第3章高效液相色谱.pdf

1现代仪器分析现代仪器分析Chapter3 High Performance Liquid Chromatography,HPLCChapter3 High Performance Liquid Chromatography,HPLC第3章高效液相色谱ContentsContents第一节第一节HPLCHPLC的特点及基本理论的特点及基本理论1第二节第二节高效液相色谱法的类型及原理高效液相色谱法的类型及原理2第三节高效液相色谱仪3第四节第四节其他现代分离技术简介其他现代分离技术简介43.1 HPLC的特点及基本理论3.1 HPLC的特点及基本理论2第一节第一节第一节第一节高效液相色谱法的特点及基本理论高效液相色谱法的特点及基本理论高效液相色谱法的特点及基本理论高效液相色谱法的特点及基本理论教学目标1.掌握掌握HPLC基本理论及条件选择基本理论及条件选择2.掌握高效液相色谱法的特点掌握高效液相色谱法的特点3.掌握高效液相色谱法和气相色谱法的区别掌握高效液相色谱法和气相色谱法的区别重点与难点1.高效液相色谱法的特点高效液相色谱法的特点2.HPLC基本理论及条件选择基本理论及条件选择本节基本要求本节基本要求本节基本要求本节基本要求一、液相色谱理论发展简况什么是高效液相色谱法？高效液相色谱法：高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。又称现代液相色谱。现代液相色谱。色谱法的分离原理溶于溶于流动相流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与中的各组分经过固定相时，由于与固定相固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。色层法、层析法。一、液相色谱理论发展简况高效液相色谱法高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为。又因分析速度快而称为高速液相色谱法高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称。也称现代液相色谱。现代液相色谱。色谱法最早是由俄国植物学家色谱法最早是由俄国植物学家茨维特茨维特（Tswett）在）在1906年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。3一、液相色谱理论发展简况茨维特实验动画茨维特实验动画二、高效液相色谱的特点“三高三高三高三高”“一快一快一快一快”“一广一广一广一广”高高高高压压压压压力可达压力可达150300 atm。色谱柱每米降压为。色谱柱每米降压为75 atm以上。以上。高高高高效效效效可达可达5000塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100种。种。高灵敏度高灵敏度高灵敏度高灵敏度紫外检测器灵敏度可达紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。同时消耗样品少。快快快快速速速速流速为流速为0.110.0 ml/min。应用范围广应用范围广应用范围广应用范围广可分析可分析80%有机化合物有机化合物例如：例如：分离苯的羟基化合物，分离苯的羟基化合物，7个组分只需个组分只需1min就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约就可完成。对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径，柱径0.9cm，流动相速度为，流动相速度为30cm3h-1，需用，需用20多小时才能分离出多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需种氨基酸；而用高效液相色谱法，只需lh之内即可完成。之内即可完成。三、高效液相色谱和经典LC的区别能不能能不能在线检测在线检测短长短长分析周期分析周期高高低低柱效柱效高压常压高压常压输送流动相的压力输送流动相的压力10m100m固定相粒径固定相粒径26mm13cm柱内径柱内径分离分离+分析分离分析分离方法功能方法功能HPLC经典经典LC项目项目想一想：想一想：想一想：想一想：HPLCHPLC的粒径小，为什么柱效就高？的粒径小，为什么柱效就高？的粒径小，为什么柱效就高？的粒径小，为什么柱效就高？4四、HPLC和GC的区别?相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测?主要差别：分析对象的差别和流动相的差别主要差别：分析对象的差别和流动相的差别1分析对象分析对象GCGC高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测HPLCHPLC溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制,分子量大、分子量大、分子量大、分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测;用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%80%80%80%能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20%20%GCGC组分与流动相无亲和作用，只与固定相作用；组分与流动相无亲和作用，只与固定相作用；组分与流动相无亲和作用，只与固定相作用；组分与流动相无亲和作用，只与固定相作用；HPLCHPLC液体液体液体液体惰性气体惰性气体惰性气体惰性气体2。流动相的区别。流动相的区别流动相极性和流动相极性和流动相极性和流动相极性和pHpH值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性可以增大分离选择性可以增大分离选择性可以增大分离选择性流动相与组分间有亲合作用力流动相与组分间有亲合作用力流动相与组分间有亲合作用力流动相与组分间有亲合作用力,为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素,对对对对分离起很大作用分离起很大作用分离起很大作用分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广流动相种类较多，选择余地广(可为水溶液、有机溶剂、极性可为水溶液、有机溶剂、极性可为水溶液、有机溶剂、极性可为水溶液、有机溶剂、极性/非极性化合物非极性化合物非极性化合物非极性化合物)想一想：想一想：想一想：想一想：GCGC流动相的惰性气体有？常用的净化流动相的惰性气体有？常用的净化流动相的惰性气体有？常用的净化流动相的惰性气体有？常用的净化剂有哪些？剂有哪些？剂有哪些？剂有哪些？四、HPLC和GC的区别3固定相的差别固定相的差别GCGC液体固定相（担体上凃渍高沸点有机物质）液体固定相（担体上凃渍高沸点有机物质）液体固定相（担体上凃渍高沸点有机物质）液体固定相（担体上凃渍高沸点有机物质）HPLCHPLC新型固体吸附剂（多空型硅珠），化学键和固定相等新型固体吸附剂（多空型硅珠），化学键和固定相等新型固体吸附剂（多空型硅珠），化学键和固定相等新型固体吸附剂（多空型硅珠），化学键和固定相等粒度小（粒度小（粒度小（粒度小（310310mm），成本高），成本高），成本高），成本高固体吸附剂固体吸附剂固体吸附剂固体吸附剂(活性炭、氧化铝、分子筛、硅胶等活性炭、氧化铝、分子筛、硅胶等活性炭、氧化铝、分子筛、硅胶等活性炭、氧化铝、分子筛、硅胶等)四、HPLC和GC的区别粗粒度粗粒度(100250m)4操作条件的差别操作条件的差别GCGC：加温：加温：加温：加温室温、高压：室温、高压：室温、高压：室温、高压：HPLCHPLC5五、高效液相色谱基本理论热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论热力学理论：塔板理论平衡理论平衡理论平衡理论平衡理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论动力学理论：速率理论VanderVander方程方程方程方程基础基础基础基础1 1、塔板理论、塔板理论、塔板理论、塔板理论理理nLH/=22212)(16)(54.5)(WtWttnRRR=理effeffnLH/=2212)(54.5)(16WtWtnRReff=0ttkR=Q2)1(kknneff+=理2 2、速率理论（和、速率理论（和、速率理论（和、速率理论（和GCGC比较）比较）比较）比较）五、高效液相色谱基本理论（填充柱）：uCuBAHGC+=（毛细管柱）或uCuBH+=llgsmCCCCCC=+=+=llDdfC2TDLdpA=2dpAgmDDB=22gRDBtB，MTDTDgg或五、高效液相色谱基本理论讨论：讨论：讨论：讨论：1 1）流动相流速对）流动相流速对）流动相流速对）流动相流速对HPLCHPLC板高的影响（与板高的影响（与板高的影响（与板高的影响（与GCGC对比）对比）对比）对比）uCAHHPLC+=：mDB=2QTDm相忽略大低，流动相柱温BTRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu=选择兼顾柱效和分析时间，6五、高效液相色谱基本理论五、高效液相色谱基本理论2)2)涡流扩散项及其影响涡流扩散项及其影响涡流扩散项及其影响涡流扩散项及其影响dpA=2dpA柱效，nHAdp3 3 3 3）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响）传质阻抗项及其影响）（忽略固定相传质阻抗smmssmmCCCCCC+=忽略固定相传质阻抗态流动相的传质阻抗注：只考虑流动相和静uCuCAHHPLCsmm+=：五、高效液相色谱基本理论msmmDdpCC2=mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，但易产生气泡CDTm，柱阻，mDT7五、高效液相色谱基本理论练习：练习：练习：练习：1.HPLC与与GC相比，可忽略纵向扩散项，主要是因为（相比，可忽略纵向扩散项，主要是因为（D）。）。A.柱前压高柱前压高B.流速比流速比GC快快C.流动相粘度小流动相粘度小D.柱温低柱温低2.改善分离度，主要是改变（改善分离度，主要是改变（D）。）。A.流动相的种类流动相的种类B.固定相的种类固定相的种类C.增加流速增加流速D.改变填料的粒度改变填料的粒度六、HPLC法中分离条件的选择1.1.固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择：固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相选粒径小的、分布均匀的球形固定相（dp10m）首选化学键合相，匀浆法装柱首选化学键合相，匀浆法装柱2.2.流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相选粘度小、低流速的流动相甲醇，甲醇，1ml/min 3.3.柱温的选择：柱温的选择：柱温的选择：柱温的选择：选室温选室温选室温选室温25250 0C C左右左右左右左右3.2 HPLC的主要类型及分离原理3.2 HPLC的主要类型及分离原理8上一页下一页回目录第二节第二节第二节第二节 高效液相色谱法的类型及原理高效液相色谱法的类型及原理高效液相色谱法的类型及原理高效液相色谱法的类型及原理教学目标1.掌握掌握HPLC的基本类型的基本类型2.掌握掌握HPLC各种类型的分离原理各种类型的分离原理3.掌握掌握HPLC各种类型的流动相和固定相各种类型的流动相和固定相重点与难点1.HPLC的基本类型的基本类型2.HPLC各种类型的分离原理各种类型的分离原理本节基本要求本节基本要求本节基本要求本节基本要求一、液液色谱法（分配色谱）想一想：想一想：想一想：想一想：GCGC的主要类型及原理是什么？的主要类型及原理是什么？的主要类型及原理是什么？的主要类型及原理是什么？1.1.液液色谱（液液色谱（液液色谱（液液色谱（LLCLLC）的分离原理）的分离原理）的分离原理）的分离原理液液色谱（液液色谱（液液色谱（液液色谱（LiquidLiquid-liquid partition liquid partition Chromatography,LLCChromatography,LLC）是利是利是利是利用试样中各组分在流动相、固定相中的溶解度不同，导致各组分用试样中各组分在流动相、固定相中的溶解度不同，导致各组分用试样中各组分在流动相、固定相中的溶解度不同，导致各组分用试样中各组分在流动相、固定相中的溶解度不同，导致各组分分配系数不同，从而实现分离。分配系数不同，从而实现分离。分配系数不同，从而实现分离。分配系数不同，从而实现分离。smCkC=k k越大，说明组分在两项中的浓度差越大，达平衡越大，说明组分在两项中的浓度差越大，达平衡越大，说明组分在两项中的浓度差越大，达平衡越大，说明组分在两项中的浓度差越大，达平衡的时间越长，后流出色谱柱。的时间越长，后流出色谱柱。的时间越长，后流出色谱柱。的时间越长，后流出色谱柱。分析对象：分析对象：分析同系物及含有不同官能团的多组分混合物分析同系物及含有不同官能团的多组分混合物一、液液色谱法（分配色谱）2.2.液液色谱（液液色谱（液液色谱（液液色谱（LLCLLC）的分类）的分类）的分类）的分类非极性组分极非极性极性非极性非极性组分极非极性极性非极性反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱RLLCRLLC极性组分非极非极性非极性极性极性组分非极非极性非极性极性正相色谱正相色谱正相色谱正相色谱NLLCNLLC适用对象适用对象适用对象适用对象出柱顺序出柱顺序出柱顺序出柱顺序样品极性样品极性样品极性样品极性流动相流动相流动相流动相固定相固定相固定相固定相固固固固 定定定定 相：相：相：相：极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；极性固定相（如聚乙二醇、氨基与腈基键合相）；流流流流 动动动动 相：相：相：相：相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常相对非极性的疏水性溶剂（烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。留时间。留时间。留时间。适用对象：适用对象：适用对象：适用对象：常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、常用于分离中等极性和极性较强的化合物（如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）羰基类及氨基酸类等）羰基类及氨基酸类等）羰基类及氨基酸类等）正正正正相相相相色色色色谱谱谱谱9一、液液色谱法（分配色谱）3.3.液液色谱（液液色谱（液液色谱（液液色谱（LLCLLC）的固定相）的固定相）的固定相）的固定相和和和和GCGC凃渍固定相一样，只是粒度小，凃渍固定相一样，只是粒度小，凃渍固定相一样，只是粒度小，凃渍固定相一样，只是粒度小，310310mm，这样有利于减小涡流，这样有利于减小涡流，这样有利于减小涡流，这样有利于减小涡流扩散项的影响，提高柱效能。扩散项的影响，提高柱效能。扩散项的影响，提高柱效能。扩散项的影响，提高柱效能。反相色谱反相色谱反相色谱反相色谱 固固固固 定定定定 相：相：相：相：一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如一般用非极性固定相（如C C1818、C C8 8）；）；）；）；流流流流 动动动动 相：相：相：相：为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用对象：适用对象：适用对象：适用对象：于分离非极性和极性较弱的化合物。于分离非极性和极性较弱的化合物。于分离非极性和极性较弱的化合物。于分离非极性和极性较弱的化合物。一、液液色谱法（分配色谱）（1 1）组成：）组成：）组成：）组成：固定相固定相固定相固定相载体载体载体载体固定液：固定液：固定液：固定液：角鲨烷、角鲨烷、角鲨烷、角鲨烷、,氧二丙睛、聚乙二醇、十八烷氧二丙睛、聚乙二醇、十八烷氧二丙睛、聚乙二醇、十八烷氧二丙睛、聚乙二醇、十八烷全多孔型载体：全多孔型载体：全多孔型载体：全多孔型载体：氧化铝、氧化铝、氧化铝、氧化铝、SiOSiO2 2及硅藻土及硅藻土及硅藻土及硅藻土表面多孔型载体：表面多孔型载体：表面多孔型载体：表面多孔型载体：玻璃微珠、涂多孔硅胶玻璃微珠、涂多孔硅胶玻璃微珠、涂多孔硅胶玻璃微珠、涂多孔硅胶全多孔型离子载体全多孔型离子载体全多孔型离子载体全多孔型离子载体（2 2）固定液的选择原则：）固定液的选择原则：）固定液的选择原则：）固定液的选择原则：分离非极性物质：分离非极性物质：分离非极性物质：分离非极性物质：选择非极性固定液，按照沸点规则出柱，低沸点选择非极性固定液，按照沸点规则出柱，低沸点选择非极性固定液，按照沸点规则出柱，低沸点选择非极性固定液，按照沸点规则出柱，低沸点先出，高沸点后出。先出，高沸点后出。先出，高沸点后出。先出，高沸点后出。分离极性物质：分离极性物质：分离极性物质：分离极性物质：选择极性固定液，极性小的先出，极性大的后出。选择极性固定液，极性小的先出，极性大的后出。选择极性固定液，极性小的先出，极性大的后出。选择极性固定液，极性小的先出，极性大的后出。分离极性分离极性分离极性分离极性+非极性物质：非极性物质：非极性物质：非极性物质：选择极性固定液，非极性先出，极性后出。选择极性固定液，非极性先出，极性后出。选择极性固定液，非极性先出，极性后出。选择极性固定液，非极性先出，极性后出。一、液液色谱法（分配色谱）（3 3）凃渍固定相的缺点：）凃渍固定相的缺点：）凃渍固定相的缺点：）凃渍固定相的缺点：固定液随流动相的不断冲洗而流失，使得柱效能降低，固定液随流动相的不断冲洗而流失，使得柱效能降低，固定液随流动相的不断冲洗而流失，使得柱效能降低，固定液随流动相的不断冲洗而流失，使得柱效能降低，表现为基线漂移。表现为基线漂移。表现为基线漂移。表现为基线漂移。解决办法：解决办法：解决办法：解决办法：分析柱前加一个预饱和柱分析柱前加一个预饱和柱分析柱前加一个预饱和柱分析柱前加一个预饱和柱改用化学键合固定相改用化学键合固定相改用化学键合固定相改用化学键合固定相又称又称又称又称“ODSODS柱柱柱柱”（C18C18柱）柱）柱）柱）10一、液液色谱法（分配色谱）4.4.液液色谱（液液色谱（液液色谱（液液色谱（LLCLLC）的流动相）的流动相）的流动相）的流动相(1)(1)要求要求要求要求：对色谱柱、固定相、分离组分要有惰性对色谱柱、固定相、分离组分要有惰性对色谱柱、固定相、分离组分要有惰性对色谱柱、固定相、分离组分要有惰性对样品有较大的溶解度对样品有较大的溶解度对样品有较大的溶解度对样品有较大的溶解度纯度要高（色谱纯）纯度要高（色谱纯）纯度要高（色谱纯）纯度要高（色谱纯）粘度低、流动性好粘度低、流动性好粘度低、流动性好粘度低、流动性好毒性小、稳定性好毒性小、稳定性好毒性小、稳定性好毒性小、稳定性好与检测器匹配（例如：紫外检测器，流动相要在紫外与检测器匹配（例如：紫外检测器，流动相要在紫外与检测器匹配（例如：紫外检测器，流动相要在紫外与检测器匹配（例如：紫外检测器，流动相要在紫外波长下没有吸收）波长下没有吸收）波长下没有吸收）波长下没有吸收）一、液液色谱法（分配色谱）(2)(2)底剂底剂底剂底剂+洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：洗脱剂：NLLCNLLC：烷烃烷烃烷烃烷烃（正己烷（正己烷（正己烷（正己烷/苯苯苯苯/氯仿）氯仿）氯仿）氯仿）+洗脱剂洗脱剂洗脱剂洗脱剂（极性调整剂：醚、酮、酚、（极性调整剂：醚、酮、酚、（极性调整剂：醚、酮、酚、（极性调整剂：醚、酮、酚、醇等）醇等）醇等）醇等）RLLCRLLC：HH2 2OO+洗脱剂洗脱剂洗脱剂洗脱剂（甲醇、乙腈、（甲醇、乙腈、（甲醇、乙腈、（甲醇、乙腈、THFTHF四氢呋喃等）四氢呋喃等）四氢呋喃等）四氢呋喃等）小知识：小知识：乙腈的毒性是甲醇的乙腈的毒性是甲醇的乙腈的毒性是甲醇的乙腈的毒性是甲醇的5 5倍，是乙醇的倍，是乙醇的倍，是乙醇的倍，是乙醇的2525倍。价格是甲醇的倍。价格是甲醇的倍。价格是甲醇的倍。价格是甲醇的6767倍。倍。倍。倍。反相色谱中，反相色谱中，反相色谱中，反相色谱中，100%100%甲醇的冲洗强度相当于甲醇的冲洗强度相当于甲醇的冲洗强度相当于甲醇的冲洗强度相当于89%89%的乙腈的乙腈的乙腈的乙腈/水或水或水或水或66%66%的四氢呋喃的四氢呋喃的四氢呋喃的四氢呋喃/水的冲洗强度。水的冲洗强度。水的冲洗强度。水的冲洗强度。一、液液色谱法（分配色谱）(3)(3)常用溶剂的极性大小：常用溶剂的极性大小：常用溶剂的极性大小：常用溶剂的极性大小：HH2 2OO甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮甲酰胺乙腈甲醇乙醇丙醇丙酮THFTHF甲乙酮甲乙酮甲乙酮甲乙酮正丁醇正丁醇正丁醇正丁醇 醋酸乙酯醋酸乙酯醋酸乙酯醋酸乙酯 乙醚乙醚乙醚乙醚 二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷二氯甲烷 三氯甲烷三氯甲烷三氯甲烷三氯甲烷 苯苯苯苯 氯氯氯氯丙烷丙烷丙烷丙烷 甲苯甲苯甲苯甲苯 四氯化碳四氯化碳四氯化碳四氯化碳CSCS2 2环己烷环己烷环己烷环己烷 乙烷乙烷乙烷乙烷例：例：例：例：在在在在HPLCHPLC分析中，选用键合十八烷基为固定相，乙腈及水为流分析中，选用键合十八烷基为固定相，乙腈及水为流分析中，选用键合十八烷基为固定相，乙腈及水为流分析中，选用键合十八烷基为固定相，乙腈及水为流动相，判断下列组分的流出顺序，并说明理由。动相，判断下列组分的流出顺序，并说明理由。动相，判断下列组分的流出顺序，并说明理由。动相，判断下列组分的流出顺序，并说明理由。(1)(1)苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸丁酯、苯甲酸乙酯苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸丁酯、苯甲酸乙酯苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸丁酯、苯甲酸乙酯苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯甲酸丁酯、苯甲酸乙酯(2)(2)丙醇、异丁醇、醋酸丁酯丙醇、异丁醇、醋酸丁酯丙醇、异丁醇、醋酸丁酯丙醇、异丁醇、醋酸丁酯11答案：答案：答案：答案：(1)(1)极性大小：极性大小：极性大小：极性大小：A AB B D DC C所以出柱顺序为所以出柱顺序为所以出柱顺序为所以出柱顺序为A AB B D D C C(2)(2)极性大小：极性大小：极性大小：极性大小：A AB BC C所以出柱顺序为所以出柱顺序为所以出柱顺序为所以出柱顺序为A AB B C C解题说明：由题设条件得，该色谱为由题设条件得，该色谱为RLLC；RLLC按照极性非极性的顺序出柱；极性大小：羧基硝基氰基 酯 酰胺胺芳基烷基碳链越长，极性越小按照极性非极性的顺序出柱；极性大小：羧基硝基氰基 酯 酰胺胺芳基烷基碳链越长，极性越小一、液液色谱法（分配色谱）二、液固色谱法（吸附色谱）1.1.液固色谱（液固色谱（液固色谱（液固色谱（LSCLSC）的分离原理）的分离原理）的分离原理）的分离原理液固色谱（液固色谱（液固色谱（液固色谱（LiquidLiquid-Solid Adsorption Solid Adsorption Chromatography,LSCChromatography,LSC）是利是利是利是利用试样中各组分占据固定相表面吸附活性中心的用试样中各组分占据固定相表面吸附活性中心的用试样中各组分占据固定相表面吸附活性中心的用试样中各组分占据固定相表面吸附活性中心的能力不同能力不同能力不同能力不同，从而，从而，从而，从而实现分离。实现分离。实现分离。实现分离。（氢键、静电力、色散力）（氢键、静电力、色散力）（氢键、静电力、色散力）（氢键、静电力、色散力）2.2.液固色谱（液固色谱（液固色谱（液固色谱（LSCLSC）的固定相）的固定相）的固定相）的固定相表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶）表孔硅胶（薄壳硅胶）无定形无定形无定形无定形 YWG 56YWG 56m 5m 510104 4（1 1）硅胶）硅胶）硅胶）硅胶全多孔硅胶全多孔硅胶全多孔硅胶全多孔硅胶球形球形球形球形YQG 34YQG 34m 8m 810108 8堆积硅珠堆积硅珠堆积硅珠堆积硅珠YQG 34 YQG 34 m 8m 810108 8理想理想理想理想原理：吸附原理：吸附原理：吸附原理：吸附适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物适用：分离极性化合物二、液固色谱法（吸附色谱）（2 2 2 2）高分子多孔小球：）高分子多孔小球：）高分子多孔小球：）高分子多孔小球：YSGYSGYSGYSG原理原理原理原理：吸附：吸附：吸附：吸附+分配，蒹小孔凝胶作用分配，蒹小孔凝胶作用分配，蒹小孔凝胶作用分配，蒹小孔凝胶作用特点特点特点特点：柱选择性好，峰形好，柱效低：柱选择性好，峰形好，柱效低：柱选择性好，峰形好，柱效低：柱选择性好，峰形好，柱效低适用适用适用适用：分离弱极性化合物：分离弱极性化合物：分离弱极性化合物：分离弱极性化合物特点：特点：特点：特点：峰易拖尾峰易拖尾峰易拖尾峰易拖尾产生原因产生原因产生原因产生原因：由于硅胶表面有不同活性强度的吸附位，而且，浓由于硅胶表面有不同活性强度的吸附位，而且，浓由于硅胶表面有不同活性强度的吸附位，而且，浓由于硅胶表面有不同活性强度的吸附位，而且，浓度低时，溶质被吸附剂吸附的较为牢靠，浓度高时，吸附作用相对度低时，溶质被吸附剂吸附的较为牢靠，浓度高时，吸附作用相对度低时，溶质被吸附剂吸附的较为牢靠，浓度高时，吸附作用相对度低时，溶质被吸附剂吸附的较为牢靠，浓度高时，吸附作用相对弱，故高浓度组分色谱峰的中心出现较早，而谱峰后半部由于吸附较弱，故高浓度组分色谱峰的中心出现较早，而谱峰后半部由于吸附较弱，故高浓度组分色谱峰的中心出现较早，而谱峰后半部由于吸附较弱，故高浓度组分色谱峰的中心出现较早，而谱峰后半部由于吸附较牢靠而延迟流出，形成拖尾。牢靠而延迟流出，形成拖尾。牢靠而延迟流出，形成拖尾。牢靠而延迟流出，形成拖尾。解决措施：解决措施：解决措施：解决措施：减少进样量减少进样量减少进样量减少进样量产生危害：产生危害：产生危害：产生危害：在计算峰面积时，严重降低分离质量和精度。在计算峰面积时，严重降低分离质量和精度。在计算峰面积时，严重降低分离质量和精度。在计算峰面积时，严重降低分离质量和精度。12二、液固色谱法（吸附色谱）3.3.液固色谱（液固色谱（液固色谱（液固色谱（LSCLSC）的流动相）的流动相）的流动相）的流动相底剂（烷烃）底剂（烷烃）底剂（烷烃）底剂（烷烃）+有机极性调节剂有机极性调节剂有机极性调节剂有机极性调节剂例：正己烷或庚烷例：正己烷或庚烷例：正己烷或庚烷例：正己烷或庚烷+氯仿氯仿氯仿氯仿-4.4.液固色谱（液固色谱（液固色谱（液固色谱（LSCLSC）的出柱顺序）的出柱顺序）的出柱顺序）的出柱顺序强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱强极性组分后出柱，弱极性组分先出柱5.5.硅胶吸收量的变化：硅胶吸收量的变化：硅胶吸收量的变化：硅胶吸收量的变化：硅胶吸水量，硅胶吸水量，硅胶吸水量，硅胶吸水量，LSCLSCLLCLLC硅胶含水量硅胶含水量硅胶含水量硅胶含水量 较较较较 小：吸附色谱小：吸附色谱小：吸附色谱小：吸附色谱硅胶极性较大硅胶极性较大硅胶极性较大硅胶极性较大硅胶含水量硅胶含水量硅胶含水量硅胶含水量17%17%：分配色谱：分配色谱：分配色谱：分配色谱硅胶失活载体硅胶失活载体硅胶失活载体硅胶失活载体吸附的水固定液吸附的水固定液吸附的水固定液吸附的水固定液二、液固色谱法（吸附色谱）)1(0mRVSKtt+=mVSKk=6 6影响影响影响影响k k的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关的因素：与固定相性质和流动相性质有关溶质分子极性，洗脱能力，溶质分子极性，洗脱能力，溶质分子极性，洗脱能力，溶质分子极性，洗脱能力，k k，t tR R溶剂系统极性，洗脱能力，溶剂系统极性，洗脱能力，溶剂系统极性，洗脱能力，溶剂系统极性，洗脱能力，k k，t tR R注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间注：调节溶剂极性，可以控制组分的保留时间分析对象：分析对象：分析对象：分析对象：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性物和异构体有较高选择性物和异构体有较高选择性物和异构体有较高选择性.而对强极性或离子型的样品，有时会发生而对强极性或离子型的样品，有时会发生而对强极性或离子型的样品，有时会发生而对强极性或离子型的样品，有时会发生不可逆吸附，不能得到满意的结果。不可逆吸附，不能得到满意的结果。不可逆吸附，不能得到满意的结果。不可逆吸附，不能得到满意的结果。三、离子交换色谱1.1.离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（IECIEC）的分离原理）的分离原理）的分离原理）的分离原理离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（Ion Exchange Ion Exchange Chromatography,IECChromatography,IEC）是利用样品是利用样品是利用样品是利用样品中的组分离子与树脂上可交换的离子基团进行中的组分离子与树脂上可交换的离子基团进行中的组分离子与树脂上可交换的离子基团进行中的组分离子与树脂上可交换的离子基团进行可逆交换可逆交换可逆交换可逆交换，根据组，根据组，根据组，根据组分对树脂分对树脂分对树脂分对树脂亲和力亲和力亲和力亲和力的不同而得到分离。的不同而得到分离。的不同而得到分离。的不同而得到分离。阳离子交换：阳离子交换：阳离子交换：阳离子交换：R R-SOSO3 3H+MH+M+=R=R-SOSO3 3M +HM +H+阴离子交换：阴离子交换：阴离子交换：阴离子交换：R R-NRNR4 4OH+XOH+X-=R=R-NRNR4 4X+OHX+OH-132.2.离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（IECIEC）的固定相）的固定相）的固定相）的固定相基质基质基质基质+阴（阳）离子交换树脂阴（阳）离子交换树脂阴（阳）离子交换树脂阴（阳）离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂阴离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂阳离子交换树脂强酸性强酸性强酸性强酸性：-SOSO3 3H(H(磺酸基磺酸基磺酸基磺酸基)弱酸性弱酸性弱酸性弱酸性：-COOH(COOH(羧基羧基羧基羧基)强碱性强碱性强碱性强碱性：-N(CHN(CH3 3)3 3+OHOH-(季胺基季胺基季胺基季胺基)弱碱性弱碱性弱碱性弱碱性：-NHNH3 3+OHOH-(伯胺基伯胺基伯胺基伯胺基)三、离子交换色谱3.3.离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（离子交换色谱（IECIEC）的流动相）的流动相）的流动相）的流动相阴离子交换树脂（固定相）阴离子交换树脂（固定相）阴离子交换树脂（固定相）阴离子交换树脂（固定相）阳离子交换树脂（固定相）阳离子交换树脂（固定相）阳离子交换树脂（固定相）阳离子交换树脂（固定相）+酸性水溶液（流动相）酸性水溶液（流动相）酸性水溶液（流动相）酸性水溶液（流动相）+碱性水溶液（流动相）碱性水溶液（流动相）碱性水溶液（流动相）碱性水溶液（流动相）选择的依据：选择的依据：选择的依据：选择的依据：pHpH值：值：值：值：pHpH值值值值，样品正电性，样品正电性，样品正电性，样品正电性离子强度：，洗脱能力，离子强度：，洗脱能力，离子强度：，洗脱能力，离子强度：，洗脱能力，t tR R缓冲溶液类型的选择缓冲溶液类型的选择缓冲溶液类型的选择缓冲溶液类型的选择阳离子交换树脂上，阳离子交换树脂上，阳离子交换树脂上，阳离子交换树脂上，t tR R阴离子交换树脂上，阴离子交换树脂上，阴离子交换树脂上，阴离子交换树脂上，t tR R三、离子交换色谱4.4.分析对象分析对象分析对象分析对象无机离子，可解离的无机化合物，氨基酸，核酸等无机离子，可解离的无机化合物，氨基酸，核酸等无机离子，可解离的无机化合物，氨基酸，核酸等无机离子，可解离的无机化合物，氨基酸，核酸等例如：例如：例如：例如：二战时期，曼哈顿计划（原子弹研发），为了把性质非常相二战时期，曼哈顿计划（原子弹研发），为了把性质非常相二战时期，曼哈顿计划（原子弹研发），为了把性质非常相二战时期，曼哈顿计划（原子弹研发），为了把性质非常相近的近的近的近的稀土阳离子稀土阳离子稀土阳离子稀土阳离子分开，采用的就是离子交换树脂，从而促进了分开，采用的就是离子交换树脂，从而促进了分开，采用的就是离子交换树脂，从而促进了分开，采用的就是离子交换树脂，从而促进了IECIEC的发展。的发展。的发展。的发展。读一读：读一读：读一读：读一读：关于关于关于关于“稀土稀土稀土稀土”的小知识的小知识的小知识的小知识三、离子交换色谱14四、排阻色谱（凝胶色谱）1.1.体积排阻色谱（体积排阻色谱（体积排阻色谱（体积排阻色谱（SECSEC）的分离原理）的分离原理）的分离原理）的分离原理体积排阻色谱（体积排阻色谱（体积排阻色谱（体积排阻色谱（SizeSize-exclusion exclusion Chromatog