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回忆：植物体细胞杂交过程：回忆：植物体细胞杂交过程：植物细胞植物细胞A植物细胞植物细胞B去除细胞壁去除细胞壁去除细胞壁去除细胞壁原生质体原生质体A原生质体原生质体B诱导融合诱导融合杂合的原生质体杂合的原生质体再生出细胞壁再生出细胞壁杂种细胞杂种细胞细胞分裂（脱分化）细胞分裂（脱分化）分化发育（再分化）分化发育（再分化）愈伤组织愈伤组织杂种植株杂种植株原生质体的原生质体的制备制备原生质体的原生质体的融合融合筛选筛选组织培养组织培养1 1、如果让动物细胞进行融合、如果让动物细胞进行融合/杂交，应注意杂交，应注意动、植物之间的哪些区别？动、植物之间的哪些区别？无细胞壁无细胞壁全能性受限制，不能发育成杂种动物全能性受限制，不能发育成杂种动物2 2、请设计动物细胞融合的流程。、请设计动物细胞融合的流程。动物细胞融合与植物细胞杂交的不同：动物细胞融合与植物细胞杂交的不同：无需去除细胞壁无需去除细胞壁 不能培养成新的动物个体不能培养成新的动物个体 动动物物细细胞胞融融合合过过程程不同不同DNADNA的的两个细胞两个细胞 灭活的病毒灭活的病毒有丝分裂有丝分裂两个完整的两个完整的杂交细胞杂交细胞1、为什么可以、为什么可以用灭活的病毒？用灭活的病毒？2、病毒不灭活、病毒不灭活可以吗？可以吗？不灭活的话会感不灭活的话会感染细胞，而不能诱染细胞，而不能诱导细胞融合。导细胞融合。病毒表面含有的糖病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够使蛋白和一些酶能够使细胞膜上的蛋白质分细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细布，细胞膜打开，细胞发生融合。胞发生融合。细胞融合技术发展史资料一：20世纪30年代，科学家们相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等疾病患者的病理组织中观察到了多核细胞。资料二：20世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象。说明：动物细胞融合现象在自然界是普遍存在的，这为动物细胞融合的研究创造了基础。但受到当时科技发展水平的限制，这些现象并没有但受到当时科技发展水平的限制，这些现象并没有引起人们的足够重视。引起人们的足够重视。资料三：1962年，日本科学家发现日本血凝性病毒能够引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞的现象。资料四：1965年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当条件下也可以又发动物细胞融合。后来，科学家又成功诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活。1970 1970年，有两位科学家年，有两位科学家做了一个著名的实验：做了一个著名的实验：人人鼠细胞融合的实验，鼠细胞融合的实验，以证明细胞膜上的蛋白以证明细胞膜上的蛋白质分子是运动的。质分子是运动的。人人鼠细胞是怎样实现鼠细胞是怎样实现融合的？动物细胞融合有什融合的？动物细胞融合有什么实践意义呢？么实践意义呢？一、一、动物细胞融合动物细胞融合1.1.概念：概念：也称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融也称细胞杂交，是指两个或两个以上的细胞融合为一个细胞的过程。合为一个细胞的过程。融合和形成的具有原来两个或多个细胞遗传物融合和形成的具有原来两个或多个细胞遗传物质的单核细胞，称为质的单核细胞，称为杂交细胞杂交细胞。2.2.动物细胞融合的原理：动物细胞融合的原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性正在融合的正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞淋巴细胞与骨髓瘤细胞 正在融合的鸡正在融合的鸡血细胞血细胞 两个细胞正在融合 受精作用细胞A细胞B杂种细胞灭活的病毒诱导方法：物理法化学法生物法：仙台病毒疱疹病毒新城鸡瘟病毒3、过程（P52)融合成功的标志：杂交细胞进行有丝分裂重组细胞特点：杂交细胞具有两个细胞的遗传物质，能表现两亲本的性状注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞 病毒病毒紫外线紫外线灭活灭活丧失感染活性（不感染细胞）丧失感染活性（不感染细胞）保留融合活性（诱导细胞融合）保留融合活性（诱导细胞融合）什么是什么是病毒的灭活？病毒的灭活？灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能灭活是指用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。力，但是并不破坏病毒的抗原结构。4.诱导动物细胞融合的方法有：诱导动物细胞融合的方法有：物理法、化学法、生物法物理法、化学法、生物法 诱导因素：聚乙二醇、诱导因素：聚乙二醇、灭活的病毒灭活的病毒或电激等。或电激等。因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合 5.5.特点：特点：突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能；6.6.动物细胞融合技术的应用：动物细胞融合技术的应用：应用于细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品应用于细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育等方面。种培育等方面。特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤特别是利用细胞融合技术而发展起来的杂交瘤技术技术为制造为制造单克隆抗体单克隆抗体开辟了新途径。开辟了新途径。主要用于制备主要用于制备单克隆抗体单克隆抗体获得杂种植株获得杂种植株用途用途物理、化学方法物理、化学方法（同左同左）灭活的病毒灭活的病毒物理（离心、振物理（离心、振动、电刺激）动、电刺激）化学（聚乙二醇）化学（聚乙二醇）诱导方法诱导方法使细胞分散后诱使细胞分散后诱导细胞融合导细胞融合去除细胞壁后诱去除细胞壁后诱导原生质体融合导原生质体融合细胞融合的方法细胞融合的方法细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性细胞膜的流动性、植物细胞全能性植物细胞全能性原理原理动物细胞融合动物细胞融合植物体细胞杂交植物体细胞杂交比较项目比较项目植物、动物细胞融合的比较植物、动物细胞融合的比较归纳：一、动物细胞融合（细胞杂交）归纳：一、动物细胞融合（细胞杂交）（P52P52）1.1.概念概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。的过程。2.2.结果结果：形成含有形成含有2或多个细胞遗传物质的单核杂交细胞或多个细胞遗传物质的单核杂交细胞3.3.融合原理融合原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性4.4.诱导方式诱导方式物理法：离心、振动、电激物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（化学法：聚乙二醇（PEG)PEG)生物法：灭活的病毒生物法：灭活的病毒5.5.意义：意义：突突破破有性杂交局限有性杂交局限，使远缘杂交成为可能，使远缘杂交成为可能广泛应用广泛应用多个领域（研究细胞遗传、细胞多个领域（研究细胞遗传、细胞 免疫、肿瘤和生物新品种培育等）免疫、肿瘤和生物新品种培育等）重要用途：重要用途：制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体制备单克隆抗体 回 顾1、抗体的化学本质？2、抗体由什么细胞产生？3、抗体的作用特点？4、抗体的分布？二、单克隆抗体的制备思 考：如何获取某种特定抗体？探究：单克隆抗体制备的原理探究：单克隆抗体制备的原理1、抗体是从何来的？传统的抗体生产方、抗体是从何来的？传统的抗体生产方法及缺陷是什么？法及缺陷是什么？传统的抗体生产方法是向动物体内反复注传统的抗体生产方法是向动物体内反复注射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动射某种抗原，使动物产生抗体，然后从动物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗物血清中分离所需要的抗体。这种生产抗体的方法产量和纯度都很低，而且制备的体的方法产量和纯度都很低，而且制备的抗体特异性差。抗体特异性差。抗体的传统生产方法再从动物再从动物血清血清中分离抗体中分离抗体该法制备抗体的特点：该法制备抗体的特点：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。输入浆细胞动物体内 某抗体 某抗原 思考与探究：思考与探究：如何获得大量化学性质单一、特异性强的抗体？如何获得大量化学性质单一、特异性强的抗体？1 1）.抗体是由何种细胞产生的？抗体是由何种细胞产生的？B淋巴细胞淋巴细胞浆细胞（效应浆细胞（效应B细胞）细胞）2 2）.一个一个B B淋巴细胞能产生多种抗体吗？淋巴细胞能产生多种抗体吗？每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。每一个淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。3 3）.动物免疫反应产生的抗体只有一种吗？动物免疫反应产生的抗体只有一种吗？针对不同抗原，针对不同抗原，B淋巴细胞可以产生百万淋巴细胞可以产生百万种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有种以上的抗体，每种抗体对特定的抗原具有特异性免疫作用。特异性免疫作用。2.B2.B淋巴细胞与抗体的关系：淋巴细胞与抗体的关系：问题：体外培养条件下一个B淋巴细胞不可能无限增殖，无法克隆单一的B淋巴细胞 科学家的设想：克隆（无性繁殖）单一的科学家的设想：克隆（无性繁殖）单一的B B淋巴细淋巴细胞，形成细胞群，产生大量高纯度抗体。胞，形成细胞群，产生大量高纯度抗体。存在的困难：存在的困难：体外培养的体外培养的B B淋巴细胞不可无限增殖淋巴细胞不可无限增殖问题问题1 1：哪种细胞可以无限增殖呢？：哪种细胞可以无限增殖呢？肿瘤细胞肿瘤细胞问题问题2 2：怎样让细胞：怎样让细胞既能大量繁殖，又能产生既能大量繁殖，又能产生专一抗体专一抗体呢？呢？B B淋巴细胞与肿瘤细胞进行细胞融合淋巴细胞与肿瘤细胞进行细胞融合,制备单克隆抗体制备单克隆抗体怎样获得大量高纯度抗体呢？怎样获得大量高纯度抗体呢？一个一个B B淋巴细胞淋巴细胞只分泌一种特异性抗体只分泌一种特异性抗体小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞能无限增殖能无限增殖杂交瘤细胞既能分泌一种特异性抗体既能分泌一种特异性抗体又能无限增殖又能无限增殖19751975年英国科学家年英国科学家米尔斯坦米尔斯坦和和柯勒柯勒设想：设想：问题问题1 1：怎样让动物产生特异性针对某种抗原的：怎样让动物产生特异性针对某种抗原的B B淋巴细胞（浆细胞）？淋巴细胞（浆细胞）？对动物注射这种抗原，产生免疫反应对动物注射这种抗原，产生免疫反应 问题问题2 2：诱导融合后，培养液中会有几种细胞？如：诱导融合后，培养液中会有几种细胞？如何处理？何处理？5 5种（种（BB;BBB;B瘤瘤;瘤瘤瘤瘤;B B细胞细胞;瘤细胞瘤细胞），筛选），筛选 问题问题3 3：从动物体内提取：从动物体内提取B B淋巴细胞时，能否确保淋巴细胞时，能否确保B B淋巴细胞的单一性？杂交的细胞是否都是符合要淋巴细胞的单一性？杂交的细胞是否都是符合要求的？求的？不能，可能存在多种不能，可能存在多种B B淋巴细胞，融合为多种淋巴细胞，融合为多种杂交瘤细胞，所以需多次检验、筛选后，才能大杂交瘤细胞，所以需多次检验、筛选后，才能大规模培养，获得专一抗体。规模培养，获得专一抗体。B淋巴细胞淋巴细胞骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞细胞融合细胞融合 筛选（选择性培养基）筛选（选择性培养基）杂交瘤细胞杂交瘤细胞细胞培养细胞培养克隆培养、抗体检测、克隆培养、抗体检测、多次筛选多次筛选足够数量、能分泌足够数量、能分泌单一抗体的细胞群单一抗体的细胞群单克隆抗体制备过程单克隆抗体制备过程 注射抗原注射抗原体内培养体内培养体内培养体内培养体外培养体外培养体外培养体外培养单克隆抗体单克隆抗体杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞特点：特点：特点：特点：既能迅速既能迅速既能迅速既能迅速大量增殖，大量增殖，大量增殖，大量增殖，又能产生专又能产生专又能产生专又能产生专一抗体。一抗体。一抗体。一抗体。诱导融合筛选培养杂交瘤细胞（B-瘤细胞）克隆化培养抗体检测多次筛选足量单一类型杂交瘤细胞体外培养小鼠腹腔体内培养单克隆抗体单克隆抗体制备流程图单克隆抗体制备流程图B淋巴细胞骨髓瘤细胞小鼠免疫小鼠免疫B-B细胞B-瘤细胞瘤-瘤细胞未融合细胞单克隆抗体单克隆抗体的优点：的优点：纯度高纯度高,特异性强特异性强,灵敏度高灵敏度高,产量大产量大选择性培养基选择性培养基诱导其融合的方法有哪些？诱导其融合的方法有哪些？融合后培养液中有几种细胞融合后培养液中有几种细胞怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交怎样筛选出杂交瘤细胞，杂交瘤细胞有何优点瘤细胞有何优点注射抗原的目的是什么注射抗原的目的是什么大量增殖杂交瘤细胞获得单大量增殖杂交瘤细胞获得单抗的方法抗的方法整个制备过程经过几次筛选第一次筛选 筛选方法：筛选结果：第二次筛选筛选方法：筛选结果：用特定的选择培养基得到杂交瘤细胞（多种）抗体检测产生专一性抗体的杂交瘤细胞。克隆单个杂交瘤细胞所产生的化学性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。单单：一个杂交瘤细胞克隆：克隆：该细胞增殖分化为相同的细胞群抗体：抗体：该细胞群产生的抗体。单克隆抗体定义原理免疫学、细胞膜的流动性、细胞增殖三、单克隆抗体的应用三、单克隆抗体的应用（1）作为诊断试剂）作为诊断试剂最广泛的用途最广泛的用途 准确、高效、简易、快速准确、高效、简易、快速 如：同位素标记单克隆抗体，可诊断肿如：同位素标记单克隆抗体，可诊断肿瘤、心血管畸形等瘤、心血管畸形等（2）治疗疾病：）治疗疾病：运载药物：运载药物：生物导弹生物导弹=单克隆抗体单克隆抗体+药物，药物，治疗肿瘤治疗肿瘤(“(“生物导弹生物导弹生物导弹生物导弹”单抗制导瞄准，药物为弹药单抗制导瞄准，药物为弹药单抗制导瞄准，药物为弹药单抗制导瞄准，药物为弹药)主要用于癌症治疗主要用于癌症治疗瞄准癌细胞的生物导弹瞄准癌细胞的生物导弹优势：既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。优势：既不损伤正常细胞，又减少了用药剂量。动物细动物细胞融合胞融合单克隆单克隆抗体制备抗体制备过程：过程：原理：原理：细胞膜的流动性细胞膜的流动性意义：意义：突突破破有性杂交局限有性杂交局限，使远缘杂交成为可能，使远缘杂交成为可能应用：应用：主要用于制备单克隆抗体主要用于制备单克隆抗体制备过程：制备过程：特点：特点：特异性强特异性强,灵敏度高灵敏度高,产量大产量大应用：应用：用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物1在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中，正确的是（）正确的是（）A结果是相同的结果是相同的B杂种细胞的形成过程基本相同杂种细胞的形成过程基本相同C操作过程中酶的作用相同操作过程中酶的作用相同D诱导融合的手段相同诱导融合的手段相同练习：练习：2.2.用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，科学家用小鼠骨髓瘤细胞与某种细胞融合，科学家得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆得到杂交细胞，经培养可产生大量的单克隆抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（抗体，与骨髓瘤细胞融合的是（）A.A.经过免疫的经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞 B.B.经过免疫的经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 C.C.不经过免疫的不经过免疫的T T淋巴细胞淋巴细胞 D.D.不经过免疫的不经过免疫的B B淋巴细胞淋巴细胞A.单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和单克隆抗体制备过程中，骨髓瘤细胞和B淋巴细胞淋巴细胞诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，诱导融合后，要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞，在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（在这种培养基上不能存活增殖的细胞是（）淋巴细胞淋巴细胞小鼠骨髓瘤细胞小鼠骨髓瘤细胞B淋巴细胞自身融合细胞淋巴细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞 A B C D C4 4、研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（、研究单克隆抗体治疗癌症的思路是（）A A利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞利用单克隆抗体特异性地对抗癌细胞 B B以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞以单克隆抗体作抗癌药物杀死癌细胞C C抗癌物质在克隆细胞中大量合成抗癌物质在克隆细胞中大量合成D D单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细单克隆抗体携带抗癌药物特异性地与癌细胞结合胞结合DB B体外培养体外培养骨髓瘤细胞骨髓瘤细胞杂交瘤细胞杂交瘤细胞足够数量的细胞群足够数量的细胞群注射到注射到小鼠腹腔小鼠腹腔A AC C 5.5.下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤风杆菌的实验方案破伤风杆菌的实验方案制备单克隆抗体制备单克隆抗体 不能，没有注射抗原，无法获得产生不能，没有注射抗原，无法获得产生单一抗体的单一抗体的B B淋巴细胞。淋巴细胞。(1)(1)该实验方案的目的是：该实验方案的目的是：(2)(2)该方案能达到预期效果吗？为什么？该方案能达到预期效果吗？为什么？(3)A(3)A是从小鼠的脾脏中取得是从小鼠的脾脏中取得_ _ 该该细胞能够产生细胞能够产生_ _。(4).(4).图中图中B B为为_过程，常过程，常用用_诱导，该细胞继承诱导，该细胞继承双亲细胞的遗传特性，既能双亲细胞的遗传特性，既能_ _,_,又能又能_。B B淋巴细胞淋巴细胞抗体抗体细胞融合细胞融合灭活的病毒灭活的病毒分泌专一抗体分泌专一抗体迅速大量增殖迅速大量增殖
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