细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术专家讲座.pptx

实实 验验 二二细菌培养基配制、灭菌细菌培养基配制、灭菌及接种、培养技术及接种、培养技术1细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第1页第一部分第一部分细菌培养基制备、灭菌细菌培养基制备、灭菌目标要求目标要求试验材料试验材料试验程序试验程序2细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第2页目目 要要 求求熟悉玻璃器皿洗涤和灭菌前准备。熟悉玻璃器皿洗涤和灭菌前准备。掌握培养基和无菌水制备方法。掌握培养基和无菌水制备方法。掌握高压蒸气灭菌技术。掌握高压蒸气灭菌技术。3细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第3页实实 验验 材材 料料药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等等。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻璃珠等。璃珠等。4细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第4页实实 验验 程程 序序玻璃器皿洗涤和包装玻璃器皿洗涤和包装培养基制备培养基制备无菌稀释水制备无菌稀释水制备培养基和玻璃器材等灭菌培养基和玻璃器材等灭菌5细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第5页试验程序试验程序1 （玻璃器皿洗涤和包装）（玻璃器皿洗涤和包装）清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。棉塞制作棉塞制作 包装培养皿和移液管等。包装培养皿和移液管等。6细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第6页实实 验验 程程 序序2 （培养基种类）（培养基种类）据组成成份可分为据组成成份可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定百分比配制而成。合成培养基：由各种纯化学物质按一定百分比配制而成。2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制而成。而成。3.天然培养基：利用天然起源有机物配制而成。天然培养基：利用天然起源有机物配制而成。从培养基物理状态可分为从培养基物理状态可分为 1.液体培养基：不加凝固剂液体状态培养基。液体培养基：不加凝固剂液体状态培养基。2.固固体培养基：在液体培养基中加入体培养基：在液体培养基中加入1530g/L左右琼脂。左右琼脂。3.半固体培养基：在液体培养基中加入半固体培养基：在液体培养基中加入35g/L左右琼脂。左右琼脂。7细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第7页实实 验验 程程 序序2 （培养基种类）（培养基种类）惯用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。惯用凝固剂为琼脂（其次为明胶），又叫洋菜、冻粉。8细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第8页实实 验验 程程 序序2（培养基配制方法和步骤）（培养基配制方法和步骤）1.取一个取一个300mL烧杯，装烧杯，装150mL蒸馏水。蒸馏水。2.按配方逐一正确称取各种成份，依次加入水中溶解。按配方逐一正确称取各种成份，依次加入水中溶解。注意：注意：a.前一个成份溶解之后，才能加入下一个成份前一个成份溶解之后，才能加入下一个成份 b.可加热促进各成份溶解可加热促进各成份溶解 c.加热过程应不停搅拌，以免糊底烧焦，并适当加热过程应不停搅拌，以免糊底烧焦，并适当补充因蒸发而损失水量。补充因蒸发而损失水量。培养基配方 牛肉膏蛋白胨氯化钠琼脂蒸馏水pH数量0.75g1.5g0.75g3g150mL7.69细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第9页实实 验验 程程 序序2（培养基配制方法和步骤）（培养基配制方法和步骤）3.调调pH值：用值：用10 NaOH调调pH至至7.6，用精，用精密密pH试纸对照。试纸对照。4.分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于5支试管，其余全部支试管，其余全部倒入倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意注意不要污染棉塞和瓶口不要污染棉塞和瓶口。5.包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。6.灭菌备用：培养基灭菌后必须在灭菌备用：培养基灭菌后必须在37下恒下恒温培养温培养24h，确定无菌生长，方可使用。，确定无菌生长，方可使用。10细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第10页实实 验验 程程 序序2 （培养基分装和斜面培养基制作）（培养基分装和斜面培养基制作）每支试管装量为试管高度每支试管装量为试管高度1/41/3.斜面长度为试管长度斜面长度为试管长度1/31/2.11细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第11页试验程序试验程序2 （培养基配制方法和步骤）（培养基配制方法和步骤）12细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第12页试验程序试验程序3 （无菌稀释水制备）（无菌稀释水制备）取一个取一个250mL锥形瓶装锥形瓶装90(或或99)mL蒸馏水，蒸馏水，放放30颗玻璃珠颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤用于打破活性污泥、菌块或土壤颗粒颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。另取另取5支支18mm180mm试管，分别装试管，分别装9mL蒸蒸馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。馏水，塞棉塞、包扎，待灭菌。无菌稀释水为微生物分离试验中所需要材料。无菌稀释水为微生物分离试验中所需要材料。13细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第13页试验程序试验程序4 （培养基和玻璃器材等灭菌）（培养基和玻璃器材等灭菌）加热灭菌有加热灭菌有干热灭菌干热灭菌和和湿热灭菌湿热灭菌。干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器干热灭菌操作方法干热灭菌操作方法 a.将待灭菌物品放入恒温箱，将温度调整至将待灭菌物品放入恒温箱，将温度调整至160并并维持维持2h；b.把恒温箱调整旋钮调回零处，待温度降到把恒温箱调整旋钮调回零处，待温度降到50左左右，才能将物品取出。右，才能将物品取出。14细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第14页试验程序试验程序4 （培养基和玻璃器材等灭菌）（培养基和玻璃器材等灭菌）湿热灭菌：高压蒸气灭菌法湿热灭菌：高压蒸气灭菌法高压蒸气灭菌法操作步骤以下：高压蒸气灭菌法操作步骤以下：1.灭菌锅内加入一定量水。灭菌锅内加入一定量水。2.将待灭菌物品放入锅内，并关严锅盖。将待灭菌物品放入锅内，并关严锅盖。注意：器物不能装得太满。注意：器物不能装得太满。3.接通电源，进行加热。接通电源，进行加热。4.排除高压锅内冷空气，可将排气阀打开，待温度计指排除高压锅内冷空气，可将排气阀打开，待温度计指示温度为示温度为100时关闭排气阀；或当排出蒸气相当猛烈时关闭排气阀；或当排出蒸气相当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。且微带蓝色时关闭排气阀。15细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第15页试验程序试验程序4 （培养基和玻璃器材等灭菌）（培养基和玻璃器材等灭菌）5.当压力达当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内温度为灭菌器内温度为121)即即开始灭菌，使其维持开始灭菌，使其维持1530min。对热不稳定培养基。对热不稳定培养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力(0.56kg/cm2)，延长时间。，延长时间。6.灭菌时间一到，切断电源，灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时待压力降至零时，才能打，才能打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内剩下水。下水。7.待培养基冷却后置于待培养基冷却后置于37恒温箱内培养恒温箱内培养24h，若无，若无菌生长则放入冰箱或阴凉处保留备用。菌生长则放入冰箱或阴凉处保留备用。16细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第16页17细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第17页试验程序试验程序4 （培养基和玻璃器材灭菌方法）（培养基和玻璃器材灭菌方法）间歇灭菌法：间歇灭菌法：即常压灭菌，用于一些受高温而破坏培养即常压灭菌，用于一些受高温而破坏培养基灭菌。基灭菌。操作方法：操作方法：a.待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，天天蒸煮待灭菌物品放在灭菌器或蒸笼里，天天蒸煮1次，每次，每次在次在100煮沸煮沸3060min，连续，连续3d重复进行。重复进行。b.在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在在每两次蒸煮之间，将物品（指培养基）放在37恒恒温条件下培养温条件下培养24h，这么能够使每次蒸煮后未杀死残留，这么能够使每次蒸煮后未杀死残留芽孢萌发成营养体，方便下次蒸煮时杀灭。芽孢萌发成营养体，方便下次蒸煮时杀灭。c.第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在第三次蒸煮之后基本无菌，但为了确保无菌仍要放在37恒温条件下培养恒温条件下培养24h，确定无菌才能使用。，确定无菌才能使用。18细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第18页试验程序试验程序4（培养基和玻璃器材灭菌方法）（培养基和玻璃器材灭菌方法）过滤除菌法过滤除菌法：不能用加热灭菌液不能用加热灭菌液体物质（如维生素、体物质（如维生素、血清），普通可用血清），普通可用细菌过滤器进行除细菌过滤器进行除菌。菌。19细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第19页第二部分第二部分细菌纯种分离、培养和接细菌纯种分离、培养和接种技术种技术目标要求目标要求试验材料试验材料试验程序试验程序20细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第20页目目 要要 求求掌握从环境中分离培养细菌方法，从而掌握从环境中分离培养细菌方法，从而取得若干种细菌纯培养技能。取得若干种细菌纯培养技能。掌握几个接种技术。掌握几个接种技术。21细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第21页实实 验验 材材 料料无菌培养皿无菌培养皿(直径直径90mm)10套、无菌移液管套、无菌移液管1mL2支、支、10mL1支支。营养琼脂培养基营养琼脂培养基1瓶，活性污泥或土壤或湖水瓶，活性污泥或土壤或湖水1瓶，瓶，无菌稀释水无菌稀释水90mL1瓶、瓶、9mL5管。管。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。其它：接种环、酒精灯、恒温箱。22细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第22页实实 验验 程程 序序细菌纯种分离细菌纯种分离细菌接种方法细菌接种方法23细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第23页试验程序试验程序1 （细菌纯种分离）（细菌纯种分离）稀释平板法稀释平板法平板划线法平板划线法24细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第24页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离稀释平板法）稀释平板法）1.取样。取样。2.将将1瓶瓶90mL和和5管管9mL无菌水排列好，用记号笔无菌水排列好，用记号笔依次编上依次编上101、102、103、104、105、106。在无菌操作条件下，用在无菌操作条件下，用10mL无菌移液管吸收无菌移液管吸收10mL水样水样(或其它样品或其它样品)加入编号为加入编号为101无菌水无菌水(内含玻内含玻璃珠璃珠)中，将移液管吹洗三次，用手摇中，将移液管吹洗三次，用手摇10min将颗粒将颗粒状样品打散。即为状样品打散。即为101浓度菌液。用浓度菌液。用1mL无菌移液无菌移液管吸收管吸收1mL 101浓度菌液于编号为浓度菌液于编号为102无菌水中，无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为将移液管吹洗三次，摇匀即为102浓度菌液。一样浓度菌液。一样方法，依次稀释到方法，依次稀释到106。25细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第25页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离稀释平板法）稀释平板法）稀释液制备稀释液制备26细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第26页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板制作平板制作 取取10套无菌培养皿编号，套无菌培养皿编号，104、105、106各各3个，另一个个，另一个为空气对照。为空气对照。取取1支支1mL无菌移液管从无菌移液管从浓度小菌液浓度小菌液开始，以开始，以106、105、104为序分别吸收为序分别吸收0.5mL菌液于对应编号培养皿内菌液于对应编号培养皿内(每次吸收前，每次吸收前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混匀)。27细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第27页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板制作平板制作 加热培养基，当其冷至加热培养基，当其冷至45左右时，右手拿装有培养基锥形左右时，右手拿装有培养基锥形瓶，左手拿培养皿，以中指、无瓶，左手拿培养皿，以中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖指夹住皿盖，靠近火焰，将皿盖掀开，倒入培养基后将培养皿平掀开，倒入培养基后将培养皿平放在桌上，顺时针和逆时针往返放在桌上，顺时针和逆时针往返转动培养皿，使培养基和菌液充转动培养皿，使培养基和菌液充分混匀，冷凝后即成平板，倒置分混匀，冷凝后即成平板，倒置于于30培养培养2448h，然后观察，然后观察结果。结果。28细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第28页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离稀释平板法）稀释平板法）3.平板制作平板制作 取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿取对照无菌培养皿，倒平板待凝固后，打开皿盖盖10min后盖上，倒置于后盖上，倒置于30培养培养2448h，然后，然后观察结果。观察结果。29细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第29页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离平板划线法）平板划线法）1.平板制作：平板制作：将融化并冷至约将融化并冷至约50肉膏蛋白肉膏蛋白胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平胨琼脂培养基倒入无菌培养皿内，使凝固成平板。板。2.划线：划线：用接种环挑取一环样品，左手拿培养用接种环挑取一环样品，左手拿培养皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食皿，中指、无名指和小指托住皿底，拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指夹住皿盖，将培养皿稍倾斜，左手拇指和食指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，指将皿盖掀半开，右手将接种环伸入培养皿内，在平板上轻轻划线在平板上轻轻划线(切勿划破培养基切勿划破培养基)。划线完。划线完成盖好皿盖，成盖好皿盖，30培养培养2448h后观察结果。后观察结果。30细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第30页试验程序试验程序1（细菌纯种分离（细菌纯种分离平板划线法）平板划线法）31细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第31页试验程序试验程序2（细菌接种技术）（细菌接种技术）接种方法：惯用有接种方法：惯用有斜面接种法斜面接种法、平板接种法平板接种法、液体接种法液体接种法、试、试管深层固体培养基管深层固体培养基穿刺接种法穿刺接种法。接种工具：惯用有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲接种工具：惯用有接种针、接种环、接种钩、接种圈、接种铲或接种锄、玻璃涂棒等。或接种锄、玻璃涂棒等。图632细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第32页试验程序试验程序2（细菌接种技术（细菌接种技术斜面接种法斜面接种法）左手平托两支试管，拇指压住两支试左手平托两支试管，拇指压住两支试管。外侧是菌种试管，内侧是待接种空白管。外侧是菌种试管，内侧是待接种空白斜面斜面(两支试管斜面同时向上两支试管斜面同时向上)。右手将。右手将棉塞旋松，方便在接种时轻易拔出。棉塞旋松，方便在接种时轻易拔出。右手拿接种环，在火焰上先将右手拿接种环，在火焰上先将环端环端烧烧红灭菌，然后红灭菌，然后将有可能伸入试管其余部位将有可能伸入试管其余部位也过火灭菌。也过火灭菌。将两支试管上端并齐，靠近火焰，用将两支试管上端并齐，靠近火焰，用右手小指、无名指和手掌将两支试管棉塞右手小指、无名指和手掌将两支试管棉塞一并夹住拔出，一并夹住拔出，棉塞仍夹在手中棉塞仍夹在手中，然后让，然后让试管口缓缓过火焰。试管口缓缓过火焰。12333细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第33页试验程序试验程序2（细菌接种技术（细菌接种技术斜面接种法斜面接种法）将已灼烧过接种环伸入菌种试管内。将已灼烧过接种环伸入菌种试管内。先冷却先冷却，而，而后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并快速伸入后再用环挑取少许菌种，将接种环抽出并快速伸入待接种试管底部，在斜面上待接种试管底部，在斜面上由底部向上划线由底部向上划线。抽出。抽出接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最终再次接种环，塞上棉塞将试管插在试管架上，最终再次烧红接种环，则接种完成。烧红接种环，则接种完成。4567834细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第34页试验程序试验程序2（细菌接种技术（细菌接种技术液体接种和穿刺接种液体接种和穿刺接种）液体接种法液体接种法(从斜面菌种接入培养液从斜面菌种接入培养液)：用：用接种环接种环挑取斜面菌挑取斜面菌种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将种送入培养液中，使环在液体表面与管壁接触轻轻研磨，将环上菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管环上菌种全部洗入培养液中，取出接种环塞上棉塞。将试管轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最终将接种环烧轻轻撞击手掌使菌体在培养液中均匀分布。最终将接种环烧红灭菌。红灭菌。穿刺接种法穿刺接种法(从斜面菌种接入从斜面菌种接入(半半)固体培养基固体培养基)：用：用接种针接种针经经火焰灭菌后，挑取少许菌种，垂直地穿入试管固体培养基中火焰灭菌后，挑取少许菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后穿刺线迟缓将针抽出，塞上棉塞。烧红接种心至底部，然后穿刺线迟缓将针抽出，塞上棉塞。烧红接种针灭菌，则接种完成。针灭菌，则接种完成。35细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第35页试验程序试验程序2（细菌接种技术（细菌接种技术稀释平板涂布法稀释平板涂布法）稀释样品：方法同稀释平板分离法稀释样品：方法同稀释平板分离法倒平板：将融化并冷至倒平板：将融化并冷至50左右培养基倒入无菌培养皿中，左右培养基倒入无菌培养皿中，冷凝后即成平板冷凝后即成平板用无菌移液管吸收一定量经适当稀释标志样品液于平板上，用无菌移液管吸收一定量经适当稀释标志样品液于平板上，换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀换上无菌玻璃刮刀在平板上旋转涂布均匀将培养皿正摆在恒温箱中，调整一定温度进行培养。假如培将培养皿正摆在恒温箱中，调整一定温度进行培养。假如培养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。养时间较长，次日把培养皿倒置继续培养，直至长出菌落。36细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第36页试验程序试验程序2（细菌接种技术）（细菌接种技术）液体培养基中菌种接入液体培养基中液体培养基中菌种接入液体培养基中接种工具：无菌移液管和无菌滴管接种工具：无菌移液管和无菌滴管移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌移液管和滴管不能在火焰上烧，应预先灭菌用无菌移液管自菌种管中吸收一定量菌液接到用无菌移液管自菌种管中吸收一定量菌液接到另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。另一管液体培养基中，将试管塞好棉塞即可。37细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第37页实实 验验 二二结结 束束38细菌培养基的制备灭菌和接种培养技术第38页