生物技术制药酶工程和手性药物专家讲座.pptx

第三章手性与手性药品第三章手性与手性药品生物技术制药酶工程和手性药物第1页手性是自然界基本属性手性是自然界基本属性宇宙宇宙是非对称，假如把组成太阳系全部物体置于是非对称，假如把组成太阳系全部物体置于一面跟伴随它们镜子面前，镜子中影像不能和实一面跟伴随它们镜子面前，镜子中影像不能和实体重合。体重合。生命由非对称作用所主宰。我能预生命由非对称作用所主宰。我能预见，全部生物物种在其结构上、在其外部形态上，见，全部生物物种在其结构上、在其外部形态上，究其根源都是宇宙非对称性产物。究其根源都是宇宙非对称性产物。LouisPasteur法国化学家巴斯顿法国化学家巴斯顿生物技术制药酶工程和手性药物第2页3手性手性(Chirality)：自然界基本属性自然界基本属性 组成生命活动基本化学物质是组成生命活动基本化学物质是组成生命活动基本化学物质是组成生命活动基本化学物质是手性化合物！手性化合物！手性化合物！手性化合物！手性药品：一把钥匙开一把锁！手性药品：一把钥匙开一把锁！1.1.氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸-蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质2.2.糖糖糖糖-多糖多糖多糖多糖3.3.核酸核酸核酸核酸-DNA-DNA 2/32/3以上开发中药品为手性以上开发中药品为手性以上开发中药品为手性以上开发中药品为手性 市场上市场上市场上市场上40%40%手性药品为单一异构体手性药品为单一异构体手性药品为单一异构体手性药品为单一异构体 年全球手性药品市场年全球手性药品市场年全球手性药品市场年全球手性药品市场15901590亿美元亿美元亿美元亿美元生物技术制药酶工程和手性药物第3页手性手性(chirality)这个词起这个词起源于希腊字源于希腊字“手手”(cheir)。手是手性手是手性右手与左手右手与左手成镜像。成镜像。手性手性是三维物体基本属是三维物体基本属性。假如一个物体不能性。假如一个物体不能与其镜像重合，该物体与其镜像重合，该物体就称为手性物体。就称为手性物体。手手性性生物技术制药酶工程和手性药物第4页从从天文学天文学到到地球科学，从化地球科学，从化学到生物学学到生物学，几乎处处都有，几乎处处都有手性显身影。手性显身影。生物技术制药酶工程和手性药物第5页太阳系太阳系全部天体全部天体（包含小行星）（包含小行星）都是按照都是按照右旋右旋方方向旋转，称为向旋转，称为右右手定则手定则。生物技术制药酶工程和手性药物第6页年年8月发生于大西月发生于大西洋阿尔贝托飓风，洋阿尔贝托飓风，其螺旋含有手性其螺旋含有手性特征。特征。生物技术制药酶工程和手性药物第7页在在植物植物学中，手性也是一个学中，手性也是一个主要形态特征。绝大部分攀主要形态特征。绝大部分攀缘植物是沿着主干往缘植物是沿着主干往右缠绕右缠绕，但也有少部分是往左缠绕，但也有少部分是往左缠绕，如香忍冬。如香忍冬。左手性紫藤左手性紫藤右手性多花紫藤右手性多花紫藤生物技术制药酶工程和手性药物第8页生物技术制药酶工程和手性药物第9页长瓣兜兰长瓣兜兰：花两侧长瓣螺旋是左右对称，：花两侧长瓣螺旋是左右对称，右侧是左旋，左侧是右旋右侧是左旋，左侧是右旋科学,Vol.54,No.55生物技术制药酶工程和手性药物第10页年年6月月13日，英国日，英国自然自然周刊发表周刊发表加拿大科学家杰森（加拿大科学家杰森（L.Jesson）和巴）和巴雷特（雷特（S.Barrett）研究某植物花柱手）研究某植物花柱手性论文，指出性论文，指出两两个等位基因中一个控个等位基因中一个控制花柱左右，其中向右是显性。制花柱左右，其中向右是显性。生物技术制药酶工程和手性药物第11页12即即使使产产生生这这种种手手性性确确实实切切机机理理、起起源源和和过过程程仍仍是是科科学学上上未未解解之之谜谜，但但有有一一点点是是明明确确：这这些些分分子子作作用以至于生命过程均与手性相关。用以至于生命过程均与手性相关。对对映映体体不不一一样样生生理理性性质质是是因因为为它它们们分分子子立立体体结结构构在在生生物物体体内内引引发发不不一一样样分分子子识识别别造造成成这这个个现现象象称称为为“手手性性识识别别”。这这种种识识别别可可比比喻喻为为手手与与手手套套关关系系，右右手手能能套套进进右右手手套套，而左手就套而左手就套不进右手套。不进右手套。手套与左右手相互关系手套与左右手相互关系手套与左右手相互关系手套与左右手相互关系生物技术制药酶工程和手性药物第12页有机分子手征性发觉有机分子手征性发觉1848年，法国化学家巴斯顿年，法国化学家巴斯顿（L.Pasteur,18221895）发觉酒石酸两种不一样存在发觉酒石酸两种不一样存在形式：形式：左旋酒石酸左旋酒石酸右旋酒石酸右旋酒石酸图：巴斯顿把酒石酸晶体分图：巴斯顿把酒石酸晶体分开成两个镜像异构体开成两个镜像异构体生物技术制药酶工程和手性药物第13页DNA在生命产生、演变、进化这么漫长过在生命产生、演变、进化这么漫长过程中，自然界造就了许多分子，手性程中，自然界造就了许多分子，手性分子占去了很大百分比。组成蛋白质分子占去了很大百分比。组成蛋白质氨基酸都是氨基酸都是 L L 型氨基酸，多糖和核酸型氨基酸，多糖和核酸单糖是单糖是 D D 型糖。人们甚至发觉，型糖。人们甚至发觉，19691969年坠落在澳大利亚默奇森陨石中氨基年坠落在澳大利亚默奇森陨石中氨基酸也主要是酸也主要是L L 型。型。生物分子手性同一性生物分子手性同一性生物技术制药酶工程和手性药物第14页15年诺贝尔奖：年诺贝尔奖：不对称催化不对称催化从试验室到工厂（从试验室到工厂（从试验室到工厂（从试验室到工厂（19841984）生物技术制药酶工程和手性药物第15页孟山都企业孟山都企业L-L-多巴生产工艺多巴生产工艺第一例工业化成功催化不对称反应（第一例工业化成功催化不对称反应（19701970S S）治疗帕金森病治疗帕金森病生物技术制药酶工程和手性药物第16页17孟山都企业 L-DOPA路线生物技术制药酶工程和手性药物第17页18OCH3OONHCOPhOCH3OHONHCOPhOHOHONH2OHNHOOTBDMSNHOOTBDMSNHOOAcNSSNHtBuSynthesis of a Carbapenem Intermediate:Takasago ProcessH2/CH2Cl21)HCl2)Et3NPh3PTBDMSClimidazoleCH3CO3HRuCl3HOAc(R)-TolBINAP-Ru99%ee95%deCarbapenemintermediateS.Akutagawa in Chirality in Industry,(1992)生物技术制药酶工程和手性药物第18页19不对称环氧化DET=(+)or(-)diethyltartrateLimitedto(homo)allylicalcoholsSynthesis-blockers生物技术制药酶工程和手性药物第19页(S)-Metolachlor(Novatis,1996)不对称合成最大工业化例子（不对称合成最大工业化例子（10,000吨吨/年）年）materialamountMEA-imine10,000KgIr(COD)Cl2234gLigand68gNaI92gH2SO4250gH.U.Blaser,ASC,344,17除草剂除草剂生物技术制药酶工程和手性药物第20页不对称催化在精细化工品生产中应用不对称催化在精细化工品生产中应用Productionprocesses:Pharma(generics,NCE)7Agro2Flavors&fragrances2Intermediates(PH,other)2Chiralbuildingblocks2H.U.Blaser,F.Spindler,M.Studer,Applied Catalysis:A General221()119.成功工业化不对称催化反应体系屈指可数！成功工业化不对称催化反应体系屈指可数！生物技术制药酶工程和手性药物第21页手性金属配合物催化不对称反应示意图手性金属配合物催化不对称反应示意图生物技术制药酶工程和手性药物第22页九寨风光水相不对称催化反应水相不对称催化反应生物技术制药酶工程和手性药物第23页生物催化反应生物催化反应生物技术制药酶工程和手性药物第24页酶催化酶催化生物技术制药酶工程和手性药物第25页树状分子酶树状分子酶Dendrizyme外层区外层区内层区内层区核核心心生物技术制药酶工程和手性药物第26页27已用于工业不对称催化反应生物技术制药酶工程和手性药物第27页取得手性化合物不一样路径取得手性化合物不一样路径拆分拆分和和或或或或手性池手性池前手性前手性化合物化合物天然手性天然手性化合物化合物消旋消旋化合物化合物催化不对称合成催化不对称合成生物技术制药酶工程和手性药物第28页29手性与手性药品化合物活性关系以及表手性与手性药品化合物活性关系以及表手性与手性药品化合物活性关系以及表手性与手性药品化合物活性关系以及表现出错综复杂药代动力学现出错综复杂药代动力学现出错综复杂药代动力学现出错综复杂药代动力学和药效学特征和药效学特征和药效学特征和药效学特征在许多情况下，化合物一对对映体在生物体内药理活性、代谢过程、代在许多情况下，化合物一对对映体在生物体内药理活性、代谢过程、代谢速率及毒性等存在显著差异。谢速率及毒性等存在显著差异。使用单一对映体必要性使用单一对映体必要性(1)只有一个对映体含有所要求药理活性，只有一个对映体含有所要求药理活性，(+)或或(+)而另一个对映体则没有显著药理作用；而另一个对映体则没有显著药理作用；(2)一对对映体中两个化合物都有等同或一对对映体中两个化合物都有等同或(-)近乎等同定性和定量药理活性；近乎等同定性和定量药理活性；(3)两种对映体含有定量上等同，但定性上不一样活性；两种对映体含有定量上等同，但定性上不一样活性；(+)或或(+)(4)各种对映体含有定量上不一样活性；各种对映体含有定量上不一样活性；(+)或或(-)人体手性环境和特异对映体相互作用，造成手性药品对映体药代动力人体手性环境和特异对映体相互作用，造成手性药品对映体药代动力学和药效学立体选择性学和药效学立体选择性(stereoselectivity)差异，使临床应用手性药品出现差异，使临床应用手性药品出现复杂性。复杂性。1.吸收吸收2.分布分布3.代谢代谢4.排泄排泄生物技术制药酶工程和手性药物第29页30这这种种差差异异例例子子很很多多。治治疗疗哮哮喘喘病病沙沙丁丁胺胺醇醇就就是是一一例例。它它有有效效对对映映体体药药理理活活性性要要比比另另一一对对映映体体大大80倍倍。又又比比如如，L-多多巴巴是是治治疗疗帕帕金金森森症症药药品品，作作为为“前前药药”摄摄入入病病人人体体内内，再再由由体体内内酶酶将将多多巴巴转转化化为为含含有有药药理理作作用用多多巴巴胺胺。因因为为人人体体内内酶酶对对该该“前前药药”多多巴巴是是专专一一性性，只只有有左左旋旋L-多多巴巴胺胺被被酶酶所所转转化化，所所以以，服服用用消消旋旋多多巴巴话话，右右旋旋多多巴巴不不被被酶酶所所转转化化，日日积积月月累累在在人人体体内内沉沉淀淀下下来来，势势必必对对病病人人造造成成新新危危害害。假假如如手手性性药药品品两两个个对对映映体体药药理理活活性性相相当当，它它们们毒毒副副作作用用无无差差异异，那就没有必要服用单一对映体药了。那就没有必要服用单一对映体药了。(-)-(R)-沙丁胺醇沙丁胺醇(-)-L-多巴多巴盖替沙星盖替沙星生物技术制药酶工程和手性药物第30页31(Timolol)是是已已知知作作用用最最强强b b-肾肾上上腺腺素素受受体体阻阻断断剂剂，作作用用强强度度为为普普萘萘洛洛尔尔(propranolol)8倍倍，临临床床用用于于治治疗疗高高血血压压、心心绞绞痛痛、青青光光眼眼等等。尤尤其其对对于于原原发发性性开开角角型型青青光光眼眼有有良良好好效效果果，优优于于传传统统降降眼眼压压药药。当当前前临临床床使使用用是是(S)-(-)-Timolo对对映映体体滴滴眼眼液液，对对于于哮哮喘喘病病人人禁禁用用，长长久久连连续续使使用用则则会会引引发发较较为为严严重重副副作作用用甚甚至至致致命命。(R)-(+)-Timolo对对映映体体在在动动物物试试验验上上其其对对b b-肾肾上上腺腺素素受受体体阻阻断断作作用用小小于于(S)-(-)-Timolol对对映映体体，不不过过在在降降低低眼眼压压方方面面其其作作用用降降低低不不多多。(S)-(-)-Timolol对对映映体体b b2受受体体阻阻断断作作用用是是(R)-(+)-Timolol对对映映体体49倍倍，其其收收缩缩支支气气管管作作用用是是(R)-(+)-Timolol对对映映体体13倍倍，但但其其降降低低眼眼压压作作用用仅仅为为(R)-(+)-Timolol对对映映体体4倍倍。因因而而(R)-(+)-Timolol对对映映体体有有可可能能成成为为比比(S)-(-)-Timolol更更为为安安全全、更更少少全全身身副副作作用用治治疗疗青青光光眼手性药品。眼手性药品。(R)-(+)-Timolol(S)-(-)-Timolol生物技术制药酶工程和手性药物第31页32(S)-普萘洛尔普萘洛尔,98倍倍(S)-萘普生萘普生,35倍倍(S)-奥美拉唑奥美拉唑L-多巴多巴右异环磷酰胺右异环磷酰胺(dexifosfamide)盖替沙星盖替沙星抗肿瘤药抗肿瘤药生物技术制药酶工程和手性药物第32页33盐酸舍曲林盐酸舍曲林(-)-酒石酸左啡诺酒石酸左啡诺右旋雷佐生右旋雷佐生(镇痛剂，比吗啡强镇痛剂，比吗啡强5倍倍)(减轻毒副作用减轻毒副作用)(+)(1R,3S)(-)(1S,3R)Azasetron罗格列酮罗格列酮30倍倍(5HTa受体拮抗剂受体拮抗剂)Tetrahedron Lett.,43,4951生物技术制药酶工程和手性药物第33页生物技术制药酶工程和手性药物第34页35手性药品政策与市场情况手性药品政策与市场情况手性药品政策与市场情况手性药品政策与市场情况近近年年来来许许多多国国家家药药政政部部门门对对手手性性药药品品开开发发、专专利利申申请请及及注注册册，开开始始作作出出对对应应要要求求。美美国国食食品品与与药药品品管管理理局局(FDA)在在1992年年政政策策要要求求：对对于于含含有有手手性性原原因因药药品品倾倾向向于于发发展展单单一一对对映映体体产产品品。随随即即又又表表示示勉勉励励把把已已在在销销售售外外消消旋旋药药品品转转化化为为手手性性药药品品称称为为“手手性性转转换换”；对对于于申申请请新新外外消消旋旋药药品品，则则要要求求对对两个对映体都必须提供详细生理活性和毒理数据，而不得作为相同物质对待。两个对映体都必须提供详细生理活性和毒理数据，而不得作为相同物质对待。据据美美国国C&EN刊刊物物在在1999年年报报道道，全全球球单单一一对对映映体体药药品品依依然然连连续续增增加加，年年销销售售亿亿到到达达964亿亿美美元元。到到年年，年年销销售售额额已已突突破破1300亿亿美美元元。按按1998年年统统计计。全全球球最最畅畅销销500种种药药中中，以以单单一一异异构构体体销销售售手手性性药药品品占占二二分分之之一一以以上上，占其总销售额占其总销售额52%。生物技术制药酶工程和手性药物第35页36手性药品带来市场效益及增加需求手性药品带来市场效益及增加需求手性药品带来市场效益及增加需求手性药品带来市场效益及增加需求年年手性药品销售手性药品销售1472亿美元亿美元年年手性药品销售手性药品销售1320亿美元，比亿美元，比1999年增加年增加13%1999年年手性药品销售手性药品销售1170亿美元亿美元1997年年 手性药品销售手性药品销售910亿美元，亿美元，比比1996年增加年增加21%1993年年 手性药品销售手性药品销售356亿美元，亿美元，比比1992年增加年增加22%1990年年 手性药品销售手性药品销售180亿美元亿美元1997年全世界年全世界100个热销药品中，个热销药品中，50个是单一对映体个是单一对映体(手性药品手性药品)100个热销药品个热销药品852亿美元亿美元50个手性药品个手性药品428亿美元亿美元而在而在1993年年97个热销药中，手性药品占个热销药中，手性药品占20%生物技术制药酶工程和手性药物第36页生物技术制药酶工程和手性药物第37页手性药品研究意义1临床药品1850种天然和半合成药品523种化学合成药品1327种非手性6种手性517种非手性799种手性528种以单个对映体给药509种以外消旋体给药8种以单个对映体给药61种以外消旋体给药467种生物技术制药酶工程和手性药物第38页反应停反应停:五十年恩怨五十年恩怨(R)-thalidomide(S)-thalidomide手性与人类健康手性与人类健康:“反应停反应停”悲剧悲剧生物技术制药酶工程和手性药物第39页沙利度胺沙利度胺S-异构体可造成严重致畸性异构体可造成严重致畸性1957年年1962年，造成数年，造成数万名婴儿严重畸形。万名婴儿严重畸形。深入研究表明，其致畸作深入研究表明，其致畸作用是由沙利度胺其中一个用是由沙利度胺其中一个异构体（异构体（S-异构体异构体）引发，）引发，而而R-构型即使大剂量使用，构型即使大剂量使用，也不会引发致畸作用。也不会引发致畸作用。图：沙利度胺另一个对映体可图：沙利度胺另一个对映体可造成造成严重致畸性。严重致畸性。生物技术制药酶工程和手性药物第40页“苦苦”“甜甜”生物技术制药酶工程和手性药物第41页药品手性原因1手性四面体手性碳手性硫手性叔胺生物技术制药酶工程和手性药物第42页药品手性原因2取代丙二烯类手性轴环芳香类手性平面取代联苯手性轴生物技术制药酶工程和手性药物第43页杀虫剂棉酚（Gossypol）及其对映体因分子中两个萘环之间存在阻转异构现象，含有手性轴，有左、右旋对映体。生物技术制药酶工程和手性药物第44页药品手性原因3l螺旋手性（Spiral Chirality）：左手螺旋和右手螺旋因旋转方向不一样，不能重合在一起。非平面性环状化合物能够认为是螺旋一部分，因而产生对映体。生物技术制药酶工程和手性药物第45页1,4-Benzodiazepines P螺旋 M螺旋 因为C2C3N4C5扭角方向不一样，为正角和负角，分别用P（plus）和M（minus）表示。虽为手性分子，但两种构象相互转变能垒不高，在室温下能够相互转化，故不表现光学活性。生物技术制药酶工程和手性药物第46页2.2手性药品表示方法1l左旋体和右旋体能使偏振光偏振面按顺时针方向旋转对映体称为右旋体（dextrotatory），在药名前用d或(+)表示；反之，称为左旋体（levorotatory），在药名前加l或()表示。外消旋体（racemate）则是由等量左旋体和右旋体组成，没有旋光性，在其药名前用dl或()表示。这种表示方法，直观地反应了对映体之间光学活性差异，不过不能提供药品分子三维空间排列或绝对构型信息。生物技术制药酶工程和手性药物第47页2.2手性药品表示方法2lD和L系统以标准参考物化学相关性来确定药品立体化学构型。标准参考物有糖类如D甘油醛，氨基酸如L丝氨酸。在RRXHC型光学异构体中，取其主链竖向排列，以氧化态较高或1号碳原子置于上方，照Fisher投影，在所得投影式中X在右边者称为D型，如D(+)甘油醛；X在左边者称为L型，如L()甘油醛；外消旋体表示为DL甘油醛。生物技术制药酶工程和手性药物第48页2.2手性药品表示方法2lD和L系统因为D/L构型表示法与表示旋光方向d和l轻易混同，且意义不甚明确，当前多限于糖和氨基酸立体化学命名。生物技术制药酶工程和手性药物第49页2.2手性药品表示方法3lR和S系统将手性中心取代基按原子序数依次排列，abcd，把d作为手性碳原子顶端，a、b、c为四面体底部3个角，从底部向顶端方向看，若保持从大到小基团按顺时针方向排列者，称为R型，若为逆时针方向排列者，称为S型。生物技术制药酶工程和手性药物第50页生物技术制药酶工程和手性药物第51页生物技术制药酶工程和手性药物第52页生物技术制药酶工程和手性药物第53页DeterminationofabsoluteconfigurationlXray diffraction(XRD)lVibrational circular dichroism(VCD)lOther methods生物技术制药酶工程和手性药物第54页DeterminationofenantiomericpuritylPolarimetrylNuclear magnetic resonance(NMR)lDirect enantioselective chromatography/electrophoresislIndirect enantioselective chromatography/electrophoresis生物技术制药酶工程和手性药物第55页2.3手性药品作用立体选择性l优对映体（eutomer,Eu）：一对对映体中与受体有较强亲和力或有较高药理活性一个对映体。l劣对映体（distomer,Dis）：一对对映体中与受体有较弱亲和力或有较低药理活性一个对映体。l优劣比（eudismic ratio,ER）：优对映体活性与劣对映体活性比值，是对映体药理作用立体特异性量度。优劣比值越大，立体特异性越高。l优劣指数（eudismic index,EI）：优劣比值对数，即logER。生物技术制药酶工程和手性药物第56页对映体优劣指数差异生物技术制药酶工程和手性药物第57页经验总结l比较优映体与外消旋体活性，四种情况：活性比 2（Eu Rac 2），劣映体为优映体竞争性拮抗剂，较少见活性比2（Eu Rac=2），只有优映体起作用而劣映体不发挥作用，手性化合物展现立体选择性活性比 2（Eu Rac 95%产产物物，普普通通要要用用GC或或HPLC代替旋光测定。代替旋光测定。（为何？）（为何？）需要标准旋光值需要标准旋光值（手册、文件？）（手册、文件？）旋光测定误差旋光测定误差（多大？）（多大？）生物技术制药酶工程和手性药物第104页 气相色谱手性固定相主要分为：气相色谱手性固定相主要分为：氢氢键键型型手手性性固固定定相相：如如一一些些氨氨基基酸酸衍衍生生物物固固定定相相，主主要要用用于于分分离离氨氨基基酸酸、羧羧酸酸、醇醇、胺胺、内内酯酯、内内酰酰胺胺等等对对映映体体化化合合物物，氢氢键键作作用用是是对对映映体体分分离离主主要要作作用力用力形形成成包包合合物物手手性性固固定定相相：环环糊糊精精衍衍生生物物手手性性固固定定相相用用于于分分离离稠稠环环烷烷烃烃、没没有有取取代代烯烯烃烃、卤卤代代烃烃、醇醇、醛醛、酮酮、胺胺、氰氰类类、环环氧氧化化合合物物、羧羧酸酸、卤卤代代酸酸、羟基酸、内酯和氨基酸等化合物对映体。羟基酸、内酯和氨基酸等化合物对映体。生物技术制药酶工程和手性药物第105页金金属属配配体体交交换换手手性性固固定定相相：一一些些金金属属离离子子(Eu、Rh、Ni、Mn、Cu等等)与与手手性性试试剂剂(如如樟樟脑脑酸酸衍衍生生物物，水水杨杨酸酸与与手手性性胺胺形形成成西西佛佛碱碱等等)所所形形成成配配位位化化合合物物。将将这这类类固固定定相相与与一一些些色色谱谱固固定定液液（如如鲨鲨鱼鱼烷烷）混混合合，涂涂到到毛毛细细管管柱柱上上分分离离烯烯烃烃、环环酮酮、醇醇、胺胺、环环氧氧化化合合物物、氨氨基基醇、氨基酸、羟基酸和卤代酸等化合物对映体醇、氨基酸、羟基酸和卤代酸等化合物对映体手手性性聚聚硅硅氧氧烷烷固固定定相相及及交交联联手手性性固固定定相相：以以聚聚硅硅氧氧烷烷为为基基质质，键键合合一一定定浓浓度度手手性性固固定定相相新新型型色色谱谱固固定定相相。这这一一类类固固定定相相改改进进了了手手性性固固定定相相耐耐温温性性，扩扩大大其其使使用用温温度度范范围围，促促进进涂涂渍渍性性能能。交交联联手手性性固固定定相相专专指指将将手手性性固固定定相相与与毛毛细细管管壁壁交交联联而而成成色色谱谱柱柱。交交联联毛毛细细管管柱柱普普通通含含有有耐耐溶溶剂剂冲冲洗洗、耐耐高高温温、寿寿命命长长、柱柱效效高高等等特特点，并在超临界流体色谱条件下使用。点，并在超临界流体色谱条件下使用。生物技术制药酶工程和手性药物第106页4.3.2 4.3.2 高效液相色谱高效液相色谱 手性固定相分类：手性固定相分类：选择基键合相（选择基键合相（Pirkle手性固定相）手性固定相）纤维素和多糖衍生物纤维素和多糖衍生物环糊精环糊精蛋白质键合相蛋白质键合相合成聚合物与分子烙印手性固定相合成聚合物与分子烙印手性固定相拆拆分分机机理理：氢氢键键、-键键、偶偶极极-偶偶极极、包包合合络络合合物物、配位交换、疏水和极性相互作用偶合。配位交换、疏水和极性相互作用偶合。生物技术制药酶工程和手性药物第107页选择基键合相（选择基键合相（PirklePirkle手性固定相）手性固定相）美美国国Illinois大大学学WHPirkle研研究究组组研研制制，所所以以又又称称Pirkle型型或或各各种种作作用用（multiple-interaction）手手性性固固定定相相，其其商商品品以以Brush-Type（刷刷性性）著著称称。在在手手性性液液相相色色谱谱领领域域，Pirkle型型CSP是是当当前前使使用用量量大大、适适用用面面广广、对对手手性性识识别别机机理理揭揭示示较较深深刻刻一一类类主主要要CSP。它它们们含含有有确确定定化化学学结结构构，其其共共同同结结构构特特征征是是在在手性中心附近最少含有以下基团之一：手性中心附近最少含有以下基团之一：（1）-酸酸或或-碱碱芳芳基基，含含有有给给体体-受受体体相相互互作作用用能能力力（电电子子转转移络合）。移络合）。（2）极性氢键给体极性氢键给体/受体。受体。（3）形成偶极相互作用极性基团。形成偶极相互作用极性基团。（4）大大致致积积非非极极性性基基团团，提提供供立立体体位位阻阻、范范德德华华作作用用或或构构型型控制作用。控制作用。生物技术制药酶工程和手性药物第108页 Pirkle型型手手性性柱柱分分为为酰酰胺胺型型和和脲脲型型CSP两两种种结结构构。它它普普通通用用于于正正相相色色谱谱体体系系，以以含含一一定定量量异异丙丙醇醇（0.220%）正正己己烷烷为为流流动动相相，有有时时也也采采取取四四氢氢呋呋喃喃和其它氢键受体溶剂。和其它氢键受体溶剂。它也用于反相体系分离强极性溶质。它也用于反相体系分离强极性溶质。Pirkle型型CSP优优点点是是柱柱效效和和柱柱容容量量高高，不不但但用用于于对对映映体体分分析析，也也可可用用于于对对映映体体制制备备分分离离。基基于于手手性性识识别别机机理理，可可预预测测对对映映体体洗洗脱脱次次序序，确确定定其其构构型型。其其不不足足是是被被分分离离溶溶质质大大部部分分需需衍衍生生以以引引入入芳芳基基等等手手性性识识别别所所需需基基团团；多多使使用用非非极极性性溶溶剂剂作作流流动动相相，溶溶解解度度可可能能限限制对一些溶质应用。制对一些溶质应用。生物技术制药酶工程和手性药物第109页S3R3S2R2t/min 2 4 6t/min2 4 6 8R1S1abChiral(S)LEU&(S)NEA column,flow rate 1.0 mL/min,wavelength detection 275nm.Mobile phase:a)nhexane/1,2dichloroethane/ethanol(97.5:2.45:0.05，v/v/v);b)nhexane/1,2dichloroethane/ethanol(86:12:2，v/v/v)生物技术制药酶工程和手性药物第110页纤维素和多糖衍生物纤维素和多糖衍生物 纤纤维维素素是是D（+）-葡葡萄萄糖糖单单元元由由1，4-糖糖苷苷键键形形成成高高度度有有序序、呈呈螺螺旋旋型型孔孔穴穴结结构构光光学学活活性性高高分分子子。但但天天然然纤纤维维素素手手性性拆拆分分能能力力不不高高，色色谱谱性性能能也也不不好，难于直接因为对映体拆分。好，难于直接因为对映体拆分。引入新基团对纤维素和多糖等天然手性高分子进行衍生改性，可制备性对纤维素和多糖等天然手性高分子进行衍生改性，可制备性能优良手性固定相。能优良手性固定相。三种形式：三种形式：凝胶颗粒；键合固定相和硅胶涂渍凝胶颗粒；键合固定相和硅胶涂渍。在当前在手性液相色谱中，纤维素及其衍生物大多涂渍在硅在当前在手性液相色谱中，纤维素及其衍生物大多涂渍在硅胶上使用。日本胶上使用。日本Diacel企业大量提供这类商品手性色谱柱。企业大量提供这类商品手性色谱柱。生物技术制药酶工程和手性药物第111页 研研究究表表明明，纤纤维维素素类类CSP手手性性识识别别取取决决于于聚聚合合物物螺螺旋旋型型孔孔穴穴“立立体体配配合合”（stericfit）包包结结作作用用，CSP通通道道对对芳芳环环有有较较高高亲亲和和力力，进进入入孔孔穴穴正正是是溶溶质质分分子子芳芳环环部部分分。氢氢键键、偶偶极极作作用用对对手手性性识识别别亦亦有有一一定定影影响响。大大部部分分可可拆拆分分对对映映体体最最少少含含有有一一个个芳芳环或可形成氢键羰基。环或可形成氢键羰基。纤纤维维素素CSP用用水水或或非非水水溶溶性性溶溶剂剂作作流流动动相相，除除少少数数例例外外，适适用用有有机机溶溶剂剂限限于于正正己己烷烷、异异丙丙醇醇、甲甲醇醇、乙乙醇醇。流流动动相相影影响响对对映映体体分分离离选选择择性性，非非极极性性溶溶剂剂通通常常比比甲甲醇醇/水水混混合合液液显显示示出出更更高高分离选择性。分离选择性。这这类类CSP含含有有应应用用范范围围广广，样样品品容容量量高高优优点点。缺缺点点是是柱柱效效低低，有有些些溶溶质质显显示示不不可可逆逆吸吸附附，且且多多为为涂涂渍渍柱柱，较较易易流流失失，对对所所用用溶溶剂剂有有一一定定限限制制。已已报报道道分分离离氨氨基基酸酸、醇醇、酮酮及及各各种种手手性性药药品品8085%是使用是使用OD、OJ和和AD柱柱.生物技术制药酶工程和手性药物第112页高效液相色谱拆分外消旋高效液相色谱拆分外消旋高效液相色谱拆分外消旋高效液相色谱拆分外消旋1-1-苯基乙醇类化合物苯基乙醇类化合物苯基乙醇类化合物苯基乙醇类化合物三苯甲酸酯纤维素手性色谱柱（三苯甲酸酯纤维素手性色谱柱（CHIRACELOB，I.D.4.6250mm）拆分）拆分1-苯基乙醇、苯基乙醇、1-苯基丙醇、苯基丙醇、2-氯氯-1-苯基乙醇苯基乙醇和和2-溴溴-1-苯基乙醇外消旋化合物，可用于监测不对称催化氢苯基乙醇外消旋化合物，可用于监测不对称催化氢化反应过程和测定产物对映体过剩值。（化反应过程和测定产物对映体过剩值。（厦门大学学报，厦门大学学报，1998，37（2）：）：309）(S)()苯乙醇(R)(+)苯乙醇 R：H，Cl，Br，CH3生物技术制药酶工程和手性药物第113页合成聚合物与分子烙印手性固定相合成聚合物与分子烙印手性固定相 合成手性聚合物合成手性聚合物CSP制备主要经过三种路径：制备主要经过三种路径：（1）在手性条件下不对称聚合；）在手性条件下不对称聚合；（2）采取手性单体；）采取手性单体；（3）手性分子烙印技术。）手性分子烙印技术。分分子子烙烙印印(imprinting)手手性性固固定定相相是是在在聚聚合合过过程程中中加加入入一一个个适适当当模模板板(template)分分子子，然然后后从从聚聚合合物物中中除除去去模模板板分分子子，流流下下一一个个“形形状状选选择择性性”(shapeselectivity)孔孔穴穴，形成适合于孔穴立体选择聚合物。形成适合于孔穴立体选择聚合物。生物技术制药酶工程和手性药物第114页4.3.3 4.3.3 毛细管电泳毛细管电泳毛毛细细管管电电泳泳(CE)是是20世世纪纪90年年代代在在手手性性分分离离方方面面得得到到广广泛泛应应用用和和高高度度重重视视一一项项高高效效能能分分离离技技术术。毛细管电泳分离对映体优点：毛细管电泳分离对映体优点：高分离效率有利于难分离对映体拆分高分离效率有利于难分离对映体拆分手性选择剂消耗量小，运行成本低手性选择剂消耗量小，运行成本低生物技术制药酶工程和手性药物第115页 以毛细管电泳分离对映体为例说明怎样提升以毛细管电泳分离对映体为例说明怎样提升物质分离度，分离方法优化路径。物质分离度，分离方法优化路径。思绪：思绪：毛细管电泳和常规电泳比较；毛细管电泳和常规电泳比较；对映体分离特点。对映体分离特点。毛细管电泳采取上万伏外电压进行电泳毛细管电泳采取上万伏外电压进行电泳增增大外加场；大外加场；存在问题：焦耳热增大，使分离过程物质带离散作用存在问题：焦耳热增大，使分离过程物质带离散作用增大，即熵增，区带增宽。增大，即熵增，区带增宽。毛细管电流较小，而散热面积很大，降低或抑毛细管电流较小，而散热面积很大，降低或抑制熵增；制熵增；使用手性添加剂或固定相，造成对映体间淌度或分使用手性添加剂或固定相，造成对映体间淌度或分配系数差异增大。配系数差异增大。生物技术制药酶工程和手性药物第116页1 1）环糊精及其衍生物环糊精及其衍生物环糊精及其衍生物环糊精及其衍生物环环糊糊精精及及其其衍衍生生物物惯惯用用作作毛毛细细管管区区带带电电泳泳手手性性添添加加剂剂。2）2)冠醚冠醚uhn等等将将含含有有4个个手手性性中中心心18-冠冠6-四四羧羧酸酸(18C6H4)作作手手性性添添加加剂剂,对对氨氨基基酸酸对对映映体体，重重酒酒石石酸酸去去甲甲肾肾上上腺腺素素，降降麻麻黄黄碱碱，phenylglycinol等进行了分离。等进行了分离。3）抗生素抗生素Armstrong等等将将大大环环抗抗生生素素利利福福霉霉素素B用用于于毛毛细细管管电电泳泳手手性性添添加加剂剂,对对18种种氨氨基基酸酸类类手手性性药药品品对对映映体体进进行行分分离离。最最近近他他们们发发觉觉糖糖肽肽类类抗抗生生素素ristocetinA,teicoplanin,vancomycin等等含含有有非常广泛对映体分离选择性非常广泛对映体分离选择性,可对上百种对映体进行成功分离。可对上百种对映体进行成功分离。4）蛋白质蛋白质蛋蛋白白质质也也被被成成功功地地用用于于毛毛细细管管电电泳泳手手性性分分离离。另另外外还还有有多多糖糖，手性表面活性剂，旋光金属配合物等也用作手性选择剂。手性表面活性剂，旋光金属配合物等也用作手性选择剂。生物技术制药酶工程和手性药物第117页毛细管区带电泳手性添加剂法分离毛细管区带电泳手性添加剂法分离异丙肾上腺素类药品异丙肾上腺素类药品环糊精及其衍生物惯用作毛细管区带电泳手性添加剂。环糊精及其衍生物惯用作毛细管区带电泳手性添加剂。异异丙丙肾肾上上腺腺素素为为碱碱性性化化合合物物，在在pH4%）轻易受样品量、温度和溶剂影响轻易受样品量、温度和溶剂影响文件上旋光值不够准确，经常改变文件上旋光值不够准确，经常改变光活性杂质对测定影响光活性杂质对测定影响最最近近有有文文件件报报道道，采采取取手手性性色色谱谱对对市市面面常常见见一一些些试试剂企业手性试剂分析，个别试剂纯度低于剂企业手性试剂分析，个别试剂纯度低于90%。(注明溶剂)生物技术制药酶工程和手性药物第125页手性色谱法手性色谱法 对对映映异异构构体体纯纯度度测测定定，如如e.e.值值（enantiomericexcess）测定：测定：在在用用色色谱谱法法测测定定e.e.值值时时，对对映映体体含含量量可可用用对对应应对对映映体体峰峰面积代替。面积代替。（为何？）（为何？）高高效效手手性性色色谱谱是是当当前前公公认认一一个个快快速速、灵灵敏敏、准准确确测测定定对对映映体纯度和对映体过剩值方法。体纯度和对映体过剩值方法。或生物技术制药酶工程和手性药物第126页测定对映异构体纯度其它方法测定对映异构体纯度其它方法核磁共振法核磁共振法手性衍生剂（手性衍生剂（CDA）手性镧系位移试剂（手性镧系位移试剂（CLSA）手性溶剂（手性溶剂（SA）同位素稀释法：同时测比旋光度