生物技术在食品致病微生物检测中的应用专家讲座.pptx

食品中致病微生物检测技术食品中致病微生物检测技术生物技术在食品致病微生物检测中的应用第1页食品中致病微生物检测技术食品中致病微生物检测技术分子生物学技术利用到有食品检测方面，分子生物学技术利用到有食品检测方面，主要是针对一些有害微生物核酸进行研究主要是针对一些有害微生物核酸进行研究经过核酸杂交和核酸合成等反应快速检测经过核酸杂交和核酸合成等反应快速检测样品中是否含有特定有害微生物，并深入样品中是否含有特定有害微生物，并深入确定其含量，其中最主要技术包含确定其含量，其中最主要技术包含PCR技技术、术、DNA探针技术和基因芯片技术。探针技术和基因芯片技术。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第2页1.聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）（1）传统）传统PCR技术技术聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reation,PCR)是是1985年诞生一项体外扩增年诞生一项体外扩增DNA方法，是在模板方法，是在模板DNA、引物和四种脱、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在条件下，依赖于氧核糖核苷酸存在条件下，依赖于DNA聚聚合酶酶促合成反应，体外扩增特异合酶酶促合成反应，体外扩增特异DNA片片段技术。经过对人工难以培养微生物对应段技术。经过对人工难以培养微生物对应DNA 或或RNA 片段扩增，检测扩增产物含量，片段扩增，检测扩增产物含量，从而快速对饲料中致病菌含量进行检测。从而快速对饲料中致病菌含量进行检测。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第3页李秀娟等（年）对李秀娟等（年）对117 株金黄色葡萄球菌株金黄色葡萄球菌nuc片段进行了片段进行了PCR 扩增和焦磷酸测序，结扩增和焦磷酸测序，结果显示所建立果显示所建立PCR 方法能对方法能对117 株金葡菌进株金葡菌进行准确检测，焦磷酸测序结果一致性深入验行准确检测，焦磷酸测序结果一致性深入验证了证了PCR 扩增结果特异性，说明该方法针对扩增结果特异性，说明该方法针对当前所用研究菌株而言，还未出现假阳性和当前所用研究菌株而言，还未出现假阳性和假阴性结果，含有较高特异性。假阴性结果，含有较高特异性。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第4页传统传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺技术在实际应用中表现出一些缺点，比如只能定性而不能定量地检测，且点，比如只能定性而不能定量地检测，且在有死细菌存在情况下轻易产生假阳性、在有死细菌存在情况下轻易产生假阳性、不能检测致毒微生物产生毒素等。不能检测致毒微生物产生毒素等。伴随各项新技术出现以及与伴随各项新技术出现以及与PCR技术有机技术有机结合，发展起来了一系列改进结合，发展起来了一系列改进PCR技术。技术。当前应用方法主要有实时荧光定量当前应用方法主要有实时荧光定量PCR、多重多重PCR以及以及PCR联合技术等。联合技术等。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第5页实时荧光定量实时荧光定量PCR实时定量实时定量PCR技术是指在技术是指在PCR反应体系中反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个测整个PCR进程，最终经过标准曲线对未进程，最终经过标准曲线对未知模板进行定量方法。该方法能够对知模板进行定量方法。该方法能够对GMO 进行定量分析，当前已被一些国家政府试进行定量分析，当前已被一些国家政府试验室采取。验室采取。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第6页杨柳等（年）依据沙门氏菌杨柳等（年）依据沙门氏菌fimY 基因序列基因序列设计引物和探针设计引物和探针,采取基因重组技术构建用采取基因重组技术构建用于沙门氏菌检测定量标准品，成功构建了于沙门氏菌检测定量标准品，成功构建了沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时沙门氏菌重组质粒标准品和沙门氏菌实时荧光定量荧光定量PCR 方法，含有很好特异性、敏方法，含有很好特异性、敏感性、稳定性和重复性。感性、稳定性和重复性。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第7页多重多重PCR多重多重PCR是常规是常规PCR方法改进，它是在同方法改进，它是在同一个反应中同时扩增两个或多个目标基因一个反应中同时扩增两个或多个目标基因序列。这种方法含有更大可靠性和适应性，序列。这种方法含有更大可靠性和适应性，而且能降低检测成本。徐伟等（年）针对而且能降低检测成本。徐伟等（年）针对单增李斯特菌转录调整子基因单增李斯特菌转录调整子基因prfA 和志贺和志贺氏菌侵袭性质粒抗原氏菌侵袭性质粒抗原H 基因基因ipaH 设计引物，设计引物，采取多重采取多重PCR 对两种致病菌进行同时判定，对两种致病菌进行同时判定，提供了一个快速且特异性高同时检测单增提供了一个快速且特异性高同时检测单增李斯特菌和志贺氏菌方法。李斯特菌和志贺氏菌方法。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第8页PCR联合技术联合技术传统传统PCR技术在实际应用中表现出一些缺点，采技术在实际应用中表现出一些缺点，采取一些新技术与取一些新技术与PCR结合，对结合，对PCR技术完善和发技术完善和发展提供了有力支持，并应用在致病菌检测中。展提供了有力支持，并应用在致病菌检测中。王永等（年王永等（年)探讨以探讨以16S rDNA 保守区段为保守区段为PCR扩扩增对象，利用增对象，利用SSCP技术对致泻大肠埃希氏菌、技术对致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽胞杆菌进沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及蜡样芽胞杆菌进行单链构象多态性分析，为食源性致病菌快速判行单链构象多态性分析，为食源性致病菌快速判定提供方法依据。定提供方法依据。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第9页刘成志等（年）依据志贺氏菌刘成志等（年）依据志贺氏菌ipaH 基因保守序列基因保守序列设计特异性引物，筛选适当设计特异性引物，筛选适当DNA 模板制备方法，模板制备方法，采取快速常规采取快速常规PCR 和定量实时和定量实时PCR 结合，对培结合，对培养液中及乳饮料阳性样品中志贺氏菌进行检测，养液中及乳饮料阳性样品中志贺氏菌进行检测，建立乳饮料中快速检测志贺氏菌有效方法。建立乳饮料中快速检测志贺氏菌有效方法。杨大伟等（年）应用杨大伟等（年）应用PCR 结合变性高效液相色谱结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术，以技术，以A 型肉毒梭菌型肉毒梭菌A 型肉毒神经型肉毒神经毒素基因作为靶基因设计特异性引物，毒素基因作为靶基因设计特异性引物，PCR 扩增扩增产物经产物经DHPLC 技术进行快速检测，最低检出限技术进行快速检测，最低检出限可到达为可到达为111ng/tube，该方法能够快速、准确检，该方法能够快速、准确检测测A 型肉毒梭菌。型肉毒梭菌。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第10页2.核酸探针技术核酸探针技术依据核酸探针中核苷酸成份不一样，可将依据核酸探针中核苷酸成份不一样，可将其分为其分为DNA探针、探针、RNA探针和寡核苷酸探探针和寡核苷酸探针，其中针，其中DNA探针是最惯用核酸探针。探针是最惯用核酸探针。DNA 探针技术又称分子杂交技术，是利用探针技术又称分子杂交技术，是利用DNA分子变性、复性以及碱基互补配正确分子变性、复性以及碱基互补配正确高度准确性，对某一特异性高度准确性，对某一特异性DNA序列进行序列进行探查新技术。探查新技术。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第11页微生物经过处理后固定于另一固相表面上微生物经过处理后固定于另一固相表面上,经洗涤变性后加入经洗涤变性后加入DNA探针进行杂交，探针进行杂交，DNA探针能够与同源性靶探针能够与同源性靶DNA进行互补性进行互补性结合，依据指示剂选取适当方法进行检测。结合，依据指示剂选取适当方法进行检测。当前，当前，DNA探针技术已经在沙门氏菌、产探针技术已经在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等检测中肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒等检测中得到了应用。得到了应用。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第12页续文彬续文彬(年年)针对单增李斯特氏菌针对单增李斯特氏菌hly部分基因设计部分基因设计探针，对肠炎沙门氏菌，大肠埃希氏菌，绿脓假探针，对肠炎沙门氏菌，大肠埃希氏菌，绿脓假单抱病菌，空肠单抱病菌，空肠/结肠弯曲杆菌等非单增李斯特氏结肠弯曲杆菌等非单增李斯特氏菌经杂交保护分析后，只有单增李斯特氏菌为阳菌经杂交保护分析后，只有单增李斯特氏菌为阳性结果，含有很好特异性。性结果，含有很好特异性。薛力刚等（年）经过吖啶酯标识核酸探针方法检薛力刚等（年）经过吖啶酯标识核酸探针方法检测病原菌，核酸探针与待检样品中金黄色葡萄球测病原菌，核酸探针与待检样品中金黄色葡萄球菌菌rRNA 序列进行杂交，形成稳定序列进行杂交，形成稳定DNA:RNA 杂杂交体，使用碱液破坏未杂交探针，在碱性过氧化交体，使用碱液破坏未杂交探针，在碱性过氧化氢中检测发光。核酸探针法检测金黄色葡萄球菌氢中检测发光。核酸探针法检测金黄色葡萄球菌大大缩短了检测周期，且特异性和敏感性较高，大大缩短了检测周期，且特异性和敏感性较高，为金黄色葡萄球菌判定提供了一个新方法。为金黄色葡萄球菌判定提供了一个新方法。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第13页3.基因芯片技术基因芯片技术基因芯片主要原理是指将各种基因寡核苷基因芯片主要原理是指将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经经PCR扩增后制备荧光标识探针，然后再与扩增后制备荧光标识探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最终经过检测杂芯片上寡核苷酸点杂交，最终经过检测杂交信号强度及分布确定检测样品中特定微交信号强度及分布确定检测样品中特定微生物存在。与传统微生物检测方法相比，生物存在。与传统微生物检测方法相比，基因芯片技术先进性主要表达在高通量检基因芯片技术先进性主要表达在高通量检测、简便快速、敏感性高等方面，是食品测、简便快速、敏感性高等方面，是食品安全方面重大技术突破。安全方面重大技术突破。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第14页 陈昱等陈昱等(年年)利用芯片技术对志贺氏菌等利用芯片技术对志贺氏菌等26株食源株食源性微生物进行检测，最终成功建立了检测和判定性微生物进行检测，最终成功建立了检测和判定志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌志贺氏菌、沙门氏菌、大肠杆菌O157方法，为方法，为3种食源性致病菌快速检测和判定提供了准确、快种食源性致病菌快速检测和判定提供了准确、快速、灵敏方法。速、灵敏方法。贺晨等（年）筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤贺晨等（年）筛选志贺氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌寒沙门氏菌、大肠杆菌O157等等11种特异基因作为种特异基因作为目标基因，建立了一个利用多重目标基因，建立了一个利用多重PCR 方法结合基方法结合基因芯片技术快速、准确检测因芯片技术快速、准确检测11 种常见致病菌方法，种常见致病菌方法，为流行病学调查和传染性疾病早期诊疗和判定提为流行病学调查和传染性疾病早期诊疗和判定提供了一个有效检测伎俩。供了一个有效检测伎俩。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第15页 陆长勇（年）针对金黄色葡萄球菌、副溶陆长勇（年）针对金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌、单核细胞增生李斯特菌等血弧菌、单核细胞增生李斯特菌等8种常见种常见食源性致病菌建立了基于单碱基延伸标签食源性致病菌建立了基于单碱基延伸标签反应原理基因芯片检测方法，其灵敏度可反应原理基因芯片检测方法，其灵敏度可到达到达0.1pg，以鼠伤寒沙门氏菌为单一检测，以鼠伤寒沙门氏菌为单一检测对象细菌纯培养物灵敏度可到达对象细菌纯培养物灵敏度可到达5102 CFU/mL。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第16页结语结语生物技术因其低成本、高效、高通量和高生物技术因其低成本、高效、高通量和高特异性等特点已经渗透着食品检测领域，特异性等特点已经渗透着食品检测领域，其优越性日趋显著，成为未来食品安全检其优越性日趋显著，成为未来食品安全检测中主力军。但每种方法难免有其不足，测中主力军。但每种方法难免有其不足，在应用中需依详细需要进行选择或搭配使在应用中需依详细需要进行选择或搭配使用，也期待各种方法优化和新技术新方法用，也期待各种方法优化和新技术新方法问世，从而为人们赖以生活食品提供安全问世，从而为人们赖以生活食品提供安全和营养可靠保障。和营养可靠保障。生物技术在食品致病微生物检测中的应用第17页参考文件1 李秀娟,徐保红,田会方等.基于PCR金葡菌准确检测方法建立及应用J.中国人兽共患病学报,25(5):442-445.2 杨柳,苏明权,马越云等.荧光定量RT-PCR 检测沙门氏菌方法建立J.中国试验诊疗学,15(1),17-20.3徐伟,刘军,李素芳.单增李斯特菌与志贺氏菌多重PCR 检测技术建立J.中国食品学报,9(1):201-207.4 王永,赵新，兰青阔，朱珠,程奕.4种食源性致病菌PCR-SSCP检测技术研究J.天津农业科学,15(1):13-15.5 刘成志，钱凯，李洁莉等.乳饮料中志贺氏菌快速PCR检测技术研究J.研究汇报,(1):1-5.生物技术在食品致病微生物检测中的应用第18页6杨大伟,刘云国,谭乐义.食品中A型肉毒梭菌PCR-DHPLC检测方法建立J.食品工业科技,(6):398-400.7 续文彬.单增李斯特氏菌液相核酸探针检测方法建立与初步应用.吉林农业大学硕士学位论文,28-31.8 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