生物物证常见技术公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

第三章第三章 生物物证常见技术生物物证常见技术第一节第一节 电泳技术电泳技术第二节第二节 层析法层析法第三节第三节 比色分析技术比色分析技术第四节第四节 离心技术离心技术第五节第五节 显微镜技术显微镜技术第1页第1页第一节第一节 电泳技术电泳技术电泳是指在电场中带电粒子向电泳是指在电场中带电粒子向电性相反方向发生位移现象。是蛋电性相反方向发生位移现象。是蛋白质、核酸分析鉴定主要技术之一。白质、核酸分析鉴定主要技术之一。第2页第2页电泳原理电泳原理v在同一电泳条件下，不同带电颗粒因其分子大小和带电量不同含有不同泳动速度。因此电泳一定时间，就能相互分开。第3页第3页电泳分类电泳分类 v自由界面电泳：电泳能够直接将样品放在缓冲液中进行。v区带电泳：将样品放在固体支持物上进行电泳，因待测样品各组分泳动率不同被分离成不同区带。第4页第4页区带电泳分类区带电泳分类v（一）据电场强度分：高压；常压；低压。v（二）据支持物种类分：滤纸；醋酸纤维薄膜；琼脂糖凝胶；聚丙烯酰胺凝胶。v（三）据支持物形状分：水平板；垂直板；柱状；圆盘；U形管；毛细管。v（四）据原理分：等速；免疫；等电聚焦。v（五）据方向分：单向；双向。v（六）据目分：分析；制备。v（七）据缓冲液pH分：连续pH；非连续pH。第5页第5页电泳槽电泳槽电泳仪第6页第6页第7页第7页第8页第8页电泳环节电泳环节v电泳普通操作程序包括支持物准备、加电泳普通操作程序包括支持物准备、加样、电泳、固定、染色、脱色、定性观样、电泳、固定、染色、脱色、定性观测及定量测定等过程。测及定量测定等过程。请观看视频请观看视频第9页第9页v1、高压电极槽与进样机构 2、填灌清洗机构 3、毛细管 4、检测器 5、铂丝电极 6、低压电极槽 7、恒温机构 8、统计/数据处理 第10页第10页第11页第11页第二节第二节 层析法层析法v全部层析系统都由两个相组成：一是固定相，另一是流动相。当待分离混合物随流动相经过固定相时，因为各组分理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）能力不同，在两相中分派（含量比）不同，且随流动相向前移动，各组分不停地在两相中进行再分派。分部搜集流出液，可得到样品中所含各单一组分，从而达到将各组分分离目标。第12页第12页第13页第13页第14页第14页层析操作层析操作第15页第15页第16页第16页第17页第17页第18页第18页第19页第19页第20页第20页第三节第三节比色技术比色技术v分光光度法是通过测定被测物质在分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光吸特定波长处或一定波长范围内光吸光度或发光强度，对该物质进行定光度或发光强度，对该物质进行定性和定量分析办法。性和定量分析办法。第21页第21页比色技术分类比色技术分类v光谱分析技术可分为发射光谱、吸取光谱和光谱分析技术可分为发射光谱、吸取光谱和散射光谱三大类。基于发射光谱分析办法有散射光谱三大类。基于发射光谱分析办法有火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法，火焰光度法、原子发射光谱法和荧光光谱法，基于吸取光谱分析办法有紫外基于吸取光谱分析办法有紫外-可见光分光可见光分光光度法，原子吸取分光光度法和红外光谱法；光度法，原子吸取分光光度法和红外光谱法；基于散射光谱分析办法有比浊法。基于散射光谱分析办法有比浊法。第22页第22页vA=abcv式中式中A为吸光度，为吸光度，b为溶液层厚度（为溶液层厚度（cm），），c为溶液浓度（为溶液浓度（g/dm3)，a为吸光系数。为吸光系数。v当固定溶液层厚度当固定溶液层厚度l和吸光系数和吸光系数a时，吸光时，吸光度度A与溶液浓度成线性关系。与溶液浓度成线性关系。第23页第23页比色仪器比色仪器v紫外分光光度计，可见分光光度计（或紫外分光光度计，可见分光光度计（或比色计）、红外分光光度计或原子吸取比色计）、红外分光光度计或原子吸取分光光度计。分光光度计。第24页第24页722第25页第25页第四节第四节离心技术离心技术v离心技术是试验室常采取技术，主要是利用离心力将悬浮液中悬浮微粒快速沉降，借以分离比重不同各种物质成份方法。第26页第26页vF重力浮力重力浮力VPgVgVg（p）v式中式中:vF下沉力；下沉力；vV微粒体积；微粒体积；vP微粒密度；微粒密度；v介质密度；介质密度；vg重力加速度。重力加速度。v当当P时，微粒下沉；时，微粒下沉；P与与差值差值越大，微粒下沉速度越快。因此，加大离心越大，微粒下沉速度越快。因此，加大离心机转速可加快离心微粒沉降速度机转速可加快离心微粒沉降速度第27页第27页离心机分类离心机分类v（一）依据转速 分类v1、常速离心机：转速少于 5000r/min，用于普通液体可沉淀颗粒分离，或制备普通组织匀浆。v2、高速离心机：转速 5000-25000r/min，用于细胞器分离和生物大分子制备。v3、超速离心机：转速超出 25000-85000r/min，多用于亚细胞结构分离和生物大分子制备。v第28页第28页v（二）依据温度 分类v1、常温离心机：室温（25 ）下工作。常速离心时使用。v2、低温离心机：在 4 下工作。高速离心时使用。v3、冷冻离心机：在 0 25 工作。超速离心时使用。第29页第29页v（三）依据体积大小和放置方式分类（三）依据体积大小和放置方式分类1 1、台式离心机：体积小，放在操作台上，、台式离心机：体积小，放在操作台上，用于微量物质提取。用于微量物质提取。2 2、落地式离心机：体积大，放在地面上，、落地式离心机：体积大，放在地面上，用于大量物质提取。用于大量物质提取。第30页第30页v（四）依据供能方式（四）依据供能方式 分类分类1 1、自动式离心机：设置程序后，电脑程、自动式离心机：设置程序后，电脑程序控制离心速度和时间。序控制离心速度和时间。2 2、电动式离心机：由操作者接通电源、电动式离心机：由操作者接通电源、利用旋钮控制离心速度和时间离心机。利用旋钮控制离心速度和时间离心机。3 3、手动式离心机：、手动式离心机：第31页第31页第五节显微镜技术第32页第32页一、创造一、创造 最早显微镜是16世纪末期在荷兰制造出来。创造者也许是札恰里亚斯詹森（眼镜商）或汉斯利珀希（科学家），他们用两片透镜制作了简易显微镜，但并没有用于观测。第一个使用者是伽利略。第二个是荷兰商人安东尼凡列文虎克。1931年，恩斯特鲁斯卡研制了电子显微镜，1986年他被授予诺贝尔奖。第33页第33页二、分类二、分类（一）（一）光学显微镜光学显微镜：通常皆由光学部分、照明部分和：通常皆由光学部分、照明部分和机械部分构成。当前光学显微镜主要有机械部分构成。当前光学显微镜主要有明视野显微明视野显微镜镜（普通光学显微镜）、（普通光学显微镜）、暗视野显微镜暗视野显微镜、荧光显微荧光显微镜镜、相差显微镜相差显微镜、激光扫描共聚焦显微镜激光扫描共聚焦显微镜、偏光显偏光显微镜微镜、微分干涉差显微镜微分干涉差显微镜、倒置显微镜倒置显微镜。（二）电子（二）电子显微镜显微镜：有与光学显微镜相同基本结构特：有与光学显微镜相同基本结构特性，但它将电子流作为一个新光源，使物体成像。性，但它将电子流作为一个新光源，使物体成像。可把物体放大到可把物体放大到200万倍。种类有万倍。种类有扫描电镜扫描电镜、分析、分析电镜、超高压电镜等。电镜、超高压电镜等。第34页第34页三、显微镜使用办法三、显微镜使用办法v1.对光：对光：（1）将低倍镜转至镜筒下方与镜筒成始终线。）将低倍镜转至镜筒下方与镜筒成始终线。（2）拨动反光镜，调整至视野最亮无阴影。反光镜有）拨动反光镜，调整至视野最亮无阴影。反光镜有平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要平、凹两面，光源强时用平面，较暗时用凹面，需要强光时，将聚光器提升，光圈放大；需要弱光时，将强光时，将聚光器提升，光圈放大；需要弱光时，将聚光器减少，或光圈适当缩小。聚光器减少，或光圈适当缩小。（3）将待观测标本置载物台上，转动粗调整器使镜筒）将待观测标本置载物台上，转动粗调整器使镜筒下降至接物镜靠近标本。于转动粗调整器同时，须俯下降至接物镜靠近标本。于转动粗调整器同时，须俯身在镜旁仔细观测接物镜与标本之间距离。身在镜旁仔细观测接物镜与标本之间距离。（4）左眼于接目镜观测，同时左手转动粗调整，使镜）左眼于接目镜观测，同时左手转动粗调整，使镜筒渐渐上升以调整焦距，使视野内物象看到上时即停，筒渐渐上升以调整焦距，使视野内物象看到上时即停，再调微调整器，至标本清楚为止。再调微调整器，至标本清楚为止。第35页第35页v2接物镜使用及光线调整：接物镜使用及光线调整：显微镜普通含有三个接物镜，即低倍、显微镜普通含有三个接物镜，即低倍、高倍及油镜，固定于接物镜转换盘孔中。高倍及油镜，固定于接物镜转换盘孔中。观测标本时，观测标本时，先先使用使用低倍低倍接物镜，此时，接物镜，此时，视野较大，标本较易查出，但放大倍数视野较大，标本较易查出，但放大倍数较小。较小。后高倍后高倍接物镜放大倍数较大，能接物镜放大倍数较大，能观测微小物体或结构。观测微小物体或结构。再再使用使用油镜油镜观测，观测，普通加一滴油后直接将油镜头浸入油滴普通加一滴油后直接将油镜头浸入油滴中进行镜检观测。中进行镜检观测。第36页第36页v3低倍、高倍、油镜头辨认：（1）标明放大倍数10，40，100，或10/0.25，40/0.65，100/1.30。（2）低倍镜最短，高倍镜较长，油镜最长。（3）镜头前面镜孔低倍镜最大，高倍镜较大，油镜最小。（4）油镜头上常刻有黑色环圈，或“油”字。第37页第37页v4（1）光线对好后，移动推动器寻找需要观）光线对好后，移动推动器寻找需要观测标本。测标本。（2）如标本体积较大，不能清楚查见其结）如标本体积较大，不能清楚查见其结构因而不能确认时，则将标本移至视野中构因而不能确认时，则将标本移至视野中央，再旋转高倍接物镜于镜筒下方。央，再旋转高倍接物镜于镜筒下方。（3）旋转微调整器至物象清楚为止。）旋转微调整器至物象清楚为止。（4）调整聚光器及光圈，使视野内物象达）调整聚光器及光圈，使视野内物象达到最清楚程度。到最清楚程度。第38页第38页v5油镜使用办法：油镜使用办法：（1）原理：）原理：v油镜透气孔最小，这样进入光线就少，物体油镜透气孔最小，这样进入光线就少，物体不易看清楚。不易看清楚。v同时又因自玻片透过光线，由于发生了折射同时又因自玻片透过光线，由于发生了折射散光，因此射入镜头光线就更少，物体更看散光，因此射入镜头光线就更少，物体更看不清楚。不清楚。v采用一个采用一个和玻片折光率相靠近介质如香柏油和玻片折光率相靠近介质如香柏油，加于标本与玻片之间，使光线不通过空气，加于标本与玻片之间，使光线不通过空气，这样射入镜头光线就较多，物象就看得清楚。这样射入镜头光线就较多，物象就看得清楚。第39页第39页v（2）油镜使用：）油镜使用：a将光线调至最强（聚光器提升，光圈开将光线调至最强（聚光器提升，光圈开放）。放）。b转粗调整器使镜筒上升，滴香柏油转粗调整器使镜筒上升，滴香柏油1小小滴于接物镜正下方标本上。滴于接物镜正下方标本上。c转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下转动接物镜转换盘，使油镜头于镜筒下方。方。d俯身镜旁侧面在肉眼观测下，转动粗调俯身镜旁侧面在肉眼观测下，转动粗调整器使油镜头渐渐下降浸入香柏油内，轻整器使油镜头渐渐下降浸入香柏油内，轻轻接触玻片为止。轻接触玻片为止。第40页第40页e慢慢转动粗调整器，使油镜头渐渐上慢慢转动粗调整器，使油镜头渐渐上升至见到标本物象为止。升至见到标本物象为止。f转动微调整器，使视野物象达到最清转动微调整器，使视野物象达到最清程度。程度。g左手渐渐移动推动器，并转动微调整左手渐渐移动推动器，并转动微调整器以观测标本。器以观测标本。h标本观测完毕后，转动粗调整器将镜标本观测完毕后，转动粗调整器将镜筒升起，取下标本玻片。马上用擦镜纸筒升起，取下标本玻片。马上用擦镜纸将镜头上香柏油擦净。将镜头上香柏油擦净。第41页第41页v6注意事项：注意事项：（1）使用显微镜之前，应熟悉显微镜各）使用显微镜之前，应熟悉显微镜各部名称及使用办法，尤其应掌握辨认三部名称及使用办法，尤其应掌握辨认三种接物镜之特性。种接物镜之特性。（2）观测无色和颜色较浅标本时，必须）观测无色和颜色较浅标本时，必须注意光线调整。注意光线调整。（3）新鲜标本观测时，须加盖玻片，以）新鲜标本观测时，须加盖玻片，以免标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀接免标本因蒸发而干燥变形或污染侵蚀接物镜，同时可使标本表面匀平，光线得物镜，同时可使标本表面匀平，光线得以集中，有助于观测。以集中，有助于观测。第42页第42页四、显微镜保养四、显微镜保养v1显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧显微镜在从木箱中取出或装箱时，右手紧握镜臂，左手稳托镜座，轻轻取出。不要只握镜臂，左手稳托镜座，轻轻取出。不要只用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻轻用一只手提取，以防显微镜坠落，然后轻轻放在实习台上或装放在实习台上或装入木箱内。入木箱内。v2显微镜放到实习台上时，先放镜座一端，显微镜放到实习台上时，先放镜座一端，再将镜座所有放稳，切不可使镜座全面同时再将镜座所有放稳，切不可使镜座全面同时与台面接触，这样震动过大，透镜和微调整与台面接触，这样震动过大，透镜和微调整器装置易损坏。器装置易损坏。v3显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘显微镜须经常保持清洁，勿使油污和灰尘附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，附着。如透镜部分不洁时，用擦镜纸轻擦，如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。如有油污，先将擦镜纸蘸少许二甲苯拭去。第43页第43页v4显微镜不能在阳光下暴晒和使用。显微镜不能在阳光下暴晒和使用。v5接目镜和接物镜不要随便抽出和卸下必须接目镜和接物镜不要随便抽出和卸下必须抽取接目镜时，须将镜筒上口净用布遮盖，抽取接目镜时，须将镜筒上口净用布遮盖，避免灰尘落入镜筒内。更换接物镜时，卸下避免灰尘落入镜筒内。更换接物镜时，卸下后应倒置在清洁台面下，并随后装入木箱置后应倒置在清洁台面下，并随后装入木箱置放接物镜管内。放接物镜管内。v6显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降显微镜用完后，取下标本片，经聚光器降下，再将物镜转成下，再将物镜转成“八八”字形，转动粗调整字形，转动粗调整器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器相碰。器使镜筒下降，以免接物镜与聚光器相碰。v7显微镜应放在干燥地方，以防生霉。显微镜应放在干燥地方，以防生霉。第44页第44页