LC∕MS原理及基础知识介绍 Waters.pdf

LC/MSLC/MS原理及基础知识介绍原理及基础知识介绍原理及基础知识介绍沃特斯中国有限公司应用部原理及基础知识介绍沃特斯中国有限公司应用部Waters China Ltd.Waters China Ltd.MSMS的历史的历史的历史的历史1910年世界上第一台现代意义质谱仪在英国剑桥Cavendish实验室出现1917年电喷雾(Electrospray)物理现象被发现(并非为了 MS)1918年世界上第一台实际意义质谱仪在美国芝加哥大学实验室出现(扇型磁场MS)1943年世界上第一台商业质谱仪1953年四极杆质量分析器质谱仪1955年飞行时间质量分析器质谱仪1960s 开发GC/MS60s-70s 大气压电离(APcI)源被发现(但并未被广泛应用)70s-80s 开始广泛研究 LC/MS1979年传送带式 LC/MS 接口成为商业产品1982年离子束LC/MS接口出现1984年第一台电喷雾 MS仪宣告诞生1988年电喷雾离子源 MS 首次应用于蛋白质的分析.Waters China Ltd.Waters China Ltd.LC/MSLC/MS中的液相色谱中的液相色谱中的液相色谱中的液相色谱H HighighP PerformanceerformanceL LiquidiquidC Chromatographyhromatography-高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱液质联用的前提和基础=进样+分离根据化合物的化学特性分离样品(比如极性化合物，非极性化合物，酸性化合物，碱性化合物等等)分离技术分离技术分离效率高分离效率高流动相参与分离流动相参与分离连续流出，峰宽有限连续流出，峰宽有限有时需要使用缓冲盐提高分离度有时需要使用缓冲盐提高分离度高压环境工作高压环境工作(1000 psi)Waters China Ltd.Waters China Ltd.LC/MSLC/MS中的质谱中的质谱中的质谱中的质谱MMassassS Spectrometrypectrometry-质谱质谱质谱质谱质量是物质固有特征之一，不同的物质有不同的质量谱分析物被转化为气相离子而被分析这些离子按其质荷比(m/z)被分离而被检测质谱图即是相关的离子流对m/z的图灵敏度高灵敏度高定性定性/定量本领高定量本领高脉冲扫描采集数据脉冲扫描采集数据高真空环境工作高真空环境工作溶剂参与反应溶剂参与反应Waters China Ltd.Waters China Ltd.LC/MS LC/MS 数据形式数据形式数据形式数据形式HO HOOO HO HG a m a b u f o t a lin (III)m/z1001502002503003509110712314517519132379201341402384366M-18M+M-36M-79M-162241TICTIC 色谱TIC 色谱保留时间Waters China Ltd.Waters China Ltd.质谱的种类及相关联用技术质谱的种类及相关联用技术质谱的种类及相关联用技术质谱的种类及相关联用技术GCGCLCLCCEFlow InjProbeCEFlow InjProbePB/EIESIAPCIPB/EIESIAPCITSPFABMALDITSPFABMALDIQuadrupoleQuadrupoleMagnetic SectorTime of FlightIon TrapFT-MSMagnetic SectorTime of FlightIon TrapFT-MSElectron MultiplierElectron MultiplierPhotomultiplierPhotomultiplierMicrochannel PlateMicrochannel PlateTurbo MechanicalTurbo Mechanical离子分离模式离子分离模式质量分析器质量分析器离子检测离子检测数据的采集及处理数据的采集及处理样品的引入模式样品的引入模式溶剂的去除或抽真空方式溶剂的去除或抽真空方式质子化模式质子化模式Waters China Ltd.Waters China Ltd.液质联用系统的常见部件液质联用系统的常见部件液质联用系统的常见部件液质联用系统的常见部件HPLCHPLC离子源离子源分析器分析器检测器检测器数据处理数据处理离子化质子过滤器离子检测器质谱图离子化质子过滤器离子检测器质谱图接口接口色谱分离色谱分离样品引入样品引入数据采集及控制数据采集及控制质量过滤器Waters China Ltd.Waters China Ltd.从从从从LC LC 到到到到 MS MS 的转变的转变的转变的转变物态转变:液态液态液态液态-气态气态气态气态带电状态:“中性中性中性中性”-离子离子离子离子真空变化:760 760 torrtorr-1010-5 5to 10to 10-8 8torrtorrWaters China Ltd.Waters China Ltd.LC/MS LC/MS 系统构成系统构成系统构成系统构成液质联用接口至真空液质联用接口至真空离子源离子源质量分析器质量分析器检测器检测器高真空部分离子源离子源液质联用接口至真空液质联用接口至真空质量分析器质量分析器检测器检测器高真空部分EI电离源样品引入样品引入API电离源样品引入样品引入Waters China Ltd.Waters China Ltd.传统的样品电离方式：传统的样品电离方式：传统的样品电离方式：传统的样品电离方式：EIEI源源源源EI源：电子轰击电离源可得 经典的质谱谱图可查询质谱库，质谱结果可用工业标准谱库检索，是绝对的化合物鉴定相对易得，耐受性好谱图可解析，阐明结构信息但是，电离效率较差，测定的分子量范围、流速范围有限；可测的化合物类型有限M样品进入灯丝集电极离子聚焦透镜样品进入灯丝集电极离子聚焦透镜离子去离子去分析器分析器-挡板挡板+Waters China Ltd.Waters China Ltd.EIEI源源源源LC/MSLC/MS系统：系统：系统：系统：Waters Integrity Waters Integrity 系统系统系统系统Waters China Ltd.Waters China Ltd.Integrity质谱检测器质谱检测器电子轰击电离源电子轰击电离源(EI)离子检测器离子检测器FROM HPLC+涡轮分子泵前级泵前级泵前级泵前级泵第二级 0.1 Torr-灯丝灯丝70 eV四极杆质量分析器四极杆质量分析器离子源离子源225 C第一级 5 Torr热束热束接口接口(动量分离器动量分离器)EI EI 的宝贵的宝贵的宝贵的宝贵遗产遗产遗产遗产HOHOOOHOHGamabufotalin(III)M -18+M+M -36+3414023843669110712314517519179201135M -162+2419110712314517519179201341384366M -18+M+M -36+M -162+241402High Res Mass Spec,Brown,Kamano,Pettit,Org.Mass Spec.,1972Waters Integrity LC/MS System,Pfizer,1996Waters China Ltd.Waters China Ltd.大气压电离技术大气压电离技术大气压电离技术大气压电离技术?电喷雾电离(Electrospray Ionization-ESI)?大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization-APCI)相转化过程Waters China Ltd.Waters China Ltd.什么是电喷雾电离什么是电喷雾电离什么是电喷雾电离什么是电喷雾电离(ESI)ESI)？毛细管+4kV3)离子从液滴表面蒸发出来-+-+-1)含各种离子的液滴-+-+-+-+-2)随着液滴的挥发,电荷密度增大,离子集中到液滴表面+-+-+-+-+-+-Waters China Ltd.Waters China Ltd.什么是什么是什么是什么是APCIAPCI？APCI 电离方式产生离子x xx xx xH H+M M1)1)电离产生起决定作用的溶剂离子电离产生起决定作用的溶剂离子x xx xx xH H+M M2)2)样品分子与反应离子发生反应，样品分子与反应离子发生反应，形成离子簇形成离子簇放电针放电针x xx xM M样品样品 M MMHMH+x xx xx xx xXHXH+x xx xH H+MHMH+3)3)离子去簇后被传输离子去簇后被传输到质谱的质量分析器到质谱的质量分析器毛细管毛细管X=X=溶剂分子，比如溶剂分子，比如H2O,NHH2O,NH3 3等等等等?一般适合分析挥发性化合物，也常分析从中性到极性的化合物一般适合分析挥发性化合物，也常分析从中性到极性的化合物?纯气相离子化过程，只产生极少的添加离子纯气相离子化过程，只产生极少的添加离子?谱图简单谱图简单?流速范围大，从流速范围大，从 0.2 0.2 到到 2.02.0mLmL/min/min，而不用分流而不用分流Waters China Ltd.Waters China Ltd.APIAPI电离源电离源电离源电离源(ESI+)ESI+)电离模式电离模式电离模式电离模式：软电离产生软电离产生软电离产生软电离产生 M+HM+H+准分子离子峰准分子离子峰准分子离子峰准分子离子峰1201401601802002202402602800100%163185M+H+M+Na+M+K+CH3SCH3NOCH3O灭多虫灭多虫MW 162Waters China Ltd.Waters China Ltd.Alliance ZQLC/MS 系统系统Waters China Ltd.Waters China Ltd.Waters ZQ.Waters China Ltd.Waters China Ltd.同一样品的质谱图可能并不一样！同一样品的质谱图可能并不一样！同一样品的质谱图可能并不一样！同一样品的质谱图可能并不一样！Sample Description80859095100105110115120125130135140145150m/z0100%SALICYLAMIDE 1(0.067)Cn(Cen,2,80.00,Ar)Scan ES+1.19e8138.0137.0121.2100.290.188.185.293.995.8114.0110.2102.0133.0123.9138.9143.0149.32-Hydroxybenzamide MW:137 Form:C7H7 NO2 CAS Reg No:65-45-2255075100125150175200225250162839658092120137CONH2OHFigure 1.Wiley Library Reference Spectrum of Salicylamide Waters China Ltd.Waters China Ltd.CIDCID产生的过程产生的过程Analysis of Analysis of SulfamethazineSulfamethazine by by ElectrosprayElectrospray萃取锥孔萃取锥孔10004,0006,0008,000IntensityNHNNCH3CH3NH2SOOSulfamethazine六极杆离子桥六极杆离子桥M+H+2772782792802812822,0004,0006,0008,00010,000000Parent Ion RegionMW 278m/zPositive ion mode,ESI,2 ul/min,50%MeOH:49%H2O:1%HOAc12,00012,10,000取样锥孔取样锥孔3030V V2,000150200250300m/zWaters China Ltd.Waters China Ltd.优异的优异的CIDCID技术技术（可编程）（可编程）Analysis of Analysis of SulfamethazineSulfamethazine by by ElectrosprayElectrospray碰撞诱导解离使碰撞诱导解离使碎片离子在进入碎片离子在进入质谱前就已经产生质谱前就已经产生NHNNCH3CH3NH2SOOSulfamethazine10002,0004,0006,0008,00010,000Intensity六极杆离子桥六极杆离子桥M+H+1831841851861871882,0004,0006,0008,00010,000Fragment Ion RegionMW 186m/zC6H8N3O2S 92156186萃取锥孔萃取锥孔取样锥孔取样锥孔7070V V150200250300m/zWaters China Ltd.Waters China Ltd.多种多种多种多种CIDCIDCIDCID方式：方式：方式：方式：一次进样得到全部质谱信息一次进样得到全部质谱信息一次进样得到全部质谱信息一次进样得到全部质谱信息C4H9-Waters China Ltd.Waters China Ltd.四极杆质量分析器四极杆质量分析器四极杆质量分析器四极杆质量分析器SourceDetectorNonresonantIonResonant Iondc and RfvoltagesWaters China Ltd.Waters China Ltd.LC/MSLC/MS联用中的转变过程联用中的转变过程联用中的转变过程联用中的转变过程液相色谱的现实情况液相色谱的现实情况液相色谱的现实情况液相色谱的现实情况:从高效液相色谱流出的化合物存在于大气压条件下的溶液之中质谱的现实情况质谱的现实情况质谱的现实情况质谱的现实情况:在高真空工作条件下的质谱仅接受气相的离子因此液质联用的接口必须完成:去除溶剂保留样品电离化合物Waters China Ltd.Waters China Ltd.LC/MS LC/MS 面临的挑战面临的挑战面临的挑战面临的挑战进样方式比较对真空泵的要求进样方式比较对真空泵的要求*(liters/sec)毛细管 GC,1mL/min(气体)400微柱 LC,10 L/min5,000填充柱 LC,1 mL/min50,000*为了保持 3 x 10-6torr(4 x 10-6mbar)的真空LC/MS 接口必须使流动的液流达到 MS 可接受的压力(10-5-10-6torr)同时以极小的谱带展宽尽可能多地输送样品到MSWaters China Ltd.Waters China Ltd.接口接口接口接口?EI电离源的液质联用接口-热束接口(TB)?雾化,去溶剂然后电离?ESI和APCI接口-Z Spray?雾化，去溶剂和电离同时完成Waters China Ltd.Waters China Ltd.热束接口原理：喷雾作用和动量分离热束接口原理：喷雾作用和动量分离热束接口原理：喷雾作用和动量分离热束接口原理：喷雾作用和动量分离雾化室动量分离器(第1&2级)Stage 1,压力为压力为5 Torr并且并且90%的溶剂和载气的溶剂和载气(He)被去除被去除Stage 2,压力为压力为1.5 Torr并且剩余的并且剩余的1 0%溶剂和氦气被去除。脱离溶剂的样品离子被加速到达质谱离子源溶剂和氦气被去除。脱离溶剂的样品离子被加速到达质谱离子源(高真空部分高真空部分)Waters China Ltd.Waters China Ltd.API接口：Z-Spray 接口取样锥孔取样锥孔取样锥孔取样锥孔萃取锥孔萃取锥孔萃取锥孔萃取锥孔RFRF六极杆六极杆六极杆六极杆离子桥离子桥离子桥离子桥可清洗的金可清洗的金可清洗的金可清洗的金属挡板属挡板属挡板属挡板毛细管喷口毛细管喷口毛细管喷口毛细管喷口双正交采样技术可避免污染及提高灵敏度双正交采样技术可避免污染及提高灵敏度Waters China Ltd.Waters China Ltd.MKII:LCMSMKII:LCMS接口技术的新突破接口技术的新突破接口技术的新突破接口技术的新突破DiphenhydramineDiphenhydramine in 10mM Phosphate Bufferin 10mM Phosphate BufferInj.#1 Inj#50925Hrs.Waters China Ltd.Waters China Ltd.液质联用技术的应用范围液质联用技术的应用范围液质联用技术的应用范围液质联用技术的应用范围极性分子量GCGCDynamic FABDynamic FABAPcIAPcIElectrospray生物大分子物药离子型共价型0100,000Particle BeamParticle Beam农药，杀虫剂注意座标：不是化合物种类的数量！注意座标：不是化合物种类的数量！为什么使用为什么使用为什么使用为什么使用 LC/MS?LC/MS?Waters China Ltd.Waters China Ltd.为什么使用为什么使用 LC/MS?-广适性检测系统(1)-广适性检测系统(1)Waters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-分析热不稳定化合物分析热不稳定化合物分析热不稳定化合物分析热不稳定化合物(2)(2)分析热不稳定化合物分析气相色谱-质谱无法分析的样品分析大分子量的化合物80%的化合物只能用HPLC 分析？Waters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-丰富的结构信息丰富的结构信息丰富的结构信息丰富的结构信息(3)(3)Symmetry C8 3.0mmx15cm at 0.4 ml/min:Water:ACN gradient;85%to 36%at 45 minutes:PDA scan:220-400 nm:MS scan:50-500 mzMin12141618202224262830124357500600700800695100 200 300 400 500 600 700 800219.0696.7EIHOCH CH O222COCH CH 22NHCONaugardAPIWaters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-极高的灵敏度极高的灵敏度极高的灵敏度极高的灵敏度(4)(4)Waters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-极佳的定量结果极佳的定量结果(5)Q uantify C om pound S um m ary ReportS am ple List:C:M asslynxS hanghai.PRO Sam pleD BShanghaiLast m odified:W ed M ar 11 17:33:54 1998M ethod:C:M asslynxS hanghai.PRO M ethD Bshang1Last m odified:Thu M ar 12 09:45:46 1998Job Code:Printed:Thu M ar 12 11:52:35 1998Com pound 1:U N K N O W N(232)#N am eTypeS td Conc RTA reaResponsepg/ul1B011S tandard 0.507.7205420540.52B012S tandard 1.007.6248024801.03B013S tandard 5.007.6657465745.64B014S tandard 10.007.6111781117810.85B015S tandard 50.007.6455784557849.56B016S tandard 100.007.69478194781104.97B017S tandard 500.007.6439663 439663 493.28B018S tandard 1000.00 7.6887481 887481 997.49B019Blank7.6163316330.110B020S tandard 0.507.6212221220.611B021S tandard 1.007.6230723070.812B022S tandard 5.007.6626962695.313B023S tandard 10.007.6108821088210.514B024S tandard 50.007.6466824668250.815B025S tandard 100.007.69106091060100.816B026S tandard 500.007.6444882 444882 499.117B027S tandard 1000.00 7.6896230 896230 1007.318B028Blank7.6118511850.019B029S tandard 0.507.6186318630.320B030S tandard 1.007.6228922890.821B031S tandard 5.007.6589458944.922B032S tandard 10.007.6108251082510.423B033S tandard 50.007.6443034430348.124B034S tandard 100.007.69193091930101.725B035S tandard 500.007.6442116 442116 496.026B036S tandard 1000.00 7.6888785 888785 998.927B037Blank7.6156815680.0Compound 1 name:UNKNOWN(232)Coefficient of Determination:0.999943Calibration curve:888.194*x+1570.95Response type:External Std,AreaCurve type:Linear,Origin:Exclude,Weighting:1/x,Axis trans:None0.0100.0200.0300.0400.0500.0600.0700.0800.0900.01000.0pg/ul08.96e5ResponseWaters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-进一步增加进一步增加进一步增加进一步增加HPLCHPLC的分离能力的分离能力的分离能力的分离能力(6)(6)如果让您来选择，您满意那一种分离度?很多时候没有时间分离很多时候没有时间分离很多时候无法分离很多时候无法分离Waters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-解决无解决无解决无解决无UVUV吸收样品分析问题吸收样品分析问题吸收样品分析问题吸收样品分析问题(7)(7)LC_MS_OK5.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.00Time0100%0100%TaiyuanLC_MS52:Diode Array 254 1.00Da1.71e6x363.483.78TaiyuanLC_MS51:Scan AP+BPI8.29e45.844.812.912.272.044.007.229.1211.599.9814.8713.1519.1217.4025.1621.4222.5233.7833.3228.8426.8235.0438.2639.52Waters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-分析生化样品分析生化样品分析生化样品分析生化样品(IgGIgG蛋白蛋白蛋白蛋白)(8)(8).1600180020002200240026002800300032003400m/z0100%2824277227722721267326722625262225802533245224092373233928792935293529382938305530583121312231223184Note the additional glycosolated species.Note the presence of a minorImpurity and glycosolated side peaks.148000 148500 149000 149500 150000 150500 151000 151500 152000mass0100%149629156149473149787314149945472.Waters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-组合化学组合化学组合化学组合化学分析系统分析系统分析系统分析系统(9)(9)分析分析分析分析/制备方案的自动切换制备方案的自动切换制备方案的自动切换制备方案的自动切换ExcessWasteFlow Rate1-50 ml/mnLoad Capacity 100 mgAnalysis/Prep BothCollectionYesThroughputHighUV/VisGradient PumpPurified FractionsWasteCollection1:1000Splitter 19 x 50mm4.6 x 50mmUpchurchSplitterMake UpPumpAutosamplerWaters China Ltd.Waters China Ltd.为为为为什么什么什么什么使用使用使用使用 LC/MS?LC/MS?-小结小结小结小结快速得到丰富的结果减少时间获得可靠信息减少过程获得可靠信息减少分析次数获得可靠信息