酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项.pptx

酶联免疫吸附试验（ELISA）手工操作注意事项酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第1页酶免疫测定类型 这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA。酶免疫技术酶免疫技术酶免疫组化酶免疫组化酶免疫测定酶免疫测定均相酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定液相酶免疫测定酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第2页ELISA原理（以一步法双抗体夹心法测抗原为例）ELISA其原理为抗原抗体特异性结合和抗原抗体酶标识，以酶催化底物显色来判断结果。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第3页影响酶联免疫测定原因较多,诸如标本采集保留、试剂准备、加样技术、孵育温度控制、洗涤反应板方式、显色反应时间控制等一系列问题都有可能对试验结果产生很大影响,只有防止了这些原因,才能确保试验结果准确性和可靠性。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第4页一、移液枪使用一、移液枪使用酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第5页1.样品准备（1）吸样之前要确保移液枪、枪头和液体处于相同温度。置于冰箱保留样品应提前取出，室温放置，使温度平衡后再吸样。液体温度 吸头温度 移取液体体积会 偏大 液体温度 吸头温度 移取液体体积会 偏小（2）若溶剂瓶中液体太少，可倒入EP管中，方便吸收。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第6页2.体积设定大体积 小体积 逆时针 精度最正确小体积 大体积 顺时针 调至超出设定刻度，再回调 可确保最正确准确度严格准确调整方法酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第7页3.装枪头 将移液枪端垂直插入吸头，左右微微转动，上紧即可上下敲击会引发内部零部件因瞬间强烈撞击而涣散，甚至会造成调整刻度旋钮卡住酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第8页4.吸液（1）垂直吸液，枪头吸嘴尖端需浸入液面2-4mm以下。（2）枪头吸嘴预润湿（2-3次），使吸嘴内壁液体吸附到达饱和，再吸入样液，最终打出液体体积会很准确。普通液体，正向吸液（一档二档）。粘稠液体和易挥发液体，可反相吸液（二档一档）。正向吸液反向吸液酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第9页（3）迟缓吸收，控制好弹簧伸缩速度。吸液速度太快会产生反冲和气泡，造成移液体积不准确和腐蚀枪体。（4）吸收后将移液枪提离液面，停约一秒钟，观察是否有液滴迟缓地流出。若有流出，说明有漏气现象（原因有：枪头未上紧；枪头不匹配；移液枪内部气密性不好）。（5）吸嘴外壁残留液滴可沿壁靠去或用滤纸蘸擦。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第10页5.放液（1）将吸嘴口贴到容器内壁并保持10-40倾斜。（2）平稳地把按钮压到一档，停约一秒钟二档，排出剩下液体。排放致密或粘稠液体时，压到一档后，再多等一两秒钟二档。（3）压住按钮，同时提起移液器，使吸嘴贴容器壁擦过。（4）松开按钮。（5）按弹射器除去移液嘴。（6）使用完成。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第11页移液枪养护及注意事项吸收液体时一定要迟缓平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防溶液吸入过快而冲入枪体内腐蚀柱塞造成漏气。移液枪应轻拿轻放，不能将已吸有液体移液枪平放或倒置，以免液体倒流腐蚀活塞弹簧。不得用移液枪移取有腐蚀性溶液，如强酸、强碱等。如有液体进入枪体，应及时擦干。千万不要将按钮旋出量程，不然会卡住内部机械装置而损坏移液枪。移液枪长时间不用时提议将刻度调至最大量程，让弹簧恢复原形，保持松弛状态，延长移液枪使用寿命。应定时对移液枪进行校准。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第12页二、二、ELISA详细操作详细操作1 标本搜集和保留2 试剂准备3 加样本及反应试剂4 温育5 洗板6 显色7 比色8 结果判断酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第13页1 标本搜集和保留未抗凝血标本离心前普通令其自行凝集，不可用木棍等剥离凝血块。通常于室温（2025）放置3060min，血标本可自发完全凝集，析出血清；或37水浴2030min，析出血清。以3000r/min转速离心510min，使血清分离完全。若过早离心，分离不全，血清中会残留部分纤维蛋白原，吸附于反应微孔，而且不易洗去，可与酶标识物非特异性结合，造成假阳性。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第14页1 标本搜集和保留（1）要注意防止出现严重溶血、脂血标本。血红蛋白中铁卟啉含有类似过氧化物酶活性，所以，在以辣根过氧化物酶（HRP）为标识酶ELISA测定中，如标本溶血，血清中血红蛋白浓度较高，则其很轻易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入底物反应，从而产生非特异性显色。脂血标本血清中大量脂质小粒易黏附于反应孔内壁，非离子型洗涤剂(如乳化剂OP)难以洗去，易产生非特异性吸附干扰。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第15页1 标本搜集和保留（2）血清标本宜在新鲜时检测，要注意尽可能防止细菌污染。血清标本如在冰箱中保留过久，IgG可发生聚合，AFP可形成二聚体，使本底加深，产生假阳性反应。细菌生长所分泌一些酶可能会反抗原抗体等蛋白产生分解作用；一些细菌内源性酶可对以对应酶作标识测定方法产生非特异性干扰。标本在保留中如出现细菌污染所致混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第16页1 标本搜集和保留（3）冰冻保留标本须注意防止因停电等造成重复冻融。标本重复冻融所产生机械剪切力将对标本中蛋白等分子产生破坏作用，从而引发假阴性结果。另外，冻结样本溶解后，蛋白质局部浓缩、分布不均，应上下颠倒轻缓混匀，防止气泡，不要在混匀器上强烈振荡。重复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体血清标本如需保留作屡次检测，宜少许分装冰冻保留。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第17页2 试剂准备 试剂盒成份：惯用固相载体（ELISA板孔）材质：聚苯乙烯、聚氯乙烯，含有良好吸附性能，孔底透明度高，空白值底，各板之间、同一板各孔之间性能相近。包被抗原或抗体与聚苯乙烯固相载体经过疏水基团作用物理吸附结合。惯用酶：HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。洗液：非离子型洗涤剂酶反应底物：H2O2，为受氢体；显色剂：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS，为供氢体。终止液为硫酸。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第18页2 试剂准备（1）在试验开始前，将试剂盒先从冰箱中取出，在室温下放置30分钟以上，再进行测定，以使试剂盒在使用前与室温平衡。这么做目标，主要是为了缩短升温时间，使反应孔内温度能较快地到达所要求高度，以满足测定要求。（2）试剂盒中洗涤液如需在使用时对所提供浓缩液稀释配制，稀释时所用蒸馏水或去离子水应确保质量。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第19页3 加样本及反应试剂在ELISA试验中普通有3次加样步骤，即加标本、加酶结合物、加底物和显色剂。加样必须注意关键点是：（1）加样不可太快，要防止加在孔壁上部，不可溅出和产生气泡。加样时如有气泡，抗原抗体不能有效地结合会造成弱阳性甚至假阴性。（2）每次加标本应更换吸头，以免发生交叉污染。有些测定需用稀释血清，应确保稀释液与血清混合均匀。（3）加酶结合物、加底物，应使加液量准确均一、加液过程快速完成。也可使用试剂盒提供滴瓶直接滴加。滴加时，除了要注意滴加角度垂直、一致外，滴加速度也很主要。滴加太快，很轻易出现重复滴加或加在两孔之间现象。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第20页4 温育温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键一个原因。ELISA属于固相免疫测定，要使液相中抗原或抗体与固相上特异性抗体或抗原完全结合，必须在一定温度条件下反应一定时间。普通温育所需时间与温度成反比，即温度越高，所需时间相对较短。最为惯用温度有37和室温(2025)，其次是43和28，当前国内ELISA商品试剂盒反应温育时间通常为373060分钟。关于温育，在实际测定操作中一定要注意以下几点：酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第21页（1）要确保在设定温度下有足够反应时间。普通来说，加完样本或反应试剂后，将微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37，需要一定时间，尤其是在室温比较低室温比较低以及非水浴状态非水浴状态下，这段升温时间可能还比较长，而在临床试验中，极少有些人注意这个问题，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这么就很轻易造成在实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来问题。为确保37下足够温育时间，试验室水浴状态应确保微孔板底贴着水面板底贴着水面，使温度快速平衡。为防止蒸发，板上应贴片或封盖。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第22页（2）温育温度选择。在有ELISA试剂盒说明书中，指出温育温度可有两种，比如，一个是37下1小时，另一个则为43下45分钟。从免疫测定抗原抗体反应本质来看，在较低温度下反应较长时间最为完全，产物最稳定。如28下反应24小时。较高反应温度，因为分子运动加紧，反应时间缩短，这一点对分子含量较多强阳性样本测定没有问题，但对分子含量少弱阳性样本则有漏检可能。所以，如须选择反应条件，提议在临床ELISA测定中尽可能使用较低温度较长反应时间条件。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第23页（3）“边缘效应”排除。以前在使用96孔板ELISA测定中，常发觉有“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深。聚苯乙烯本身为不良热导体，在试验室常规ELISA测定中，将板从室温置于37温箱(非水浴)，板孔升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。所以反应板不宜叠放，以确保各板温度都能快速平衡。而将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，可使温度快速平衡。让反应板飘浮在水面上。就能够很轻易地排除“边缘效应”，而且可提升测定重复性。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第24页5 洗板洗涤在ELISA虽不是一个反应步骤，但也决定着试验成败。ELISA就是靠洗涤去除残留在板孔中没能与固相抗体（抗原）结合物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体干扰物质，以确保ELISA测定特异性。洗涤液为非离子型洗涤剂中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质结合是疏水性，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。在试验室中，ELISA测定洗板普通有两种方式，即手工和洗板机洗板。为确保微孔板均一性使结果准确可靠，最好选取洗板机洗板。若手工洗板，要注意浸泡时间和孔间洗液最好不要相互流动。流水冲洗法让水流冲击板孔表面，简便、快速，洗涤效果很好。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第25页6 显色在以HRP作为标识酶ELISA试剂盒中，普通显色反应条件为37或室温反应1530分钟。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间延长而呈色加强。TMB（四甲基联苯胺）经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐步减弱，至2小时后可完全消退至无色。TMB终止液有各种，酸性终止液（硫酸）会使蓝色转变成黄色，此时可用特定波长（450nm）测读吸光值。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第26页7 比色ELISA比色测定由酶标仪进行。此处强调以下几点：（1）酶标仪不应安置在阳光或强光照射下，室温宜在1530，使用前先预热仪器使用前先预热仪器15153030分钟分钟，测读结果更稳定。各种酶标仪性能不一样，使用前应详细阅读说明书。（2）比色前应先用洁净吸水纸拭干板底附着液体拭干板底附着液体，然后将板正确放入比色架中，以免锈蚀酶标仪比色架。（3）比色测定时，一定要注意酶标仪波长是否已调至适当或所用滤光片是否正确。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第27页（4）单波长或双波长比色选择问题。所谓单波长比色即是通常以对显色含有最大吸收波长如450nm或492nm进行比色测定；而双波长比色则在敏感波长如450nm和非敏感波长如630nm下各测定一次，最终酶标仪给出数值为敏感波长下吸光度值与非敏感波长下吸光度值差值。所以，双波长比色测定含有能排除由微孔板本身、板孔内标本非特异性吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色干扰优点。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第28页8 结果判断临床ELISA测定按其表示测定结果方式分为定性和定量测定两大类。定性测定只是对标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”结论，分别用“阳性”和“阴性”来表示；定量测定，每批测试均须用一系列不一样浓度标准品在相同条件下制作标准曲线。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第29页产生非特异性显色原因1 1试剂盒原因试剂盒原因：固相载体原料不一样和制作工艺差异、包被物提纯度、固相载体表面未被包被空隙封闭不良等；2 2人为原因人为原因：加样、洗板、温育、判断结果中操作不妥或责任心不强等造成假阳性或假阴性；3 3标本中含有干扰物标本中含有干扰物：4 1.内源性干扰物包含类风湿因子(RF)、黄疸等：类风湿因子可作用于各种动物及人IgG Fc段本身抗体，多数为IgM类，能充当抗原成份与固相酶标识抗体反应，从而呈非特异性显色；黄疸血标本中常含有内源性过氧化物酶，如用HRP为标识物,测定有可能产生非特异性显色。5 2.外源性干扰物经常因样品采集、储存、处理不妥造成样品溶血，被细菌污染，标本凝集不全等。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第30页ELISA实际操作中常见问题和处理方法酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第31页酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第32页酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第33页总结总结严谨设计、严谨设计、优质试剂、良好仪器和正确优质试剂、良好仪器和正确操作是确保操作是确保ELISA检测结果准确可靠必检测结果准确可靠必要条件。要条件。严格遵照要求操作，必能得出准确结果。严格遵照要求操作，必能得出准确结果。酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第34页酶联免疫吸附试验ELISA手工操作注意事项第35页