HPLC方法开发--工具、技术与策略.pdf

1HPLCHPLCHPLCHPLC方法开发方法开发方法开发方法开发-工具工具工具工具,技术与策略技术与策略技术与策略技术与策略吴园生吴园生,PhDWaters Asia Headquarter2007 Waters Corporation 2纲要纲要纲要纲要?引言引言液相色谱柱技术的最新进展液相色谱柱技术的最新进展?液相色谱方法开发策略液相色谱方法开发策略?应用实例应用实例?结语结语22007 Waters Corporation 3理想液相色谱柱设计的终极目标理想液相色谱柱设计的终极目标理想液相色谱柱设计的终极目标理想液相色谱柱设计的终极目标?峰形佳、柱效好峰形佳、柱效好对任何分析物(酸性,碱性和中性)?柱寿命长柱寿命长不同pH和柱温下均有良好表现?色谱分离可轻易放大色谱分离可轻易放大从分析规模直接放大至制备规模?分离表现高度重现分离表现高度重现柱与柱间、不同批次填料间和不同粒径填料间均需如此?柱产品质量的可溯源性和柱生产流程是否符合最新柱产品质量的可溯源性和柱生产流程是否符合最新GMP规范规范2007 Waters Corporation 4现代反相色谱柱技术发展的重要里程碑现代反相色谱柱技术发展的重要里程碑现代反相色谱柱技术发展的重要里程碑现代反相色谱柱技术发展的重要里程碑解决方案解决方案19701980199020002005低柱效无定形颗粒低柱效无定形颗粒(10 m)高金属杂质含量高金属杂质含量高高pH条件下柱寿命短条件下柱寿命短低低pH条件下键合相稳定性差碱性化合物峰拖尾条件下键合相稳定性差碱性化合物峰拖尾采用人工合成高纯球状硅胶和较小颗粒采用人工合成高纯球状硅胶和较小颗粒(3.5-5 m)第一代杂化颗粒技术第一代杂化颗粒技术采用立体禁阻键合相或多官能团键合相采用立体禁阻键合相或多官能团键合相采用极性基团嵌入键合相技术改进键合相技术采用极性基团嵌入键合相技术改进键合相技术技术难题技术难题在全在全pH范围下实现超高效快速分离范围下实现超高效快速分离第二代杂化颗粒技术（第二代杂化颗粒技术（1.7微米颗粒科技）微米颗粒科技）32007 Waters Corporation 5亲水性化合物专用柱亲水性化合物专用柱(硅胶低密度键合相硅胶低密度键合相)WatersWaters现代反相柱技术一览现代反相柱技术一览现代反相柱技术一览现代反相柱技术一览三大三大HPLC柱技术平台柱技术平台杂化颗粒柱杂化颗粒柱(pH 112)超纯硅胶基质柱超纯硅胶基质柱(高密度键合相高密度键合相)所有以上三个柱产品平台都是方法开发中不可或缺的工具。在本讲座中，我们将重点讨论代表每个平台的最新柱技术所有以上三个柱产品平台都是方法开发中不可或缺的工具。在本讲座中，我们将重点讨论代表每个平台的最新柱技术AtlantisT3AtlantisdC18AtlantisHILICXBridgeXTerraACQUITY UPLCSunFireSymmetrySymmetryShield2007 Waters Corporation 6Tetraethoxysilane(TEOS)Polyethoxysilane(PEOS)SymmetrySymmetry系列系列系列系列第一代超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成原理第一代超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成原理第一代超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成原理第一代超纯硅胶柱基体颗粒的化学合成原理无金属杂质的超纯起始原料无金属杂质的超纯起始原料42007 Waters Corporation 7SunFireSunFire系列系列系列系列最新一代的超纯硅胶反相柱最新一代的超纯硅胶反相柱最新一代的超纯硅胶反相柱最新一代的超纯硅胶反相柱SunFire C18and C8?基于高纯的基于高纯的2.5,3.5,5 和和10 m硅胶颗粒（孔径硅胶颗粒（孔径100 ）?使用了全新的键合和封端技术，使硅胶表面残余硅醇基数量降至前所未有的低水平使用了全新的键合和封端技术，使硅胶表面残余硅醇基数量降至前所未有的低水平?对碱性化合物的峰形为同行业最佳对碱性化合物的峰形为同行业最佳?在低在低pH流动相中的柱寿命大大加强流动相中的柱寿命大大加强?融合了融合了OBD专利技术的专利技术的SunFire制备柱提供更高的柱载荷和更长的柱寿命制备柱提供更高的柱载荷和更长的柱寿命?极低的液质联机本底信号极低的液质联机本底信号2007 Waters Corporation 851Vo234C18C18柱柱柱柱碱性化合物的峰对称性比较碱性化合物的峰对称性比较碱性化合物的峰对称性比较碱性化合物的峰对称性比较（pH=7pH=7）SymmetryC185 mUSP Tf=1.69N=6961 Alden,IranetaMinutes0.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0051Vo234以以Amitriptyline（峰（峰5）计算拖尾因子）计算拖尾因子USP TfSunFire C185 mUSP Tf=1.26N=8203Minutes0.005.0010.0015.0020.0025.0030.0035.0040.0045.0052007 Waters Corporation 9PerphenazinePerphenazine峰形与检测灵敏度的比较峰形与检测灵敏度的比较峰形与检测灵敏度的比较峰形与检测灵敏度的比较Zorbax SB C18Luna C18(2)SunFire C18Time(minutes)246810色谱条件色谱条件:3.0 x 150 mm,3 m 28:72 Acetonitrile/20 mM 甲酸;0.7 mL/min;30 CSNNNOHCl2007 Waters Corporation 10亲水性化合物专用柱亲水性化合物专用柱(硅胶低密度键合相硅胶低密度键合相)WatersWaters现代反相柱技术一览现代反相柱技术一览现代反相柱技术一览现代反相柱技术一览三大三大HPLC柱技术平台柱技术平台杂化颗粒柱杂化颗粒柱(pH 112)超纯硅胶基质柱超纯硅胶基质柱(高密度键合相高密度键合相)所有以上三个柱产品平台都是方法开发中不可或缺的工具。在本讲座中，我们将重点讨论代表每个平台的最新柱技术所有以上三个柱产品平台都是方法开发中不可或缺的工具。在本讲座中，我们将重点讨论代表每个平台的最新柱技术AtlantisT3AtlantisdC18AtlantisHILICXBridgeXTerraACQUITY UPLCSunFireSymmetrySymmetryShield62007 Waters Corporation 11以反相色谱分离极性化合物的技术挑战性以反相色谱分离极性化合物的技术挑战性以反相色谱分离极性化合物的技术挑战性以反相色谱分离极性化合物的技术挑战性?极性亲水性化合物在常规高键合密度硅胶C18柱上的保留不足极性亲水性化合物在常规高键合密度硅胶C18柱上的保留不足 高密度C18柱表面呈高度疏水性，无法与亲水性的极性化合物充分作用（“相似相容原理”）高密度C18柱表面呈高度疏水性，无法与亲水性的极性化合物充分作用（“相似相容原理”）?极性亲水性化合物在常规高键合密度硅胶C18柱上的保留不稳定极性亲水性化合物在常规高键合密度硅胶C18柱上的保留不稳定 需要使用到低溶剂强度的流动相（有机溶剂含量仅为0-5%）需要使用到低溶剂强度的流动相（有机溶剂含量仅为0-5%）此状态下，渐进式的微孔脱水效应使保留时间逐步缩短此状态下，渐进式的微孔脱水效应使保留时间逐步缩短 若在停泵10-30分钟，因颗粒上微孔完全脱水，柱上保留能力可降为零！若在停泵10-30分钟，因颗粒上微孔完全脱水，柱上保留能力可降为零！?为了在高密度C18柱上获得较稳定的亲水性化合物保留性能，需要定期用高溶剂量的流动相进行色谱柱的再平衡为了在高密度C18柱上获得较稳定的亲水性化合物保留性能，需要定期用高溶剂量的流动相进行色谱柱的再平衡 连续分析多个样品时可能遭遇困难连续分析多个样品时可能遭遇困难2007 Waters Corporation 12高密度高密度高密度高密度C18C18填料在低溶剂流动相中的微孔脱水现象填料在低溶剂流动相中的微孔脱水现象填料在低溶剂流动相中的微孔脱水现象填料在低溶剂流动相中的微孔脱水现象(De(De-Wetting)Wetting)示意图示意图示意图示意图若发生填料微孔脱水现象，对色谱分离将有何影响若发生填料微孔脱水现象，对色谱分离将有何影响?若颗粒内部微孔完全干涸，分析物将无法传输至填料颗粒内部发生色谱作用，色谱保留将完全丧失！若颗粒内部微孔完全干涸，分析物将无法传输至填料颗粒内部发生色谱作用，色谱保留将完全丧失！典型的液相色谱填料为类似海绵的高度多孔性颗粒，其典型的液相色谱填料为类似海绵的高度多孔性颗粒，其95-99%的色谱保留能力来自颗粒的内表面的色谱保留能力来自颗粒的内表面分析物分析物流动相流动相流动相可正常进入颗粒内部微孔是实现分析物充分色谱保留的一个先决条件。流动相可正常进入颗粒内部微孔是实现分析物充分色谱保留的一个先决条件。72007 Waters Corporation 13Minutes0246810初始分离状态(色谱柱先以甲醇或乙腈冲洗过后，再在流动相中平衡色谱柱先以甲醇或乙腈冲洗过后，再在流动相中平衡)停泵半小时后再进样(填料100%脱水)流动相流动相:0.1%Acetic AcidAmoxicillinVo:色谱保留完全丧失！色谱保留完全丧失！1,500psi柱柱:该色谱柱并未损坏，但却无法正常工作该色谱柱并未损坏，但却无法正常工作如何解决这样的难题如何解决这样的难题?1,500psi高密度高密度高密度高密度C18C18填料在低溶剂流动相中的填料在低溶剂流动相中的填料在低溶剂流动相中的填料在低溶剂流动相中的微孔脱水现象实例微孔脱水现象实例微孔脱水现象实例微孔脱水现象实例2007 Waters Corporation 14AtlantisAtlantis dC18dC18以低密度键合柱强化极性化合物保留的创举以低密度键合柱强化极性化合物保留的创举以低密度键合柱强化极性化合物保留的创举以低密度键合柱强化极性化合物保留的创举表面峰端表面峰端键合密度键合相连接方式微孔大小键合密度键合相连接方式微孔大小防微孔脱水峰形保留性能柱寿命防微孔脱水峰形保留性能柱寿命82007 Waters Corporation 15低表面覆盖率低表面覆盖率 低低C18键合密度键合密度Atlantis dC18Atlantis dC18上的亲水保留机制上的亲水保留机制上的亲水保留机制上的亲水保留机制反相反相反相反相+氢键氢键氢键氢键/离子交换双重作用离子交换双重作用离子交换双重作用离子交换双重作用HSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiOOOSiCH2H3CCH3H2CCH2H2CCH2H2CCH2H2CSiCH3H3CCH3SiCH2H3CCH3H2CCH2H2CCH2H2CCH2H2CSiOOOSiCH3H3CCH3SiCH3H3CCH3HHHHHHHC18长链残余硅醇基表面封端结构长链残余硅醇基表面封端结构NNHNH2O极性化合物的极性官能极性化合物的极性官能团团部分与硅胶表面的残余硅醇基间有氢键或离子交换作用部分与硅胶表面的残余硅醇基间有氢键或离子交换作用NHNHOO极性化合物的碳极性化合物的碳骨架骨架部分与部分与C18键合相发生反相作用（即疏水性作用）键合相发生反相作用（即疏水性作用）2007 Waters Corporation 16AtlantisAtlantis dCdC1818柱对极性化合物的优异保留性能柱对极性化合物的优异保留性能柱对极性化合物的优异保留性能柱对极性化合物的优异保留性能对嘌呤碱表现良好峰形对嘌呤碱表现良好峰形(因对填料进行了彻底封端因对填料进行了彻底封端)Compounds:1.Cytosine2.5-Fluorocytosine3.Uracil4.5-Fluorouracil5.Guanine6.Thymine7.Adenine123456Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.007V0=1.83 minConditionsColumn:AtlantisTMdC184.6 x 150 mm,5 m Mobile Phase A:H20Mobile Phase B:ACNMobile Phase C:100 mM CH3COONH4,pH 5.0Flow Rate:1.0 mL/minGradient:TimeProfile(min)%A%B%C0.090 01010.084 610Injection Volume:10 LTemperature:30 oCDetection:UV 254 nmInstrument:AllianceTM2695,2996 PDA尿嘧啶尿嘧啶(Uracil)是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物,但在AtlantisdC18柱上具显著保留92007 Waters Corporation 17AtlantisAtlantis T3T3新系列亲水保留柱新系列亲水保留柱新系列亲水保留柱新系列亲水保留柱新在何处新在何处新在何处新在何处?Atlantis T3 新系列亲水化合物保留专用柱新系列亲水化合物保留专用柱:性能进一步大幅增强的低密度性能进一步大幅增强的低密度C18硅胶柱，对保留小分子亲水性化合物有无与伦比的优异表现硅胶柱，对保留小分子亲水性化合物有无与伦比的优异表现 与全水流动相完全兼容，在硅胶柱的与全水流动相完全兼容，在硅胶柱的pH范围（范围（2 8）内展现高度对称峰形）内展现高度对称峰形?与现有的与现有的Atlantis dC18 系列亲水化合物保留专用柱相比，系列亲水化合物保留专用柱相比，Atlantis T3系列柱产品有如下特色系列柱产品有如下特色:以三官能团键合取代双三官能团以三官能团键合取代双三官能团，使得在低，使得在低pH流动相中的柱稳定性更佳流动相中的柱稳定性更佳 以新型封端技术取代常规以新型封端技术取代常规TMS封端技术封端技术，使得碱性化合物在，使得碱性化合物在pH 7附近的峰对称性大大提高附近的峰对称性大大提高 近中性近中性pH（6-8）条件下的柱寿命显著提高）条件下的柱寿命显著提高 分离选择性非常接近，但亲水保留能力较强分离选择性非常接近，但亲水保留能力较强产品价格不变！产品价格不变！New2007 Waters Corporation 18的应用实例的应用实例的应用实例的应用实例（使用使用使用使用0.1%TFA0.1%TFA-ACNACN梯度的肽序列分梯度的肽序列分梯度的肽序列分梯度的肽序列分析）析）析）析）AU0,000,050,100,150,200,25AU0,000,050,100,150,200,25AU0,000,050,100,150,200,250,002,004,006,008,0010,0012,0014,0016,0018,0020,0022,0024,00进样进样 2进样进样 501进样进样 901102007 Waters Corporation 19AtlantisAtlantisHILIC SilicaHILIC Silica柱柱柱柱对极端亲水的有机胺和季铵盐有特效对极端亲水的有机胺和季铵盐有特效对极端亲水的有机胺和季铵盐有特效对极端亲水的有机胺和季铵盐有特效?HILIC Silica 柱用于在柱用于在Atlantis dC18柱上依然无有效保留的场合柱上依然无有效保留的场合?分离机制为分离机制为“反反相色谱反反相色谱”技术技术 流动相为流动相为ACN-H2O（H2O20%）保留机制与正相色谱类似保留机制与正相色谱类似?HILIC Silica 柱与柱与Atlantis dC18柱上的出峰顺序刚好相反柱上的出峰顺序刚好相反?由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在由于使用含高有机溶剂成分的流动相进行分离，在LC/MS应用中的检测灵敏度比应用中的检测灵敏度比Atlantis dC18柱上显著提高柱上显著提高?可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。可直接将样品溶于纯有机溶剂中进样，省却了将样品溶剂蒸干再定容的麻烦。2007 Waters Corporation 20HILICHILIC分离模式的保留特色分离模式的保留特色分离模式的保留特色分离模式的保留特色AU0.000.050.10Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00AtlantisTMdC18 4.6 x 50 mm,3 m100%甲酸铵缓冲液甲酸铵缓冲液,pH 31.0 mL/minVo=0.65 min NHNHNHOOONH2Allantoin尿囊素尿囊素HILIC分离模式可对在反相模式下完全不保留的化合物表现出强保留。分离模式可对在反相模式下完全不保留的化合物表现出强保留。Vo=1.15 min AU0.000.050.100.15Minutes0.501.001.502.002.503.003.504.004.505.00AtlantisTMHILIC Silica4.6 x 50 mm,3 m95:5 ACN:甲酸铵缓冲液甲酸铵缓冲液,pH 31.0 mL/mink=0k=1.09112007 Waters Corporation 21AtlantisAtlantisHILIC SilicaHILIC Silica柱柱柱柱用于动物饲料和动物组织中三聚氰胺的分析用于动物饲料和动物组织中三聚氰胺的分析用于动物饲料和动物组织中三聚氰胺的分析用于动物饲料和动物组织中三聚氰胺的分析NEW?三聚氰胺，又名蜜胺，本为生产塑料、阻燃剂和粘接剂等的工业原料。但是，近来发现国内有些厂家非法将三聚氰胺加入动物饲料中，以制造产品中蛋白质含量达标的假象，以期非法牟利。三聚氰胺，又名蜜胺，本为生产塑料、阻燃剂和粘接剂等的工业原料。但是，近来发现国内有些厂家非法将三聚氰胺加入动物饲料中，以制造产品中蛋白质含量达标的假象，以期非法牟利。?三聚氰胺的现有分析方法有三聚氰胺的现有分析方法有 GC-MS法（进样前需要化学衍生）法（进样前需要化学衍生）反相反相HPLC法（需加离子对试剂以便取得足够保留）法（需加离子对试剂以便取得足够保留）o 柱平衡慢，同时无法进行柱平衡慢，同时无法进行LC-MS分析分析US FDA最新方法分析柱：最新方法分析柱：Atlantis HILIC Silica(HPLC-UV:4.6x150mm,5umLC-MS/MS:2.1x50mm,5um)流动相：流动相：ACN-20mM甲酸铵梯度（甲酸铵梯度（95-50%）样品处理：）样品处理：OASIS MCX小柱石（小柱石（150mgx6cc)LOQ(LC-MS/MS):7时上述腐蚀过程容易发生时上述腐蚀过程容易发生OH-OH-须打断六个键以便同时去除经乙烷桥键连接的两个硅单位须打断六个键以便同时去除经乙烷桥键连接的两个硅单位(该过程极难发生该过程极难发生)腐蚀所产生的有机硅离子在流动相中的溶解度较低腐蚀所产生的有机硅离子在流动相中的溶解度较低,因此容易累积在填料微空表面因此容易累积在填料微空表面,有时可能会重新连接回颗粒表面有时可能会重新连接回颗粒表面,形成所谓的形成所谓的自我修复自我修复机制。因此机制。因此,大大延缓了表面腐蚀的速度。大大延缓了表面腐蚀的速度。182007 Waters Corporation 35产品平台超纯硅胶柱 亲水性化合物专用柱 杂化颗粒柱最前沿优质产品产品平台超纯硅胶柱 亲水性化合物专用柱 杂化颗粒柱最前沿优质产品SunFire C18/C8Atlantis T3 与 与 Atlantis HILIC SilicaX-Bridge 系列系列 ACQUITY UPLC系列系列大众化价格优质产品大众化价格优质产品Symmetry C18/C8 SymmetryShield RP18/RPXterra MS C18/C8 Xterra RP18/RP Xterra PhenylWaters Waters 现代反相柱产品平台一览现代反相柱产品平台一览现代反相柱产品平台一览现代反相柱产品平台一览2007 Waters Corporation 36如何选购最恰当的优质色谱柱？如何选购最恰当的优质色谱柱？如何选购最恰当的优质色谱柱？如何选购最恰当的优质色谱柱？从您的应用课题着手从您的应用课题着手从您的应用课题着手从您的应用课题着手否否Atlantis T3At pH 2-8Atlantis HILICAt pH 2-5是是样品是否水溶性强样品是否水溶性强?(样品是否在使用极少溶剂的流动相时仍在靠近死体积处出峰样品是否在使用极少溶剂的流动相时仍在靠近死体积处出峰?)仍无满意保留仍无满意保留?分析用户分析用户:我的分析物在中低我的分析物在中低pH流动相的分离尚可流动相的分离尚可,没必要探索高没必要探索高 pH下的分离。我首要关注的是低下的分离。我首要关注的是低pH下碱性化合物的峰对称性和色谱柱的使用寿命。下碱性化合物的峰对称性和色谱柱的使用寿命。分离纯化用户：分离纯化用户：我要纯化多样的化合物我要纯化多样的化合物(酸碱中性都有酸碱中性都有),或我的实验室有多组人员或我的实验室有多组人员,从事各不相同的分离纯化工作从事各不相同的分离纯化工作,所以需要购置所以需要购置通用型通用型制备柱制备柱.分析用户分析用户:我的样品较复杂我的样品较复杂,无法断定究竟是低无法断定究竟是低pH还是高还是高pH好，所以想探索样品在高低好，所以想探索样品在高低pH下的分离情况。因此，我要求所采用的色谱柱可在很宽的下的分离情况。因此，我要求所采用的色谱柱可在很宽的pH范围下稳定工作。范围下稳定工作。分离纯化用户：分离纯化用户：我主要纯化碱性化合物我主要纯化碱性化合物,所以希望购置对该类化合物有最大载荷量的分析和制备柱所以希望购置对该类化合物有最大载荷量的分析和制备柱.192007 Waters Corporation 37纲要纲要纲要纲要?引言引言液相色谱柱技术的最新进展液相色谱柱技术的最新进展?液相色谱方法开发策略液相色谱方法开发策略?应用实例应用实例?结语结语2007 Waters Corporation 38色谱柱色谱柱 Selectivity液相色谱分离选择性的基本调控手段液相色谱分离选择性的基本调控手段液相色谱分离选择性的基本调控手段液相色谱分离选择性的基本调控手段 分离选择性分离选择性流动相溶剂流动相流动相溶剂流动相pH202007 Waters Corporation 39流动相溶剂甲醇和乙腈的物理化学特性差异流动相溶剂甲醇和乙腈的物理化学特性差异流动相溶剂甲醇和乙腈的物理化学特性差异流动相溶剂甲醇和乙腈的物理化学特性差异?甲醇甲醇UV cutoff在在205nm左右，使用低波长检测时本底较高左右，使用低波长检测时本底较高流体粘度较高，柱反压相对较高流体粘度较高，柱反压相对较高反相洗脱强度较弱反相洗脱强度较弱氢键作用较强氢键作用较强?乙腈乙腈UV cutoff在在190nm左右，使用低波长检测时本底较低左右，使用低波长检测时本底较低流体粘度较低，柱反压较低（对快速分析有利）流体粘度较低，柱反压较低（对快速分析有利）反相洗脱强度比甲醇强反相洗脱强度比甲醇强氢键作用较弱氢键作用较弱2007 Waters Corporation 40甲醇、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异甲醇、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异甲醇、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异甲醇、乙腈作流动相溶剂时的分离选择性差异切换溶剂时可观察到明显的分离选择性移动；乙腈表现为更强的洗脱溶剂；将乙腈和甲醇混合可进行分离选择性的微调切换溶剂时可观察到明显的分离选择性移动；乙腈表现为更强的洗脱溶剂；将乙腈和甲醇混合可进行分离选择性的微调.XBridge Shield RP18100%MeOH100%ACN低pH1:1 ACN:MeOH124356287961012118910 1110,1112128,916723 44315,75212007 Waters Corporation 41同时改变色谱柱和流动相溶剂同时改变色谱柱和流动相溶剂同时改变色谱柱和流动相溶剂同时改变色谱柱和流动相溶剂更显著的分离选择性差异更显著的分离选择性差异更显著的分离选择性差异更显著的分离选择性差异XBridge C18MethanolXBridge Shield RP18AcetonitrileXBridge Shield RP18Methanol高高 pH7,12111223326121194115310768,941011512986410587Snyder,L.R.,Dolan,J.W.,Carr,P.W.J.Chromatogr.A 1060(2004)77-116.本例显示，在本例显示，在XBridge C18柱上使用甲醇作流动相溶剂和在柱上使用甲醇作流动相溶剂和在XBridgeShieldRP18上使用乙腈作流动相溶剂将产生最大的分离选择性差异上使用乙腈作流动相溶剂将产生最大的分离选择性差异Jenkins,Diehl2007 Waters Corporation 42色谱柱色谱柱 Selectivity液相色谱分离选择性的基本调控手段液相色谱分离选择性的基本调控手段液相色谱分离选择性的基本调控手段液相色谱分离选择性的基本调控手段 分离选择性分离选择性流动相溶剂流动相溶剂流动相流动相pH222007 Waters Corporation 43pH0510152025303540024681012容量因子容量因子(k)有机酸有机酸有机碱有机碱中性化合物中性化合物注注:中性化合物的保留与中性化合物的保留与pH无关无关碱的高保留平台区碱的高保留平台区酸的高保留平台区酸的高保留平台区硅胶柱的硅胶柱的pH应用范围应用范围杂化颗粒柱的杂化颗粒柱的pH应用范围应用范围从反相色谱保留图看流动相从反相色谱保留图看流动相从反相色谱保留图看流动相从反相色谱保留图看流动相pHpH的重要性的重要性的重要性的重要性酸的低保留平台区酸的低保留平台区碱的低保留平台区碱的低保留平台区2007 Waters Corporation 44?锁定流动相锁定流动相pH可保障对有机酸碱分析方法的高度重现性可保障对有机酸碱分析方法的高度重现性 无无pH调控意味着保留时间可能发生移动，同时分离可能时好时坏调控意味着保留时间可能发生移动，同时分离可能时好时坏?改变流动相改变流动相pH可大幅度改变有机酸碱的保留强度，从而调控其分离选择性可大幅度改变有机酸碱的保留强度，从而调控其分离选择性 在低在低pH下下,有机酸呈高保留状态有机酸呈高保留状态,而有机碱呈低保留状态而有机碱呈低保留状态 在高在高pH下下,有机碱呈强保留状态有机碱呈强保留状态,而有机酸呈低保留状态而有机酸呈低保留状态?选择适当的流动相选择适当的流动相pH可有效保障碱性化合物的峰对称性可有效保障碱性化合物的峰对称性 有机碱在酸性流动相中有机碱在酸性流动相中(=pka+2)峰对称性很好峰对称性很好,因此时色谱填料上残余硅醇基虽因离解而呈负电状态，但有机碱则呈电中性状态。此，峰对称性较好。因此时色谱填料上残余硅醇基虽因离解而呈负电状态，但有机碱则呈电中性状态。此，峰对称性较好。若有可能，应尽量避免在近中性若有可能，应尽量避免在近中性pH(5-8)下分析有机碱，因其峰形容易拖尾。原因是，此时有机碱因质子化而呈正电状态，而同时残余硅醇基因离解而呈负电状态，因而存在对有机碱的离子交换作用。下分析有机碱，因其峰形容易拖尾。原因是，此时有机碱因质子化而呈正电状态，而同时残余硅醇基因离解而呈负电状态，因而存在对有机碱的离子交换作用。?选择适当的流动相选择适当的流动相pH可使酸碱分析物的上样量显著增加可使酸碱分析物的上样量显著增加 在使有机酸或碱呈电中性状态的流动相在使有机酸或碱呈电中性状态的流动相pH中进行分离时，有机酸或碱的上样量可增加中进行分离时，有机酸或碱的上样量可增加20-80倍倍 可极大地增加有机酸碱的制备纯化效率，同时可使可极大地增加有机酸碱的制备纯化效率，同时可使QC分析中杂质的检测灵敏度显著增加分析中杂质的检测灵敏度显著增加反相色谱分析中主动调控流动相反相色谱分析中主动调控流动相反相色谱分析中主动调控流动相反相色谱分析中主动调控流动相pHpH值的现值的现值的现值的现实意义实意义实意义实意义232007 Waters Corporation 45?林可霉素盐酸盐林可霉素盐酸盐Lincomycin hydrochloride(pKa7.6)是多年来广泛使用的人、畜用抗生素，高效杀灭革兰阳式病菌是多年来广泛使用的人、畜用抗生素，高效杀灭革兰阳式病菌?美国药典美国药典USP方法方法 存在峰形不佳存在峰形不佳/杂质检测灵敏度不足的情况杂质检测灵敏度不足的情况使用使用C8柱柱,4.6 x 250 mm,5 m流动相缓冲液为流动相缓冲液为H3PO4用氨水调至用氨水调至pH 6，流动相溶剂为乙腈加甲醇（混合溶剂），流动相溶剂为乙腈加甲醇（混合溶剂）UV 检测波长为检测波长为 210 nm(因缺乏生色基团因缺乏生色基团)方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲方法开发中选择流动相缓冲pHpH值的重要性值的重要性值的重要性值的重要性:一个实例一个实例一个实例一个实例OHOH2007 Waters Corporation 46用现有用现有用现有用现有USPUSP方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果方法分析林可霉素样品的效果色谱条件色谱条件:色谱柱色谱柱:SymmetryC8 4.6 x 250 mm,5 m流动相流动相 A:100 mM Phosphoric acid/ammonium hydroxide,pH 6 流动相流动相 B:Acetonitrile流动相流动相 C:Methanol流动相流动相 D:Water等度分离条件等度分离条件:20%A:13.9%B:13.9%C:52.2%D柱流速柱流速:1 mL/min进样量进样量:20 L 20 mg/mL in water柱温柱温:46 oC检测检测:UV 215 nmLincomycin242007 Waters Corporation 47在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离在新型杂化颗粒柱上探索最佳分离pHpH色谱条件分析柱:XBridge C18 3.0 x 100 mm,3.5 m流动相 A1:100 mM 磷酸钾缓冲液 pH 2流动相 A2:100 mM 磷酸钾缓冲液 pH 7流动相 A3:100 mM 磷酸钾缓冲液 pH 12流动相 B:Acetonitrile流动相 C:Water流速:0.6 mL/min梯度程序:时间梯度组成(min)%A%B%C 0.020 5 7515.020 50 30 柱温:30 oC进样体积:20 L 30 mg/mL in water检测波长:UV 215 nm 仪器:Waters Alliance2695 with 2996 PDA新方法以取得对杂质的低检测限为宗旨注：磷酸盐系列缓冲液挥发性差，故不适合用于LC/MS联机的场合在低UV检测波长下使用甲醇做流动相不合适2007 Waters Corporation 48pH pH 探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览探索性实验结果一览pH 2pH 7pH 12峰形差柱超载低保留峰形差柱超载低保留 分析物已完全离子化对杂质的分离效果很差分析物已完全离子化对杂质的分离效果很差最佳峰形最佳保留最佳峰形最佳保留分析物呈完全电中性状态最佳分离分析物呈完全电中性状态最佳分离峰形有所改善保留较好峰形有所改善保留较好 50%离子化状态仍存在杂质分离不完全的问题离子化状态仍存在杂质分离不完全的问题方法优化的最佳选择！方法优化的最佳选择！Jenkins,Diehl252007 Waters Corporation 49流动相流动相流动相流动相pHpH设在林可霉素设在林可霉素设在林可霉素设在林可霉素pKapKa附近时的附近时的附近时的附近时的方法耐用性测试结果方法耐用性测试结果方法耐用性测试结果方法耐用性测试结果pH 7pH 6当流动相当流动相pH处在林可霉素处在林可霉素pKa附近时，移动附近时，移动pH一个单位将引起巨大的分离选择性改变（即方法的耐用性不佳）。一个单位将引起巨大的分离选择性改变（即方法的耐用性不佳）。2007 Waters Corporation 50经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况经优化后的梯度分离情况绝佳的柱容量大大改善的分离度优异的峰形绝佳的柱容量大大改善的分离度优异的峰形Lincomycin7.3%1.1%0.25%色谱条件色谱条件分析柱分析柱:XBridge C18 3.0 x 100 mm,3.5 m流动相流动相 A:100 mM 磷酸钾缓冲液磷酸钾缓冲液 pH 12流动相流动相 B:Acetonitrile流动相流动相 C:Water流速流速:0.6 mL/min梯度程序梯度程序:时间梯度组成时间梯度组成(min)%A%B%C 0.020 15 6515.020 35 45 柱温柱温:30 oC进样体积进样体积:20 L 30 mg/mL in water检测波长检测波长:UV 215 nm 262007 Waters Corporation 51使用使用使用使用pH 12pH 12的磷酸盐缓冲液，柱温为的磷酸盐缓冲液，柱温为的磷酸盐缓冲液，柱温为的磷酸盐缓冲液，柱温为30 30 o oC C时时时时XBridgeXBridge C C1818的柱寿命测试结果的柱寿命测试结果的柱寿命测试结果的柱寿命测试结果进样进样2次后进样次后进样400次后进样次后进样650次后次后出峰顺序出峰顺序:PropranololDiphenhydramineNortriptylineAcenaphthene色谱条件色谱条件分析柱分析柱:4.6 x 150 mm,5 m 等度流动相组成等度流动相组成:10%A;37%B;53%C A:200 mM K3PO4(pH 12)in 80:20 H2O:ACNB:H2OC:ACN柱流速柱流速:1.0 mL/min分析分析时间分析分析时间:20 min进样体积进样体积:10 L温度温度:30 oC检测器检测器:UV 254 nm仪器仪器:Waters Alliance2695唯有在第二代杂化颗粒柱上才可享受仅用磷酸缓冲系统就可在低、中、高唯有在第二代杂化颗粒柱上才可享受仅用磷酸缓冲系统就可在低、中、高pH下完成方法开发的灵活性！下完成方法开发的灵活性！2007 Waters Corporation 52使用使用使用使用pH12pH12的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时的磷酸盐缓冲体系进行方法开发时需要注意的事项需要注意的事项需要注意的事项需要注意的事项?中中pH尤其是高尤其是高pH磷酸盐缓冲盐会腐蚀柱填料颗粒。磷酸盐缓冲盐会腐蚀柱填料颗粒。pH12的磷酸盐缓冲液只有在绝对需要时，例如在进行低的磷酸盐缓冲液只有在绝对需要时，例如在进行低UV波长检测或者有机碱分析物的波长检测或者有机碱分析物的pKa大于大于10时，方才建议使用。时，方才建议使用。?在通常的在通常的UV检测波长范围内（例检测波长范围内（例254nm)，有许多对填料颗粒腐蚀性很小的高，有许多对填料颗粒腐蚀性很小的高pH缓冲系统可供使用，包括碳酸氢铵、三乙胺、氨水等都可方便地提供缓冲系统可供使用，包括碳酸氢铵、三乙胺、氨水等都可方便地提供pH在在9-11之间的良好缓冲能力之间的良好缓冲能力?在绝对需要使用到在