将复方成药提取液HPLC图分别与其组方中各单味药提取液HPLC图相比较。经过比对各指纹峰保留时间可知特征峰所代表药效成份且确定该峰是那个药材中成份对应峰。复方成药HPLC指纹图谱中，找出一个最大峰（各谱中测得均较稳定）为参考峰(S峰)，计算各色谱峰保留时间和保留峰面积与同一图谱中S峰保留时间和保留峰面积比值，得到相对保留时间和相对峰面积，进行指纹图谱峰标定。指纹图谱及高效液相第19页指纹图谱及高效液相第20页指纹图谱及高效液相第21页指纹图谱及高效液相第22页指纹图谱及高效液相第23页三压力降同一支色谱柱渗透性（压力降）或反压力应该相同。用球形微粒填充色谱柱压力降可用下式估算：P=3000L/（t0dp2）式中P为压力（psi），L为柱长（cm），为流动相粘度（cp），t0为死时间，dp为微粒直径。新色谱柱使用纯溶剂（甲醇、乙氰）冲洗时要统计压力，这是色谱柱很主要指标指纹图谱及高效液相第24页3-4色谱柱问题处理方案在建立HPLC方法时三种主要问题1保留值与分离度发生改变；2谱峰拖尾；3色谱柱寿命短（一）保留值重现性是建立良好HPLC方法主要问题。处理提议以下：与色谱柱相关：1开始时选一支好色谱柱，硅胶基质酸性弱，纯度高，整个应用中都使用同一固定相、粒度及柱尺寸。2预先保留色谱柱，或联络能连续提供同种柱企业。指纹图谱及高效液相第25页用良好流动相条件，包含PH、缓冲溶液种类及浓度、添加剂，尽可能减小硅胶基质“次级作用”。流动相配制方法：20mMol磷酸钠缓冲液：HCN（9：1）9体积磷酸钠缓冲液加1体积HCN溶液混合。脱气方法应一致缓冲溶液配制方法：天平定量称量，定容到一定体积最准。如需控制PH值时应使用酸度计，添加好酸碱。色谱柱冲洗和预平衡：指纹图谱及高效液相第26页正常使用前后色谱柱要强溶剂冲洗参考图5-23，5-24“污物”在柱进口处积聚，柱压高等问题，用纯溶剂（甲醇、乙腈）正冲，反冲。当柱子过“脏”时，正相柱可用甲醇（可加少许水）；反相柱可用异丙醇加甲醇冲洗；96%二氯甲烷+4%甲醇+1%氢氧化铵20倍柱体积25cm柱子大约50ml指纹图谱及高效液相第27页引发色谱柱失效几个原因：1进口滤片或柱床部分堵塞2吸附有样品杂质3柱填充不良4机械及热冲击造成空洞5担体或固定相遭受“化学侵蚀”指纹图谱及高效液相第28页梯度洗脱三梯度洗脱用于初试经过初始梯度洗脱能够预计出样品保留值范围；决定用等度洗脱还是梯度洗脱预计等度洗脱适宜%B或梯度洗脱终止%B了解样品整体情况，防止有早流出或晚流出组分被遗漏。指纹图谱及高效液相第29页