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12 2 基因工程的酶学基础基因工程的酶学基础第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶第二节第二节 DNA连接酶连接酶第三节第三节 DNA聚合酶聚合酶第四节第四节 DNA修饰酶修饰酶第五节第五节 核酸外切酶核酸外切酶第六节第六节 单链核酸内切酶单链核酸内切酶2一、限制性核酸内切酶一、限制性核酸内切酶第一节第一节 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 是一类能够识别是一类能够识别双链双链DNADNA分子中的某种分子中的某种特定核特定核苷酸序列苷酸序列，并由此处，并由此处切割切割DNADNA双链双链的核酸的核酸内切酶内切酶。（Restriction endonuclease）32.2.性质性质内切酶内切酶主要来源于原核生物主要来源于原核生物即在核酸分子链的即在核酸分子链的内部内部制造切口的酶。制造切口的酶。形成形成5 5-P-P和和3 3-OH-OH末端末端 自我保护作用自我保护作用3.3.功能功能细菌的限制和修饰系统（细菌的限制和修饰系统（R/MR/M体系）体系）1.1.来源来源45细菌自身细菌自身DNADNA的碱基被的碱基被甲基化酶甲基化酶甲基化甲基化(修饰修饰)，不能被，不能被自身的限制性内切酶识别切割而保护。自身的限制性内切酶识别切割而保护。（2 2）修饰（）修饰（ModificationModification）Dam Dam甲基化酶甲基化酶(DNA Adenine MethylaseDNA Adenine Methylase)G GA ATC TC 腺嘌呤腺嘌呤N6N6位置引入甲基位置引入甲基 Dcm Dcm甲基化酶甲基化酶(DNA cytosine MethylaseDNA cytosine Methylase)C CC CAGGAGG或或C CC CTGGTGG序列在第二个序列在第二个C C上上C C5 5位置上引入甲基位置上引入甲基限制性内切酶将侵入细菌体内的限制性内切酶将侵入细菌体内的外源外源DNA进行分解，进行分解，切成小片断。切成小片断。（1）限制（）限制（Restriction6（3 3）限制与修饰系统相关的三个基因）限制与修饰系统相关的三个基因 hsd hsd R:R:编码限制性内切酶编码限制性内切酶 hsd hsd M:M:编码限制性甲基化酶编码限制性甲基化酶 hsd hsd S:S:编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达编码限制性内切酶和甲基化酶的协同表达这类酶能识别这类酶能识别DNADNA分子上的特定位点，并将双链分子上的特定位点，并将双链DNADNA切断切断这类酶使这类酶使DNADNA分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰分子特定位点上的碱基甲基化，即起修饰 DNADNA的作用。的作用。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。作用是协同上述两种酶识别特殊的作用位点。719731973年年H.O SmithH.O Smith和和D.NathansD.Nathans提议的命名系统，命名原提议的命名系统，命名原则如下：则如下：二、限制性内切酶的命名二、限制性内切酶的命名1.1.用用属名属名的第一个字母大写的第一个字母大写2.2.种名种名的前两个字母小写的前两个字母小写3.3.由由3 3个字母形成的略语表示个字母形成的略语表示寄主菌寄主菌的物种名，组成酶的基的物种名，组成酶的基本名称。本名称。大肠杆菌（大肠杆菌（E Escherichia scherichia cocolili）用）用EcoEco表示；表示；流感嗜血菌（流感嗜血菌（H Haemophilus aemophilus ininfluenzaefluenzae）用）用HinHin表示表示84.4.如果酶存在于一种如果酶存在于一种特殊的菌株特殊的菌株中，则将该菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于位于噬菌体（病毒）或质粒噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。表示此染色体外遗传成分。如如 HinHind d ：d d菌株菌株 EcoEcoR R ：抗药性：抗药性R R质粒质粒 95.5.如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序先后次序。如如HinHind d：d d菌株中发现的第二个酶菌株中发现的第二个酶6.6.所有的限制酶，除以上名称外还要冠以所有的限制酶，除以上名称外还要冠以系统名称系统名称。限制。限制性内切酶的系统命名为性内切酶的系统命名为R R，甲基化酶为，甲基化酶为M M。如如 R R.HinHind d 表示限制性内切酶表示限制性内切酶表示限制性内切酶表示限制性内切酶 M M M M.HinHinHinHind d d d 表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶表示相应的甲基化酶实际应用中，实际应用中，实际应用中，实际应用中，R R R R常被省略。常被省略。常被省略。常被省略。10 属名属名属名属名 种名种名种名种名 株名株名株名株名 H i n d IIIH i n d III H i nH i n d III d III Haemophilus influenzaeHaemophilus influenzae d d 嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌嗜血流感杆菌d d株株株株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名限制性核酸内切酶的命名11目前已发现目前已发现600600多种多种限制性内切酶，分为三类。限制性内切酶，分为三类。三、限制性内切酶的类型三、限制性内切酶的类型限制性核酸内切酶的分类分类依据1）依据识别序列与切割位点是否一致2）所需辅助因子分为三类：I型酶、II型酶、III型酶12首先由首先由M.MeselsonM.Meselson和和R.YuanR.Yuan在在19681968年从大肠杆菌年从大肠杆菌 B B株株和和 K K株株分离的。分离的。（1 1）识别序列识别序列EcoB：TGA(N)8TGCT EcoK：AAC(N)6GTGC1.1.型限制性内切酶的基本特性型限制性内切酶的基本特性 如如 EcoEcoB B EcoEcoK K未甲基化修饰的特异序列未甲基化修饰的特异序列13需需ATP、Mg2+和和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）（3）辅助因子辅助因子在距离特异性识别序列上游约在距离特异性识别序列上游约10001500 bp处处随机随机切开一切开一条条单链单链，两条链上的切点相距，两条链上的切点相距7075bp，即末端为单链。，即末端为单链。Recognize sitecut1-1.5kb（2）切割位点切割位点14I型酶：限制修饰系统酶异源多聚体，异源多聚体，R、M、S分别为限制性内切酶、甲基化酶、特异位点识分别为限制性内切酶、甲基化酶、特异位点识别的活性。别的活性。识别序列全甲基化识别序列全甲基化-不识别不识别识别序列半甲基化识别序列半甲基化-甲基化作用甲基化作用识别序列未甲基化识别序列未甲基化-限制性内切酶作用限制性内切酶作用识别序列与切割位点不一致，且切割位点随机不定识别序列与切割位点不一致，且切割位点随机不定ATPATP、Mg2+Mg2+和和SAMSAM（S-S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）152.2.型限制性内切酶型限制性内切酶 识别序列与切割位点不相一致识别序列与切割位点不相一致切割位点相对固定切割位点相对固定反应需要反应需要ATPATP、MgMg2+2+和和SAMSAM（S-S-腺苷蛋氨酸）。腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG16识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割（一致）序列呈典型的旋转对称型回文结构2.2.类限制性内切酶的基本特性类限制性内切酶的基本特性 5 G C T 5 G C T G A A T T CG A A T T C G A G 3 G A G 3 3 C G A 3 C G A C T T A A GC T T A A G C T C 5 C T C 5 EcoR IEcoR I的识别序列的识别序列的识别序列的识别序列 EcoR IEcoR I的切割位点的切割位点的切割位点的切割位点17 EcoRIEcoRI等产生的等产生的等产生的等产生的5-5-粘性末端粘性末端粘性末端粘性末端 5 G-C-T5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3-G-A-G 3 33 C-G-A-C-G-A-C-T-T-A-A-GC-T-T-A-A-G-C-T-C 5-C-T-C 5 EcoRI 37 EcoRI 37 退火退火退火退火 4-7 4-7 5 G-C-T-G-OH P-5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-TA-A-T-T-C-G-A-G 3-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-3 C-G-A-C-T-T-A-AT-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5-P OH-G-C-T-C 5 5 G-C-T5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G A-A-T-T-C-G-A-G 3-G-A-G 3 33 C-G-A-C-G-A-C-T-T-A-A GC-T-T-A-A G-C-T-C 5-C-T-C 518稀有切割限制酶（稀有切割限制酶（rare cutterrare cutter）可以识别可以识别6 6个以上的核苷酸序列的少数的限制内切个以上的核苷酸序列的少数的限制内切酶。酶。如如NotNot I I I I （GCGGCCGCGCGGCCGC）某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个某些限制性内切酶的识别序列中，某一个或两个碱基并非严格专一。碱基并非严格专一。如如HinHind d 可识别可识别4 4种核苷酸序列：种核苷酸序列：Y Y:C:C或或T T R R:A:A 或或G GGTGTYRYRAC AC-3-35 5-19EcoEcoR I 5R I 5-G GAATTCAATTC-3 3 3 3-CTTAACTTAAG G-5 5PstPst I 5 I 5-CTGCA-CTGCAG G-3 3 3 3-G-GACGTCACGTC-5 5 产生粘性末端产生粘性末端EcoEcoR V 5R V 5-GATGATATCATC-3 3 3 3-CTACTATAGTAG-5 5 产生平齐末端产生平齐末端（2 2）切割位点切割位点切开切开双链双链DNADNA，形成，形成粘性末端粘性末端（sticky endsticky end）或）或平齐末端平齐末端（blunt endblunt end）。如：）。如：识别位点处识别位点处20含有几个核苷酸含有几个核苷酸单链单链的末端。的末端。分两种类型：分两种类型：G GAATTCAATTC CTTAACTTAA G GG G AATTCAATTCCTTAACTTAAG G5 5-3-33 3-5 55 5-3 33 3-5-51 1 粘性末端粘性末端（sticky ends，cohensive ends）5 5端凸出（如端凸出（如EcoEcoR IR I切点）切点）21CTGCAG GACGTC5-33-55-33-5CTGCA G G ACGTC）3 3端凸出（如端凸出（如Pst Pst I I切点）切点）22i i）不同的不同的DNADNA双链：双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。只要粘性末端碱基互补就可以连接。iiii）同一个同一个DNADNA分子内连接：分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成通过两个相同的粘性末端可以连接成环环形分子形分子。这比连接两个平齐末端容易得多。这比连接两个平齐末端容易得多。2 2 粘性末端的意义粘性末端的意义 连接便利连接便利23B B 末端末端可以通过可以通过末端转移酶末端转移酶添加几个多聚核苷酸添加几个多聚核苷酸的尾巴（如的尾巴（如dAdA和和dTdT），即），即同聚物加尾同聚物加尾造成人工粘造成人工粘性末端。性末端。A A 末端可用末端可用DNADNA多核苷酸激酶多核苷酸激酶进行进行3232P P标记。标记。粘性末端可以用粘性末端可以用DNADNA聚合酶补平成平齐末端。聚合酶补平成平齐末端。末端标记末端标记 补平成平齐末端补平成平齐末端243 3 平齐末端（平齐末端（blunt endblunt end）在识别序列的在识别序列的对称轴上对称轴上同时切割同时切割5-GATATC-33-5CTATAG 如如EcoR V254 4 平齐末端的特点平齐末端的特点连接困难，连接困难，连接效率低连接效率低，只有粘性末端连接，只有粘性末端连接效率的效率的1%1%，这种连接常出现，这种连接常出现多联体连接多联体连接。粘性末端与平齐末端连接的处理方法粘性末端与平齐末端连接的处理方法）添补法：）添补法：利用利用DNADNA聚合酶聚合酶(klenow fragment）将碱基添将碱基添补到目的基因的粘性末端上。补到目的基因的粘性末端上。）削除）削除(平平)法法 利用利用S1和和Bal31等等核酸酶核酸酶将目的基因粘性末端的将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端单链突出部分削去，使其成为平齐末端26不同来源的酶，不同来源的酶，识别相同的序列，识别相同的序列，切割方式切割方式相同或不同。相同或不同。识别位点和切点完全相同识别位点和切点完全相同如如HinHind d 和和HsuHsu I IHind 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-5Hsu I 5-AAGCTT-3 3-TTCGAA-55 5 同裂酶（同裂酶（Isoschizomer)Isoschizomer)完全同裂酶：完全同裂酶：27Xma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5Sma I 5-CCCGGG-3 3-GGGCCC-5识别位点相同，但切点不同。识别位点相同，但切点不同。如如XmaXma I I 和和 SmaSma I I。不完全同裂酶：不完全同裂酶：28识别的序列不同，但能识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端切出相同的粘性末端。如。如BamBamH IH I、BglBgl 、Bcl Bcl I I、XhoXho 等等5-G5-GGGATCATCC-3 C-3 3-3-CCTAGCCTAGGG-5-5BamBamH IH IBclBcl I I5-T5-TGGATCATCA-3 A-3 3-3-ACTAGACTAGT T-5-5 5-5-A AGATCGATCT-3 T-3 3-3-TCTAGTCTAGA A-5-5Bgl Bgl 5-5-U UGATCGATCY-3 Y-3 3-Y3-YCTAGCTAGU U-5-5 XhoXho U U代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；代表嘌呤；Y Y代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。代表嘧啶。6 6 同尾酶同尾酶(Isocaudamers(Isocaudamers）295-GATC-3 3-CTAG-5 Sau 3A同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能一般不能再被原来的酶识别。再被原来的酶识别。5-G3-CCTAGGATCT-3 A-5BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5BamH IBgl Sau 3A30限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、温度、离子强度、pHpH等条件下才表现最佳切割等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。能力和位点的专一性。如果改变反应条件就会影响酶的如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割专一性和切割效率效率，称为星号（，称为星号（*）活性。）活性。所以一般使用专一的反应缓冲液。所以一般使用专一的反应缓冲液。7 7 限制酶的酶活性限制酶的酶活性 星号（星号（*）活性）活性31EcoEcoR IR I和和BamBamH IH I等都有等都有*活性。活性。在低盐、高在低盐、高pHpH（88）时可识别和切割）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等等GAATTCEcoR I：使用的时候要特别注意！使用的时候要特别注意！732 诱发星号（诱发星号（*）活性的原因）活性的原因）高甘油含量）高甘油含量）内切酶用量过大）内切酶用量过大）低离子强度）低离子强度）高）高pHpH）含有机溶剂，如乙醇）含有机溶剂，如乙醇）MnMn2+2+、MgMg2+2+、CuCu2+2+、ZnZn2+2+等二价阳离子的存在等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件33在离它的在离它的不对称识别位点不对称识别位点一侧的一侧的特定距离特定距离处切割处切割DNADNA双链。双链。移动切割（移动切割（shifted cleavage):shifted cleavage):GACGCNNNNN Hga ICTGCGNNNNNNNNNN538s8s型限制性内切酶型限制性内切酶34（3 3）型限制性内切酶不具有甲基化功能型限制性内切酶不具有甲基化功能型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别它们识别相同相同的的DNADNA序列，但序列，但功能不同功能不同。如如 EcoEcoR IR I限制性内切酶和限制性内切酶和EcoEcoR IR I甲基化酶甲基化酶前者：前者：5-GGAATTCAATTC-3-3 3-3-CTTAACTTAAGG-5-5后者：后者：后者：后者：5-5-GGAAAA*TTCTTC-3-3 3-3-CTTCTT*AAAAGG-5-5作用的位点也不相同作用的位点也不相同作用的位点也不相同作用的位点也不相同35（4 4）II型限制性内切酶对单链型限制性内切酶对单链DNADNA的切割的切割定义为切割双链定义为切割双链DNADNA，但有一些还可以特，但有一些还可以特异识别并切割单链异识别并切割单链DNADNA的相应位点，只是的相应位点，只是切割效率比较低切割效率比较低如：如：如：如：H H H Hhahahaha切割单链切割单链DNADNA比比切割双链切割双链DNADNA效率低效率低505036核酸限制性内切酶的类型及主要特性核酸限制性内切酶的类型及主要特性特性特性 类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶类内切酶限制和修限制和修饰活性饰活性单一多功能的酶单一多功能的酶内切酶和甲基内切酶和甲基化酶分开化酶分开共同亚基的双功共同亚基的双功能酶能酶内切酶的内切酶的蛋白结构蛋白结构3 3种不同的亚基种不同的亚基单一成分单一成分2 2种不同的亚基种不同的亚基限制作用限制作用所需要的所需要的辅助因子辅助因子ATPATP、MgMg2+2+和和SAMSAMMgMg2+2+ATPATP、MgMg2+2+和和SAMSAM寄主特异寄主特异性位点识性位点识别序列别序列EcoEcoB B：TGA(N)TGA(N)8 8TGCT TGCT EcoEcoK K：AAC(N)AAC(N)6 6GTGCGTGC 回文序列回文序列（s s型除外）型除外）EcoEcoP1:AGACCP1:AGACCEcoP15:CAGCAGEcoP15:CAGCAG37切割位点切割位点在距离识别位点在距离识别位点至少至少10001000bpbp处随机切开一处随机切开一条单链条单链位于寄主特位于寄主特异性位点或异性位点或其附近其附近距寄主特异距寄主特异性位点性位点3 3端端242426bp26bp处处酶催转换酶催转换不能不能能能能能DNADNA易位作用易位作用能能不能不能不能不能甲基化作用的位点甲基化作用的位点寄主特异性位点寄主特异性位点 寄主特异性寄主特异性位点位点寄主特异性寄主特异性位点位点识别未甲基化的序识别未甲基化的序列进行切割列进行切割能能能能能能序列特异的切割序列特异的切割不是不是是是是是基因工程中的用途基因工程中的用途无用无用十分有用十分有用用处不大用处不大38四、限制性内切酶酶解反应条件四、限制性内切酶酶解反应条件1.1.标准酶解体系的建立标准酶解体系的建立 一个单位（一个单位（U U）的限制性内切酶定义：）的限制性内切酶定义：在合适的温度和缓冲液中，在在合适的温度和缓冲液中，在2020l l的反应体系中，的反应体系中，1h1h完全酶解完全酶解1 1g g-DNADNA所需要的酶量。所需要的酶量。推荐：稍过量的酶（推荐：稍过量的酶（2-52-5倍）和较长的反应时间倍）和较长的反应时间392.2.酶解过程酶解过程 配酶解体系配酶解体系 混匀混匀 反应终止反应终止 酶解结果鉴定酶解结果鉴定40 酶解体系酶解体系一般一般2020l l，保证酶液体积不超过反应总体积的，保证酶液体积不超过反应总体积的10%10%前提下，尽量降低反应总体积。前提下，尽量降低反应总体积。加样顺序一般是：加样顺序一般是：ddHddH2 2O buffer DNA O buffer DNA 酶酶 41 大部分大部分大部分大部分II II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：型核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HClTris-HCl50 mM pH 7.550 mM pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMNaClNaCl0-150 mM0-150 mMDTTDTT1 mM1 mM0-50 mM 0-50 mM 低盐酶低盐酶低盐酶低盐酶100 mM 100 mM 中盐酶中盐酶中盐酶中盐酶150 mM 150 mM 高盐酶高盐酶高盐酶高盐酶VolumeVolume20-100 ml20-100 mlT TT T37 37 1-1.5 hr1-1.5 hr42 混匀混匀移液枪吹打移液枪吹打或或手指轻弹管壁手指轻弹管壁若底物分子很大（如基因组若底物分子很大（如基因组DNADNA），），应避免强烈振荡。应避免强烈振荡。混匀后微量高速离心机进行短混匀后微量高速离心机进行短暂离心，使管壁液体全部下沉。暂离心，使管壁液体全部下沉。43反应终止反应终止三种方法：三种方法：）加乙二胺四乙酸（）加乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）至终浓度）至终浓度 10mmol/L;10mmol/L;加十二烷基硫酸钠（加十二烷基硫酸钠（SDSSDS）至终浓度至终浓度0.1%(W/V)0.1%(W/V)）6565加热加热20min20min或者或者7070加热加热10min10min）酚）酚/氯仿氯仿抽提抽提44 酶解结果鉴定酶解结果鉴定快速进行微型琼脂糖凝胶电泳快速进行微型琼脂糖凝胶电泳观察观察然后决定是否终止反应然后决定是否终止反应45酶切后发现除了目的酶切后发现除了目的DNADNA条带外，还有其它条带条带外，还有其它条带酶存在酶存在“星号星号”活性，造成非特异性切割；活性，造成非特异性切割；不正确的操作，导致其它内切酶污染；不正确的操作，导致其它内切酶污染；底物底物DNADNA中可能存在其它中可能存在其它DNADNA污染。污染。电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常电泳后电泳条带扩散，电泳条带移动距离异常 底物底物DNADNA不纯；不纯；内切酶不纯；内切酶不纯；酶蛋白自身或其它杂蛋白与酶蛋白自身或其它杂蛋白与DNADNA结合在一起使电结合在一起使电泳条带移动距离异常泳条带移动距离异常463.3.限制性内切酶对限制性内切酶对DNADNA分子的消化分子的消化 19861986年年J.A.McClarinJ.A.McClarin等通过等通过X X射线晶体衍射射线晶体衍射发现发现型限制酶是以型限制酶是以同型二聚体同型二聚体的形式与靶的形式与靶序列结合。序列结合。CTTAAGGAATTC（1 1）内切酶与识别序列的结合模式）内切酶与识别序列的结合模式 47内切酶在内切酶在DNADNA上的上的所有所有识别位点都被切开识别位点都被切开12 341234（2 2）完全消化完全消化48只有有限数量的酶切位点被切开只有有限数量的酶切位点被切开通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反通过缩短保温时间、降低反应温度、增大反应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。应体积或减少酶量可达到局部消化的目的。12 3414（3 3）局部消化局部消化49（4 4）几种常用限制酶识别位点几种常用限制酶识别位点50514.4.限制性内切酶酶解反应中的注意事项限制性内切酶酶解反应中的注意事项 大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液大多数厂家供应的限制内切酶为浓缩液1U1U的酶液足以在的酶液足以在1h1h内消化内消化1010g DNAg DNA，酶和底物，酶和底物比例比例2-10U/ug DNA,2-10U/ug DNA,避免使用过高的酶浓度避免使用过高的酶浓度 浓缩液使用前可用浓缩液使用前可用1 1限制酶缓冲液稀释限制酶缓冲液稀释 限制性内切酶在含限制性内切酶在含50%50%的甘油的缓冲液的甘油的缓冲液 中，于中，于-20-20稳定保存稳定保存52 酶分装成小份，避免反复冻融酶分装成小份，避免反复冻融 反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低反应中尽可能少加水，使反应体积减到最低 通常增加反应时间，可降低酶量通常增加反应时间，可降低酶量53DNA中的杂质如中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。等都会影响酶的活性。1.DNA的纯度的纯度 五、影响限制性内切酶活性的因素五、影响限制性内切酶活性的因素纯化纯化DNA加大酶的用量，加大酶的用量，1ugDNA用用10U酶酶延长保温时间延长保温时间扩大反应体积（扩大反应体积（20 l）一般采取一般采取54需要合适的底物：需要合适的底物：底物（底物（DNADNA）纯度要高）纯度要高.不能含不能含有有RNARNA和蛋白质和蛋白质;也不能含有过高的也不能含有过高的EDTAEDTA。更不能。更不能含有酚、氯仿、乙醇、含有酚、氯仿、乙醇、SDSSDS和其他有机试剂。和其他有机试剂。DNADNA的浓度的浓度不宜过高，高浓度的不宜过高，高浓度的DNADNA会使溶液的粘会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为底。常为50ul50ul内含内含1ug DNA1ug DNA。55大肠杆菌一般有大肠杆菌一般有两种甲基化酶两种甲基化酶修饰质粒：修饰质粒：2.DNA2.DNA的甲基化程度的甲基化程度 DNADNA腺嘌呤甲基化酶腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylas DNA adenine methylas,dam),dam)（修饰（修饰G GA ATCTC中的中的A A）；）；DNADNA胞嘧啶甲基化酶胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine ethylas DNA cytosine ethylas,dcm),dcm)（修饰（修饰C CC CA/TGGA/TGG的的C C）。）。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。56不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数大多数是是37 37 o oC C，少数要求，少数要求40-65 40-65 o oC C。每微克每微克DNADNA用用1 15 5单单位的酶，保温位的酶，保温1212小时。小时。酶酶最适温最适温度度o oC C酶酶最适温最适温度度o oC C酶酶最适温最适温度度o oC CApaApa I IBclBcl I IMaeMae II IITaqTaq I I3030505050506565Apy Apy I IBstE BstE IIIIMaeMae III III303060605555BanBan I IMae Mae I ISmaSma I I5050454525253.3.温度温度 57是影响限制酶活性的重要因素是影响限制酶活性的重要因素4.4.缓冲液缓冲液(Buffer)(Buffer)（1 1）缓冲液的化学组成）缓冲液的化学组成MgClMgCl2 2、NaCl/KClNaCl/KCl：提供提供MgMg2+2+和离子强度和离子强度Tris-HClTris-HCl：维持维持pH,pH,大多数为大多数为7-7.67-7.6二硫苏糖醇（二硫苏糖醇（DTTDTT）：）：防止酶氧化防止酶氧化,保持酶稳定性保持酶稳定性牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）等：中性蛋白质）等：中性蛋白质,防止酶在低防止酶在低 浓度的蛋白质溶液中变性浓度的蛋白质溶液中变性商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液58（2 2）两种或两种以上的酶切割）两种或两种以上的酶切割DNADNA样品样品 在相同的缓冲液中反应同时进行在相同的缓冲液中反应同时进行 若需要不同的缓冲液若需要不同的缓冲液,采用采用3 3种方法种方法)先用要求先用要求低低离子强度的酶切割（低盐酶）离子强度的酶切割（低盐酶）,再加再加NaClNaCl调节调节 离子强度离子强度,并用第二种酶切割（高盐酶）；并用第二种酶切割（高盐酶）；)先用先用一种一种酶切割酶切割,然后用然后用2.52.5倍体积的乙醇沉淀酶解产物倍体积的乙醇沉淀酶解产物,再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割；再重悬于另一种缓冲液中进行第二种酶切割；)使用所有使用所有限制性酶的限制性酶的通用通用buffer,如如KGB(谷氨酸钾谷氨酸钾 buffer),经适当稀释可达到各种限制性酶要求的经适当稀释可达到各种限制性酶要求的buffer条件。条件。59练习题练习题何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用何为限制性内切酶？有哪些类型，各有什么作用和特点和特点什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影什么是限制性内切酶的星号活性？受哪些因素影响？响？限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是是 【】修复自身的遗传缺陷修复自身的遗传缺陷 促进自身的基因重组促进自身的基因重组 强化自身的核酸代谢强化自身的核酸代谢 提高自身的防御能力提高自身的防御能力 补充自身的核苷酸消耗补充自身的核苷酸消耗 60从细菌从细菌DNADNA环化现象推测，必定存在一种能把环化现象推测，必定存在一种能把两条两条DNADNA双链连接到一起的酶。双链连接到一起的酶。第二节第二节 DNA DNA 连接酶连接酶一、一、DNADNA连接酶（连接酶（ligase)ligase)的发现的发现DNADNA复制一定有断口复制一定有断口61DNADNA连接酶连接酶:一种能够催化在两条一种能够催化在两条DNADNA链之间形成链之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键的酶的酶19671967年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能年，世界上数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在够催化在2 2条条DNADNA链之间形成链之间形成磷酸二酯键磷酸二酯键的酶，即的酶，即DNADNA连接酶。连接酶。62（1 1）大肠杆菌连接酶）大肠杆菌连接酶1.1.两种共价连接两种共价连接DNADNA限制片段的限制片段的DNADNA连接酶连接酶只能连接只能连接粘性末端，背景低，准确性高粘性末端，背景低，准确性高二、二、DNA ligaseDNA ligase的特点的特点（2 2）T4T4噬菌体的连接酶噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端；还能连接不但能连接粘性末端；还能连接齐平末端齐平末端63（1 1）必须是两条）必须是两条双链双链DNADNA（2 2）DNA3DNA3端有游离的端有游离的-OH-OH，5 5端有一个磷酸基团（端有一个磷酸基团（P P）（3 3）需要）需要能量能量动物或噬菌体中：动物或噬菌体中：ATPATP大肠杆菌中：大肠杆菌中：NADNAD+2.2.连接条件连接条件64（4 4）DNADNA连接酶的反应条件连接酶的反应条件连接酶的反应条件连接酶的反应条件Tris-HClTris-HCl50-100 mM50-100 mM，pH 7.5pH 7.5MgClMgCl2210 mM10 mMATPATP0.5-1 mM0.5-1 mMDTTDTT5 mM5 mMVolumeVolume10-20 ml10-20 mlT TT T 4-15 4-15 ，4-16 hr4-16 hr 1 U DNA 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 15 反应反应反应反应 1 1 小时，完全连接小时，完全连接小时，完全连接小时，完全连接 1 1 g g l l l l-DNA-DNA（H Hindind 片段）片段）片段）片段）所需的酶量。所需的酶量。所需的酶量。所需的酶量。651.ATP1.ATP（NADNAD+)提供激活的提供激活的AMPAMP。三、连接反应的机理三、连接反应的机理2.AMP2.AMP与连接酶形成共价与连接酶形成共价“连接酶连接酶-AMP-AMP”复合复合物，并释放出焦磷酸物，并释放出焦磷酸PPi PPi（NMNNMN）。3.AMP3.AMP与连接酶的与连接酶的赖氨酸赖氨酸-氨基氨基相连。相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2+H3NAMPATPPPi664.4.AMPAMP随后从连接酶的随后从连接酶的赖氨酸赖氨酸-氨基转移到氨基转移到DNADNA一一 条链的条链的5 5端端 P P 上，形成上，形成“DNA-DNA-腺苷酸腺苷酸”复合复合物。物。-OH HO-P-AMP-OHO-P-AMP675.5.3 3-OH-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出二酯键，释放出AMPAMP。68连接酶反应的最佳温度是连接酶反应的最佳温度是3737 C C。四、连接反应的温度四、连接反应的温度1.1.最佳温度最佳温度但在但在3737下下粘性末端粘性末端的结合很不稳定。的结合很不稳定。2.2.实用温度实用温度所以一般采用所以一般采用 416416 C C69增加插入片段与载体的接触机会，减增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。少同一个分子末端自我连接的现象。1.DNA1.DNA末端的浓度末端的浓度五、影响连接反应的因素五、影响连接反应的因素10201020倍倍2.2.插入片段与载体的浓度比例插入片段与载体的浓度比例 两种构型：线状分子和环状分子两种构型：线状分子和环状分子与与DNADNA浓度浓度及及DNADNA分子长度分子长度相关相关703.3.反应温度反应温度黏性末端：黏性末端：12121616平头末端：平头末端：101020204.ATP4.ATP浓度浓度一般，一般，ATPATP最适的终浓度为最适的终浓度为0.5mmol/L.0.5mmol/L.ATPATP浓度高至浓度高至5mmol/L5mmol/L，影响平头末端的连接，影响平头末端的连接ATPATP浓度高至浓度高至7.5mmol/L7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头，抑制粘性末端及平头末端的连接。末端的连接。71六、六、DNADNA连接的反应体系连接的反应体系酶切纯化后的酶切纯化后的DNADNA片断片断连接缓冲液连接缓冲液DNADNA连接酶连接酶72从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。应速度要慢得多。七七、平头双链平头双链DNA片段的连接操作片段的连接操作73加大连接酶用量（加大连接酶用量（加大连接酶用量（加大连接酶用量（1010倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）倍大于粘性末端的连接）