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Advanced Enzyme Advanced Enzyme EngineeringEngineering第九章第九章 生物酶工程生物酶工程第1页第1页Contents一、生物酶工程定义二、生物酶工程内容三、生物酶工程前景GoGoGo第2页第2页 生物酶工程生物酶工程是酶学和以基因重组技术是酶学和以基因重组技术为主当代分子生物学技术相结合产物，亦为主当代分子生物学技术相结合产物，亦称高级酶工程称高级酶工程(Advanced Enzyme(Advanced Enzyme Engineering)Engineering)。一、一、生物酶工程生物酶工程1.1.定义定义第3页第3页二、二、生物酶工程内容生物酶工程内容（3 3）从蛋白质或基因水平上设计，合成酶杂合从蛋白质或基因水平上设计，合成酶杂合体或自然界不曾有酶（杂合酶）。体或自然界不曾有酶（杂合酶）。生物酶工程主要包括：生物酶工程主要包括：（1 1）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）；（2 2）修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；修饰酶基因产生遗传修饰酶（突变酶）；第4页第4页（4 4）抗体酶抗体酶；（5 5）核酶核酶。第5页第5页 通过基因工程手段，克隆各种天然酶基因，将通过基因工程手段，克隆各种天然酶基因，将其克隆到表示载体中，然后将表示载体转化到适当其克隆到表示载体中，然后将表示载体转化到适当宿主中，得到表示特定酶基因工程菌，通过基因工宿主中，得到表示特定酶基因工程菌，通过基因工程菌繁殖大量产生酶称为程菌繁殖大量产生酶称为克隆酶克隆酶。1.克隆酶克隆酶（1 1）克隆酶定义：）克隆酶定义：第6页第6页克隆酶图例克隆酶图例基因工程菌基因工程菌载体载体宿主宿主生物体生物体发酵发酵克隆酶克隆酶酶基因酶基因第7页第7页 外源基因转入微生物宿主细胞内，与宿主外源基因转入微生物宿主细胞内，与宿主细胞遗传物质相结合，后代宿主遗传物质中含细胞遗传物质相结合，后代宿主遗传物质中含有外源基因，这种带上人工赋予新遗传特性宿有外源基因，这种带上人工赋予新遗传特性宿主微生物，被称为主微生物，被称为基因工程菌基因工程菌。2.2.基因工程菌定义基因工程菌定义第8页第8页（1 1）在宿主细胞内能够自主复制；在宿主细胞内能够自主复制；（2 2）克隆酶对载体要求）克隆酶对载体要求（2 2）容易引入受体细胞；）容易引入受体细胞；（3 3）含有适当筛选标识基因；含有适当筛选标识基因；（4 4）含有少数限制性酶切位点。含有少数限制性酶切位点。第9页第9页（3 3）克隆酶对宿主要求克隆酶对宿主要求（1 1）安全可靠，非致病菌；）安全可靠，非致病菌；（3 3）有助于酶分离和纯化；）有助于酶分离和纯化；（5 5）容易培养和管理。）容易培养和管理。（4 4）能利用廉价原料，发酵周期短，产量高；）能利用廉价原料，发酵周期短，产量高；（2 2）外源基因在宿主内能够表示且不被分解；）外源基因在宿主内能够表示且不被分解；第10页第10页（4 4）克隆酶基因表示系统克隆酶基因表示系统o原核生物基因表示系统原核生物基因表示系统o真核生物基因表示系统真核生物基因表示系统 1.1.酵母表示系统酵母表示系统 2.2.植物表示系统植物表示系统 3.3.动物表示系统动物表示系统 4.4.丝状真菌表示系统丝状真菌表示系统第11页第11页 纤维素酶基因工程菌构建纤维素酶基因工程菌构建（5 5）克隆酶实例克隆酶实例第12页第12页v 纤维素酶纤维素酶 纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行纤维素酶在食品、饲料、造纸、纺织等行业含有广泛用途。但由于天然纤维素酶产量低、业含有广泛用途。但由于天然纤维素酶产量低、起源有限而造成其大规模应用受到限制。起源有限而造成其大规模应用受到限制。纤维素酶纤维素酶（cellulasecellulase）是能将纤维素水解）是能将纤维素水解为葡萄糖等简朴糖类一组酶总称。为葡萄糖等简朴糖类一组酶总称。第13页第13页|为此，通过基因工程技术，克隆福寿螺体内为此，通过基因工程技术，克隆福寿螺体内纤维素酶基因，构建含有纤维素酶基因，构建含有celcel基因工程菌，以期基因工程菌，以期通过液体培养或固体培养方式得到大量克隆纤维通过液体培养或固体培养方式得到大量克隆纤维素酶。素酶。第14页第14页afp基因转化受体转化受体低温筛选低温筛选l技术路线技术路线1 1A.bgpdL.egpdV.vgpd+表示表示载体载体PEGPEG介导转化介导转化农杆菌介导转化农杆菌介导转化电激转化电激转化分子鉴定分子鉴定原生质体原生质体或菌丝球或菌丝球建立转化体系低温筛选体系建立第15页第15页l技术路线技术路线2 2CelCel基因工程基因工程菌株筛选菌株筛选液体液体发酵发酵分离纯化分离纯化第16页第16页 定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪定义：利用有控制地对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，从而改变这些酶催化特切、修饰或突变，从而改变这些酶催化特性、底物专一性或稳定性，使之愈加符合性、底物专一性或稳定性，使之愈加符合人们需要。人们需要。2.2.突变酶突变酶第17页第17页遗传修饰改变酶性能大体有：遗传修饰改变酶性能大体有：（1）提升酶活性）提升酶活性 （2）提升酶稳定性）提升酶稳定性（3）改变底物专一性）改变底物专一性 （4）改变酶最适）改变酶最适pH值值（5）改变酶对辅酶要求）改变酶对辅酶要求（6）改变酶别构调整能力）改变酶别构调整能力第18页第18页修饰酶基因办法主要办法修饰酶基因办法主要办法 （i）定位突变）定位突变 （ii）体外定向进化）体外定向进化 第19页第19页 定位突变（定位突变（site-directed mutagenesis）是依据是依据酶结构、功效和作用机制信息，在基因水平上准酶结构、功效和作用机制信息，在基因水平上准确改变酶分子中氨基酸残基，确改变酶分子中氨基酸残基，对酶性质和其催化对酶性质和其催化特性进行改造，产生符合特定需要酶特性进行改造，产生符合特定需要酶。（i i）定位突变）定位突变第20页第20页l盒式诱变盒式诱变l寡聚苷酸引物诱变寡聚苷酸引物诱变lPCR诱变诱变办法：办法：第21页第21页（1 1）盒式诱变）盒式诱变o原理原理：利用一段人工合成含有突变序列寡聚核甘酸片利用一段人工合成含有突变序列寡聚核甘酸片段（寡核甘酸盒，段（寡核甘酸盒，Oligonucleotide Cassette），取代野），取代野生型基因中相应序列。生型基因中相应序列。第22页第22页HindIIIEcoRIHindIIIEcoRI+第23页第23页（2 2）寡聚苷酸引物诱变）寡聚苷酸引物诱变o原理原理：用化学合成含有突变碱基寡核甘酸短片段作为用化学合成含有突变碱基寡核甘酸短片段作为引物，启动单链引物，启动单链DNA分子进行复制，生产出来新链中分子进行复制，生产出来新链中目的基因特定位点含有已经发生突变碱基序列。目的基因特定位点含有已经发生突变碱基序列。第24页第24页A转化GTAGAATCGCTTCTACTAGGCTAP标识筛选分离突变体第25页第25页（3 3）PCRPCR诱变诱变o定点诱变法定点诱变法o大引物诱变法大引物诱变法特点：能够在特点：能够在DNADNA区段任何部位产生定点突变。区段任何部位产生定点突变。第26页第26页o原理：在头两轮PCR反应中，应用两个互补并在相同部位含有相同碱基突变内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重合双链DNA片段，二者在其重合区段含有一样突变。故此两条双链DNA片段经变性和退火处理，形成两种不同形式异源双链分子。然后选取两个外测寡核甘酸引物进行第三轮PCR扩增，可得到一个含有突变位点突变体DNA。第27页第27页第28页第28页5353靶DNA片段5533混合、变性、退火定定点点诱诱变变法法第29页第29页5353大引物大引物诱变法诱变法5533大引物大引物PCRPCRPCR多次循环PCR第30页第30页一理论起源一理论起源o利用基因工程原理能够在试验室中模拟生物进化过程利用基因工程原理能够在试验室中模拟生物进化过程 n化学进化化学进化n生物进化生物进化（iiii）体外定向进化）体外定向进化第31页第31页第32页第32页第33页第33页 人为地创造特殊进化条件，模拟自然进化机人为地创造特殊进化条件，模拟自然进化机制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个制，在体外对基因进行随机突变，从一个或多个已经存在亲本酶（天然或者人为取得）出发，通已经存在亲本酶（天然或者人为取得）出发，通过基因突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过基因突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定筛选或选择办法最后取得预先盼望含有一过一定筛选或选择办法最后取得预先盼望含有一些特性进化酶些特性进化酶分子进化技术称为分子进化技术称为体外定向进化体外定向进化。体外定向进化体外定向进化第34页第34页定向进化示意图定向进化示意图细菌细菌诱发突变原诱发突变原因因5050 0 0C C培养培养突变体库突变体库选择压力选择压力（温度）（温度）温度耐受型突温度耐受型突变体变体最适生长温度为最适生长温度为37370 0C C最适生长温度提升了！最适生长温度提升了！随机突变随机突变+定向选择目的突变体定向选择目的突变体第35页第35页 Strategies for the development of effective enzymes第36页第36页定向进化定向进化n属于蛋白质非合理设计，它不需要事先理解酶空属于蛋白质非合理设计，它不需要事先理解酶空间结构和催化机制，人为地创造特殊进化条件，间结构和催化机制，人为地创造特殊进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质突变酶。选）出所需性质突变酶。第37页第37页定向进化随机突变选择定向进化随机突变选择第38页第38页第39页第39页第40页第40页澄清一个事实：定向进化澄清一个事实：定向进化不是不是定点突变定点突变o定向进化：突变定向进化：突变 筛选筛选 突变位点是随机，不拟定；突变位点是随机，不拟定；突变位点数目也是不拟定；突变位点数目也是不拟定；突变效应更是不可预知；突变效应更是不可预知；理论上讲，但凡能够引起突变原因（物理，化学，理论上讲，但凡能够引起突变原因（物理，化学，生物）都能够应用于定向进化中突变体产生。生物）都能够应用于定向进化中突变体产生。o定点突变：定点突变：突变位点是拟定，突变个数也是预知；突变位点是拟定，突变个数也是预知；突变效应也许是已知，也也许是未知；突变效应也许是已知，也也许是未知；定点突变办法普通是以定点突变办法普通是以PCRPCR技术为基础。技术为基础。第41页第41页易错易错PCRPCR技术技术(error-prone PCR)(error-prone PCR)DNADNA改组改组(DNA shuflling)(DNA shuflling)：由美国：由美国Stemmer Stemmer 于于1994 1994 年初次提出年初次提出 一项体外重组技术一项体外重组技术随机引起重随机引起重组组(RPR)1998(RPR)1998 年年,Arnold,Arnold 提出了一提出了一个有效新办法个有效新办法交错延伸技术交错延伸技术(StEP)(StEP)：由：由Zhao Zhao 等等 提出提出,是一个是一个简化简化DNA shuffling DNA shuffling 技术技术 随机突变策略随机突变策略第42页第42页易错易错PCR易错易错PCR：是一个简朴、快速、廉价随机突变办法。：是一个简朴、快速、廉价随机突变办法。原理：原理：利用利用TaqDNA聚合酶不具备聚合酶不具备3-5校正功效特点通过校正功效特点通过改变改变PCR条件，通常减少一个条件，通常减少一个dNTP 量（降至量（降至5%-10%）使）使PCR易于犯错，达到随机突变目的。还能够加易于犯错，达到随机突变目的。还能够加入入dITP 来代替被减少来代替被减少dNTP，又会使下一轮循环中出现，又会使下一轮循环中出现更多错误。更多错误。在在PCR 缓缓冲液中另加冲液中另加入入Mn2+，亦有助于提，亦有助于提升突升突变变率率。第43页第43页DNADNA改组改组DNADNA改组改组(DNA shuffling)(DNA shuffling)又称有性又称有性PCR PCR(sexual PCR)(sexual PCR)，原理如图所表示。，原理如图所表示。第44页第44页PCR扩增扩增第45页第45页体体外外定定向向进进化化第46页第46页成功实例成功实例Lipase genes(Lipase genes(lipB52,lipB68lipB52,lipB68)isolated from)isolated from Pseudomonas fluorescensPseudomonas fluorescens B52 B52、B68 Genbank Accssion number AY623009B68 Genbank Accssion number AY623009、AY694785AY694785第47页第47页成功实例成功实例Zhengbing Jiang,Yitao zheng,Yu Luo,Gang Wang,Hongping Wang,Yushu Ma and Dongzhi Wei*.Cloning and Expression of a Novel Lipase Gene From Pseudomonas fluorescens B52.Molecular Biotechnology.(31),095-102.SDS-PAGE analysis of lipase on expression and purificationofunctional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates第48页第48页体外随机引起重组体外随机引起重组o 体外随机引发重组(random priming in vitro recombination,RPR)以单链DNA为模板，配合一套随机序列引物，先产生大量互补于模板不同位点短DNA片段，因为碱基错配和错误引发，这些短DNA片段中也会有少许点突变，在随即PCR反应中，它们互为引物进行合成，伴随组合，再组装成完整基因长度。第49页第49页第50页第50页o 交织延伸(stagger extension process,StEP)在PCR反应中把常规退火和延伸合并为一步,缩短其反应时间，从而只能合成出非常短新生链，经变性新生链再作为引物与体系内同时存在不同模板退火而继续延伸。此过程重复进行，直到产生完整基因长度。交错延伸交错延伸第51页第51页第52页第52页 定向进化定向进化是一个由构建突变体库，突变体表示，是一个由构建突变体库，突变体表示，表示后筛选三个环节构成循环递进过程，需要：表示后筛选三个环节构成循环递进过程，需要：(1)(1)产生包括大量带有微量有利突变突变体文库产生包括大量带有微量有利突变突变体文库;(2)(2)突变体应能在适当微生物突变体应能在适当微生物(如大肠杆菌或酵母如大肠杆菌或酵母菌菌)体内进行功效表示体内进行功效表示;(3)(3)必须有一个灵敏筛选办法必须有一个灵敏筛选办法,能反应出由一个氨能反应出由一个氨基酸置换而引起预期性状较小提升。基酸置换而引起预期性状较小提升。第53页第53页环境库和噬菌体展示库构建环境库和噬菌体展示库构建 环境库构建：环境库构建：（1 1）采集环境样品；）采集环境样品；（2 2）提取）提取DNADNA，连接到适当载体上；，连接到适当载体上；（3 3）转入适当宿主菌。）转入适当宿主菌。第54页第54页噬菌体展示库构建噬菌体展示库构建第55页第55页 在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表示在噬菌体颗粒蛋白表面，被展示成融合蛋白表示在噬菌体颗粒蛋白表面，被展示多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物学多肽或蛋白质可保持相对独立空间结构和生物学活性。活性。噬菌体展示基本原理：噬菌体展示基本原理：第56页第56页 利用靶分子，采用适当淘洗办法（亲和利用靶分子，采用适当淘洗办法（亲和洗脱洗脱扩扩增增亲和循环环节），洗去非特异结合噬菌体，最后从亲和循环环节），洗去非特异结合噬菌体，最后从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子目的噬菌体；外源多噬菌体文库中筛选出能结合靶分子目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表示在噬菌体表面，而其编码基因作为病毒肽或蛋白质表示在噬菌体表面，而其编码基因作为病毒基因组中一部分可通过噬菌体基因组中一部分可通过噬菌体DNA DNA 序列测序出来，使得序列测序出来，使得表示蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地表示蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来。结合起来。噬菌体展示库构建环节：噬菌体展示库构建环节：第57页第57页o可分为选择（selection）和筛选（screening）。o选择：经过添加或降低某种成份使目标菌株取得生长优势，而其它菌株生长受到克制，经过多次筛选分离最终得到目标菌株。o检测：通常是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后发生某种能够区分改变，如培养基透明度改变或菌落周围颜色改变，由此区分不同类型或生理特性不同微生物。（容易实现高通量筛选）定向进化筛选策略定向进化筛选策略第58页第58页琼脂板涂布法琼脂板涂布法 在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌生长情况、在特殊条件下培养突变菌，通过宿主菌生长情况、培养基颜色、特定反应出现等判断是否含有目的基因。培养基颜色、特定反应出现等判断是否含有目的基因。微孔板悬浮法微孔板悬浮法 在含生色底物平板上培养，挑取含有活性克隆接在含生色底物平板上培养，挑取含有活性克隆接种到种到96孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。孔板上检测吸光度。使用微流控芯片。微球细胞固定法微球细胞固定法 与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个与数字成像系统结合，将单个细胞附着在单个固体珠上，突变体进行分离和筛选。固体珠上，突变体进行分离和筛选。流式细胞计数法流式细胞计数法 细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成细胞经荧光染色后，通过高速流动系统，排成单行，逐一通过流式细胞计数仪进行测定。单行，逐一通过流式细胞计数仪进行测定。突变体分离突变体分离第59页第59页通过酶促反应特性通过酶促反应特性加入底物显色加入底物显色荧光共振能量转移荧光共振能量转移同位素标识底物同位素标识底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测酶检测酶检测信号探测信号探测分光光度计和荧光酶标仪分光光度计和荧光酶标仪气相色谱和高效液相色谱气相色谱和高效液相色谱质谱和核磁质谱和核磁第60页第60页第61页第61页第62页第62页第63页第63页o目的酶o所需功效o办法结果o实行菌种卡那霉素核苷基转移酶热稳定性定位诱变+选择o在60-50酶半衰期增长200倍耐热脂肪芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶作用于有机溶剂易错PCR+选择在60二甲基亚砜主仆女冠活力增强170倍枯草杆菌-内酰胺酶作用于新底物DNA改组+选择o对cefotaxime抗性增长3倍大肠杆菌对硝基苯酯酶o有机溶剂中底物特异性和活性易错PCR+重组o活力增长60-150倍大肠杆菌胸苷激酶第五特异性 基因理疗o交错延伸+选择o活力增长43倍大肠杆菌-半乳糖苷酶底物特异性DNA改组+选择o活力增长66倍底物特异性增长1000倍大肠杆菌o砷酸脱毒路径砷酸抗性DNA改组+选择o抗性增长12倍大肠杆菌定向进化应用定向进化应用第64页第64页3.3.杂合酶杂合酶o 杂合酶是把来自不同酶分子中结构单元或是整个酶分子进行组合和互换，以产生目标所需优化酶杂合体。第65页第65页杂合酶构建策略：杂合酶构建策略：（1 1）二级结构互换；）二级结构互换；（2 2）功效域替换；）功效域替换；（3 3）融合蛋白。）融合蛋白。第66页第66页杂合酶制备办法：杂合酶制备办法：（1 1）同源扫描突变；）同源扫描突变；（2 2）反）反-内蛋白子应用；内蛋白子应用；（3 3）DNADNA增长截短法；增长截短法；（4 4）同源基因改组）同源基因改组SCRATCHYSCRATCHY库。库。第67页第67页o 同源扫描突变：几个同源酶PCR扩增，然后用内切核酸酶切割，不同切割产物混合组合，Taq聚合酶扩增，含有几个同源蛋白质基因片段组成新基因，即为杂合基因，进而克隆与表示，产生杂合酶。第68页第68页 反反-内蛋白子应用内蛋白子应用：反：反-内蛋白子能够融合任内蛋白子能够融合任何两个多肽，适合产生杂合酶何两个多肽，适合产生杂合酶。第69页第69页 DNADNA增长截短法增长截短法：应用：应用DNADNA增长缩短法，定向控制增长缩短法，定向控制DNADNA消化，不要求任何消化，不要求任何DNADNA同源性和酶结构知识，理论上两个同源性和酶结构知识，理论上两个基因因此组合都也许产生，通过选择或筛选，找到目的基因因此组合都也许产生，通过选择或筛选，找到目的酶。酶。第70页第70页 同源基因改组同源基因改组SCRATCHYSCRATCHY库库：增长剪截与：增长剪截与DNADNA随机重组相结合。随机重组相结合。第71页第71页四、生物酶工程前景四、生物酶工程前景 伴随各种高新技术广泛应用及酶工程研究工作不断伴随各种高新技术广泛应用及酶工程研究工作不断进一步，生物酶工程研究必将取得更快、更大发展。能进一步，生物酶工程研究必将取得更快、更大发展。能够相信，未来人们能够，采用生物学办法在生物体外结够相信，未来人们能够，采用生物学办法在生物体外结构出性能优良产酶工程菌为生产和生活服务，酶工程技构出性能优良产酶工程菌为生产和生活服务，酶工程技术必将在工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能术必将在工业、医药、农业、化学分析、环境保护、能源开发和生命科学理论研究等各个方面发挥越来越大作源开发和生命科学理论研究等各个方面发挥越来越大作用。用。第72页第72页