液相色谱实验操作.pdf

Waters中国有限公司培训中心中国有限公司培训中心液相色谱教程液相色谱教程(三三)液相色谱实验操作液相色谱实验操作2004 Waters Corporation启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程?开启开启HPLC系统各个设备的电源系统各个设备的电源打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件?准备流动相准备流动相过滤,脱气过滤,脱气?色谱泵排气色谱泵排气用新配制的流动相灌注泵用新配制的流动相灌注泵2004 Waters Corporation启动液相色谱仪器的流程启动液相色谱仪器的流程?用准备好的流动相平衡色谱系统用准备好的流动相平衡色谱系统可在泵的控制面板上设定流速参数(155泵需在软件控制下操作)可在泵的控制面板上设定流速参数(155泵需在软件控制下操作)系统大约需平衡0.5-1小时方能稳定工作系统大约需平衡0.5-1小时方能稳定工作?准备样品准备样品用流动相溶样或重组样品用流动相溶样或重组样品?编制仪器方法,开始实验编制仪器方法,开始实验2004 Waters Corporation液相色谱对流动相的要求液相色谱对流动相的要求?色谱柱对流动相的要求色谱柱对流动相的要求 过滤除去微粒过滤除去微粒 纯度的要求纯度的要求?超纯水，或用超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水处理过的双蒸水?有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，并与填料相匹配并与填料相匹配 缓冲液的缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内2-8)内 缓冲液（盐）的浓度不要太高(缓冲液（盐）的浓度不要太高(100mM)流动相对样品的溶解度流动相对样品的溶解度?调整有机溶剂和水的比例调整有机溶剂和水的比例?最好用流动相溶样最好用流动相溶样2004 Waters Corporation液相色谱对流动相的要求液相色谱对流动相的要求?液相色谱仪器对流动相的要求液相色谱仪器对流动相的要求 与检测器匹配与检测器匹配 脱气脱气 避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）溶剂的粘度溶剂的粘度 防止细菌的生长防止细菌的生长2004 Waters Corporation流动相的脱气流动相的脱气?流动相脱气的目的流动相脱气的目的 使色谱泵的输液准确使色谱泵的输液准确?输液量均匀准确，并且脉动减小输液量均匀准确，并且脉动减小?保留时间及色谱峰面积的重现性提高保留时间及色谱峰面积的重现性提高 提高检测的性能提高检测的性能?防止气泡引起的尖峰防止气泡引起的尖峰?基线稳定，信噪比增加基线稳定，信噪比增加?溶剂的紫外吸收本底降低溶剂的紫外吸收本底降低 保护色谱柱保护色谱柱?减少死体积减少死体积?防止填料的氧化防止填料的氧化2004 Waters Corporation流动相脱气的方法流动相脱气的方法?加热加热 简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化?抽真空抽真空 同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果?超声波振荡超声波振荡 简单，但效果不够理想；超声时间不要太长简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可分钟左右即可)?通惰性气体（一般用氦气）通惰性气体（一般用氦气）可保持在线连续脱气，多用于低压梯度可保持在线连续脱气，多用于低压梯度?在线脱气机（在线脱气机（in-line degasser)可保持连续脱气，多用于低压梯度可保持连续脱气，多用于低压梯度2004 Waters Corporation流动相的保存流动相的保存?有机溶剂流动相:有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存室温下密封,避光保存?缓冲盐流动相:缓冲盐流动相:当日现配现用当日现配现用 低温下密封保存,一般不超过3天低温下密封保存,一般不超过3天 防止微生物生长防止微生物生长?有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存低温密封保存 防止有机相的挥发防止有机相的挥发?选用适宜的容器选用适宜的容器2004 Waters Corporation保存于聚乙烯瓶中的超纯水保存于聚乙烯瓶中的超纯水2 星期1 天1 星期1 小时新鲜配制5101520250测试条件水样测试条件水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18 反相柱反相柱(Waters)梯度梯度:线性线性 100%水水 100%乙腈波长乙腈波长:254 nm分2004 Waters Corporation保存于棕色玻璃瓶中的超纯水保存于棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件测试条件水样水样:40ml trace enrichment 2.0 ml/min色谱柱色谱柱:C18 反相柱反相柱(Waters)梯度梯度:线性线性 100%水水 100%乙腈乙腈波长波长:254 nm1 天1星期新鲜配制5101520250分2004 Waters Corporation色谱泵的排气操作色谱泵的排气操作?色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动相中 打开泵及在线脱气机电源开关打开泵及在线脱气机电源开关 将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路 设置流速到设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出排液阀出口有液流连续流出 必要时(600泵)用必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相注射器从泵入口注入流动相 对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作 停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用?注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十Psi以内),否则,需重做排气操作Psi以内),否则,需重做排气操作2004 Waters CorporationWaters 515 泵的前面板泵的前面板?电源开关电源开关?柱塞杆清洗孔柱塞杆清洗孔?排液阀排液阀2004 Waters CorporationWaters 600泵的前面板泵的前面板电源开关电源开关泵控制器泵控制器排液阀排液阀柱塞杆柱塞杆清洗孔清洗孔泵体泵体泵灌注阀泵灌注阀2004 Waters CorporationWaters 2695 分离单元分离单元溶剂瓶盘溶剂瓶盘注射器箱门注射器箱门柱温箱溶剂配比单元进入门柱温箱溶剂配比单元进入门检测器接液盘前面板显示屏和键盘软盘驱动器样品室门溶剂输送单元进入门检测器接液盘前面板显示屏和键盘软盘驱动器样品室门溶剂输送单元进入门2004 Waters Corporation2695排气操作示意图排气操作示意图?面板操作:面板操作:打开状态(打开状态(Statas)画面)画面按右下角按右下角Direct Function功能键功能键选选 Dry Pime或或Wet Prime命令命令选选OK即可进行泵的排气即可进行泵的排气?注注:当流路中充满空气时当流路中充满空气时,按图示做按图示做Dry Prime若只是更新流动相时若只是更新流动相时,只须作只须作Wet Prime2004 Waters Corporation关于色谱系统的反压关于色谱系统的反压?什么是反压什么是反压(back pressure)流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,流动相流经管路及色谱柱时会有阻力,即所谓的反压,又称系统反压或系统压力又称系统反压或系统压力Waters习惯用的压力单位是习惯用的压力单位是Psi(磅磅/平方英吋平方英吋)其它单位有其它单位有:Bar,Mpa?影响系统反压的主要因素:影响系统反压的主要因素:流动相的溶剂组成流动相的溶剂组成温度温度流速流速2004 Waters Corporation反压与溶剂组成的关系反压与溶剂组成的关系Pressure vs.Organic-Water Percentage02004006008001000120014001600020406080100Percent Organic SolventpsiMeOHACN?流动相的粘度是产生反压的主要原因流动相的粘度是产生反压的主要原因?有机溶剂水的粘度随组成而改变有机溶剂水的粘度随组成而改变?其压力随组成变化如下图所示其压力随组成变化如下图所示2004 Waters Corporation反压与流速的关系反压与流速的关系?流速对反压的影响是线性关系流速对反压的影响是线性关系?流速增加，反压亦增大流速增加，反压亦增大?下图的实验条件：下图的实验条件：2.130mm Symmetry C18柱柱,20Pressure vs.Flow Rate at 20?C05001000150020002500300035004000450050000.00.20.40.60.81.01.2mL/minpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN2004 Waters Corporation反压与温度的关系反压与温度的关系?温度对反压的影响是反比关系温度对反压的影响是反比关系?温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些温度升高,反压降低,对某些流动相的影响更大一些Pressure vs.Temperature050010001500200025003000350040004500500010.020.030.040.050.060.070.0Degrees,Cpsi50%MeOH50%ACN100%H2O100%MeOH100%ACN2004 Waters Corporation影响系统反压的其它因素影响系统反压的其它因素?反压与色谱柱长度成正比反压与色谱柱长度成正比?反压与填料颗粒度的平方成反比反压与填料颗粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反压高2.5m填料比3.5m填料反压高?反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)反压与管路直径的四次方成反比(1/D4)?反压与管路的长度成正比反压与管路的长度成正比2004 Waters Corporation色谱泵的运行色谱泵的运行?排气后的色谱泵即可用于实验运行排气后的色谱泵即可用于实验运行 注意注意?排气后，先设流速为 0排气后，先设流速为 0?恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱?如需要，恢复排气时断开的控制线如需要，恢复排气时断开的控制线?根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值?若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作)若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作)2004 Waters Corporation色谱泵的维护保养色谱泵的维护保养?流动相要过滤流动相要过滤?常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔?关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准?更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不溶，要用一种中间溶剂过渡更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不溶，要用一种中间溶剂过渡?色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中2004 Waters Corporation液相色谱系统的清洗与钝化液相色谱系统的清洗与钝化?色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理色谱泵吸滤头,进出口阀及管路(包括进样器和检测池)若被污染,应作清洗和钝化处理?一般采用一般采用30磷酸水溶液作为清洗剂，用磷酸水溶液作为清洗剂，用6M硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化硝酸作为钝化剂，先清洗再钝化?清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢清洗的目的是去除不锈钢管路及系统内的污垢?钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜钝化的目的是使不锈钢管路的内表面形成光滑均匀的氧化膜2004 Waters Corporation色谱泵及系统的清洗色谱泵及系统的清洗?清洗液用清洗液用30%磷酸水溶液磷酸水溶液?30%磷酸配制:取磷酸配制:取85%浓磷酸浓磷酸35ml与与65ml水混匀水混匀?清洗步骤如下:清洗步骤如下:取下色谱柱，用两通(取下色谱柱，用两通(Union)连接进样器和检测器)连接进样器和检测器 用纯水灌注泵头(四元泵的用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为四路各为25%)用用30%磷酸清洗液洗系统(磷酸清洗液洗系统(1ml/min流速)流速)45分钟分钟(四元泵的(四元泵的A,B,C,D四路各为四路各为25%)换成清水洗至出口水换成清水洗至出口水pH显中性显中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用2004 Waters Corporation色谱泵及系统的钝化色谱泵及系统的钝化?钝化液用钝化液用6M硝酸水溶液硝酸水溶液?6M硝酸的配制:取浓硝酸硝酸的配制:取浓硝酸40ml与与60ml水混匀水混匀?钝化步骤如下:钝化步骤如下:在清洗步骤完成后进行钝化处理在清洗步骤完成后进行钝化处理 确认清洗用的磷酸已基本洗净确认清洗用的磷酸已基本洗净 用纯水灌注泵头(四元泵的用纯水灌注泵头(四元泵的A,B,C,D四路各为四路各为25%)用用6M硝酸水溶液钝化系统(硝酸水溶液钝化系统(1ml/min流速)流速)45分钟分钟 换成清水洗至出口水换成清水洗至出口水pH显中性显中性 用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用用纯甲醇过渡，浸润泵头及管路，备用2004 Waters Corporation实验样品的制备实验样品的制备?标样和样品标样和样品 标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参考标准物,一般是纯度较高的纯物质考标准物,一般是纯度较高的纯物质 样品:待测物,一般是成分复杂的混合物样品:待测物,一般是成分复杂的混合物?液相色谱对样品液相色谱对样品(包括标样包括标样)制备的要求制备的要求:必须能溶于流动相必须能溶于流动相?如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和色谱柱 样品溶液要过滤除去微粒及杂质样品溶液要过滤除去微粒及杂质 了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用了解样品对色谱柱的基质/填料是否有破坏作用2004 Waters Corporation复杂样品的预处理复杂样品的预处理?样品预处理的目的样品预处理的目的除去微粒除去微粒减少干扰杂质减少干扰杂质浓缩微量的组份浓缩微量的组份提高检测的灵敏度及选择性提高检测的灵敏度及选择性改善分离的效果改善分离的效果有利于保护色谱柱及仪器有利于保护色谱柱及仪器2004 Waters Corporation样品预处理的重要性样品预处理的重要性是影响实验成败的决定性步骤是影响实验成败的决定性步骤?占样品分析时间的比例最大占样品分析时间的比例最大 样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间样品预处理所用时间远多于色谱分离的时间?占分析消耗总成本的比重最大占分析消耗总成本的比重最大 消耗大量的溶剂及其它化学品消耗大量的溶剂及其它化学品?对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节对分析结果的重现性及准确性影响最大的环节 影响实验结果好坏的最重要因素影响实验结果好坏的最重要因素2004 Waters Corporation样品预处理常用的方法样品预处理常用的方法?高速离心取上清液高速离心取上清液?过滤、超滤过滤、超滤?选择性沉淀选择性沉淀?衍生反应衍生反应?液-液萃取液-液萃取?固相提取(固相提取(Solid Phase Extract,SPE)Oasis 和和Sep-Pak固相提取小柱固相提取小柱?其它其它2004 Waters Corporation去除微粒的方法去除微粒的方法?过滤过滤 过滤膜过滤膜/过滤装置过滤装置?有机滤膜有机滤膜(0.5 m)/水溶性滤膜水溶性滤膜(0.45 m)?膜片可更换膜片可更换 一次性使用的膜“一次性使用的膜“Cartridge”?使用方便简单，交叉污染小使用方便简单，交叉污染小?有更小内径，可用于微量样品的处理有更小内径，可用于微量样品的处理?高速离心高速离心?大于：大于：10,000rpm2004 Waters Corporation超滤超滤?机理机理超滤是一种基于分子量分离的技术超滤是一种基于分子量分离的技术?目的目的根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份根据分子量的不同把分子、细胞及病毒等分为不同的馏份除去小分子样品中的大分子蛋白除去小分子样品中的大分子蛋白脱盐脱盐2004 Waters Corporation选择性沉淀选择性沉淀?常用于生化样品中除蛋白常用于生化样品中除蛋白有机溶剂有机溶剂?乙腈，甲醇乙腈，甲醇强酸强酸?三氯乙酸，高氯酸三氯乙酸，高氯酸盐盐?50%硫酸铵硫酸铵?10%TCA(三氯乙酸钠三氯乙酸钠)2004 Waters Corporation样品衍生样品衍生?提高检测的灵敏度提高检测的灵敏度 增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度增加紫外基团以增强紫外检测的灵敏度 增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器增加荧光基团以便使用高灵敏度荧光检测器?改变分离的选择性改变分离的选择性 改变组份的基团，如：改变组份的基团，如：?变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离变离子型化合物为非离子型，用反相方法分离?典型的例子典型的例子 柱前衍生氨基酸分析柱前衍生氨基酸分析2004 Waters CorporationAccQ-Tag 衍生法衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN+AQC衍生试剂及氨基酸衍生后的氨基酸CO2N-羟基琥珀酰亚胺N-羟基琥珀酰亚胺半衰期1秒半衰期约15秒6-氨基喹啉2004 Waters Corporation浓缩样品浓缩样品?目的：富集微量或痕量组份目的：富集微量或痕量组份?浓缩样品的方法浓缩样品的方法 萃取/吹干萃取/吹干 沉淀/再溶解沉淀/再溶解 色谱法色谱法 固相提取固相提取?Oasis小柱小柱?Sep-Pak小柱小柱2004 Waters CorporationOasis HLB固相提取小柱固相提取小柱?亲亲水水-亲-亲脂脂平衡共聚物平衡共聚物NO亲水性单体亲水性单体N-乙烯基吡咯烷酮乙烯基吡咯烷酮亲脂性单体亲脂性单体二乙烯基苯二乙烯基苯“亲脂亲脂”提供对被分析物质的反相保留能力提供对被分析物质的反相保留能力“亲水亲水”使填料具有水可浸润性质使填料具有水可浸润性质降低与水的接触角降低与水的接触角2004 Waters Corporation样品预处理的通用样品预处理的通用SPE方法方法活化/平衡1ml 甲醇/1ml 水1ml 甲醇/1ml 水上样多至 200 ml 样品多至 200 ml 样品冲洗废弃物1ml 5%甲醇/水溶液1ml 5%甲醇/水溶液洗脱想要的化合物1ml 甲醇1ml 甲醇挥发溶剂并重新定容制备样品?这是适合于分析众多基质中大多数样品的通用操作步骤这是适合于分析众多基质中大多数样品的通用操作步骤?建议首先使用这种通用的操作步骤建议首先使用这种通用的操作步骤?如果需要进一步降低干扰物的影响，可使用二维如果需要进一步降低干扰物的影响，可使用二维SPE方法方法?注:此 方 法 于 规 格 为注:此 方 法 于 规 格 为3 cc,60mg 的的 OasisHLB小柱上开发小柱上开发2004 Waters CorporationSPE处理的效果处理的效果2004 Waters Corporation进样器的使用进样器的使用?进样器的种类:进样器的种类:手动进样器手动进样器7725i 自动进样器自动进样器717Plus，2695样品管理系统样品管理系统?进样器与系统的连接：进样器与系统的连接：进样器的入口与色谱泵的出口相连进样器的入口与色谱泵的出口相连 进样器的出口与色谱柱的入口相连进样器的出口与色谱柱的入口相连 要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙要求：出入口方向不能接错，接头不能留有空隙?进样器的连接管路：进样器的连接管路：出口管路一定要用细管(内径0.009),长度要短,尽量减少谱带扩展出口管路一定要用细管(内径0.009),长度要短,尽量减少谱带扩展2004 Waters Corporation手动进样器的使用手动进样器的使用?7725i手动进样器的进样方式:手动进样器的进样方式:固定体积进样:进样量取决于固定体积进样:进样量取决于Loop的体积的体积 可变体积进样:进样量由微量注射器量取可变体积进样:进样量由微量注射器量取?注意:注意:固定体积进样需要用超过固定体积进样需要用超过Loop体积体积5-10倍的样品量进样,以保证进样浓度不被稀释倍的样品量进样,以保证进样浓度不被稀释 可变体积进样在注射器注入样品后,应尽快将进样器扳至可变体积进样在注射器注入样品后,应尽快将进样器扳至Inject位置,以避免样品在位置,以避免样品在Loop中的扩散中的扩散?进样器的清洗:进样器的清洗:每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交叉污染,影响实验结果每次进样前应将微量注射器清洗干净,防止样品间交叉污染,影响实验结果2004 Waters Corporation自动进样器的使用自动进样器的使用?自动进样器自动进样器(717Plus和和2695样品管理系统样品管理系统):样品瓶位置和进样量由软件设定样品瓶位置和进样量由软件设定?注意:注意:样品瓶中应有超过样品瓶中应有超过13瓶高度的样品量瓶高度的样品量 使用内衬管(使用内衬管(Insert)时应设定针高度为)时应设定针高度为2mm(2695)或或75%高度高度(717Plus)?进样器的清洗:进样器的清洗:进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗进样针是流路的组成部分,运行中一直由流动相清洗 进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗进样针外部由软件控制在每次进样前用洗针液清洗 若注射器内出现气泡，用面板操作的若注射器内出现气泡，用面板操作的Purge Inject功能清除之功能清除之2004 Waters Corporation自动进样器的洗针液自动进样器的洗针液?洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：洗针溶剂根据流动相的不同应有不同：流动相洗针溶剂缓冲溶液，反相50%水 50%甲醇纯缓冲溶液100%水非水溶液，反相100%甲醇正相流动相GPC流动相离子交换对离子试剂的水溶液?注意注意 洗针溶剂瓶(内放绿色塑料管)不要放在仪器的上部，应放于与仪器同一水平面的实验台上洗针溶剂瓶(内放绿色塑料管)不要放在仪器的上部，应放于与仪器同一水平面的实验台上2004 Waters Corporation检测器的启动操作检测器的启动操作?连通流路：连通流路：色谱柱出口接检测器入口色谱柱出口接检测器入口?注意接头不要留有空隙注意接头不要留有空隙?连接管路要用细管连接管路要用细管(0.009)检测器出口用适当的管路检测器出口用适当的管路(内径内径,长度长度)通向废液瓶通向废液瓶?连通数据线路连通数据线路:IEEE 电缆电缆(对大多数检测器对大多数检测器)与软件与软件busLAC/E卡连接卡连接 手动进样器的启动信号线与检测器背板上的手动进样器的启动信号线与检测器背板上的Inject Start 接口连接接口连接?开启电源开关后开启电源开关后,需待检测器通过自检后需待检测器通过自检后,才能被软件控制才能被软件控制(约需约需5-10分钟分钟)?通流动相平衡至少通流动相平衡至少30分钟后才能正常工作分钟后才能正常工作2004 Waters CorporationWaters 2487 检测器检测器2004 Waters Corporation2487的显示屏幕的显示屏幕吸光度吸光度灯开灯开/关关Shift 开Shift 开/关关通道通道单单/双波长双波长波长波长灵敏度灵敏度下一画面下一画面运行时间运行时间(分分)自控自控/遥控遥控诊断开诊断开/关关键盘锁开键盘锁开/关关AUFS(Absorbance Unit Full Scale):满量程吸光度单位满量程吸光度单位2004 Waters Corporation2487的面板及操作的面板及操作单单/双波长，双波长，自动调零自动调零主屏幕主屏幕回车键回车键分屏显示键分屏显示键运行运行/停止键停止键方法调用，方法调用，A/B通道切换通道切换选项移动键选项移动键设置及诊断设置及诊断监视色谱图监视色谱图屏幕对比度屏幕对比度第二功能键第二功能键2004 Waters CorporationWaters 2996 PDA 检测器检测器?PDA(PhotoDiode Array):光电二极管矩阵光电二极管矩阵2004 Waters Corporation由软件设定检测器参数由软件设定检测器参数?只需设定如下参数即可采集数据只需设定如下参数即可采集数据波长范围波长范围分辨率分辨率每秒采集的光谱数每秒采集的光谱数?操作极为简便操作极为简便?不需费神选择参比波长及其带宽不需费神选择参比波长及其带宽2004 Waters CorporationWaters 2414示差折光检测器示差折光检测器2004 Waters Corporation2414的显示屏幕的显示屏幕冲洗参比池折射率极性冲洗参比池折射率极性RIU量程下一画面运行时间量程下一画面运行时间(分分)自控自控/遥控模式遥控模式Shift键盘锁开键盘锁开/关关检测器温度检测器温度2004 Waters Corporation2414的面板及操作的面板及操作回车键回车键屏幕对比度屏幕对比度选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，温度设置方法调用，温度设置冲洗参比池冲洗参比池自动调零自动调零运行运行/停止键停止键下一页下一页设置及诊断设置及诊断监视色谱图监视色谱图第二功能键第二功能键2004 Waters Corporation2414检测器的日常操作检测器的日常操作?设定检测器内、外设定检测器内、外(如有柱温箱如有柱温箱)温度温度?以以5ml/min的流速“的流速“purge”参比池五分钟”参比池五分钟不接色谱柱！不接色谱柱！?参数设置按文献值或实验决定参数设置按文献值或实验决定?至少需要至少需要2小时以上的平衡时间小时以上的平衡时间?通常检测器可以在白天结束工作后不关机，保持通常检测器可以在白天结束工作后不关机，保持0.1到到0.5ml/min的流速循环冲洗样品池和参比池的流速循环冲洗样品池和参比池,可节省第二天的平衡时间可节省第二天的平衡时间2004 Waters Corporation使用示差检测器的注意事项使用示差检测器的注意事项?不能做梯度实验不能做梯度实验?最大的池耐压是最大的池耐压是 100 psi 注意保持出口管路的畅通注意保持出口管路的畅通?流速范围是流速范围是 0.1-10 ml/min?此种类型检测器是压力敏感和温度敏感型检测器此种类型检测器是压力敏感和温度敏感型检测器 注意保持泵压力的平稳注意保持泵压力的平稳 注意环境温度的恒定注意环境温度的恒定2004 Waters CorporationWaters 2475荧光检测器荧光检测器2004 Waters Corporation2475 检测器的特点检测器的特点?可调波长荧光检测器可调波长荧光检测器双扫描双扫描?在扫描模式下在扫描模式下(Scan)发射波长及激发波长均可扫描发射波长及激发波长均可扫描高灵敏度水的高灵敏度水的RAMAN峰峰S/N大于大于200?可编程可编程时间时间-波长波长时间时间-增益增益?由由RS232串行口或网线与计算机相连串行口或网线与计算机相连2004 Waters Corporation2475的主显示屏的主显示屏灯开灯开/关关发射发射/能量能量通道选择通道选择运行时间运行时间(分分)面板面板/软件控制键盘锁软件控制键盘锁/开开Shift开开/关单关单/多波长多波长增益增益波长波长下一页下一页诊断键开诊断键开/关关灵敏度灵敏度2004 Waters Corporation2475的面板及操作的面板及操作回车键回车键分屏显示键分屏显示键选项移动键选项移动键主屏幕主屏幕方法调用，通道切换方法调用，通道切换设置诊断设置诊断自动调零自动调零运行运行/停止键停止键第二功能键第二功能键监视色谱图监视色谱图开关灯开关灯光谱扫描光谱扫描屏幕亮度调节屏幕亮度调节2004 Waters Corporation2475 荧光检测器的扫描功能荧光检测器的扫描功能?扫描功能扫描功能 由面板功能执行由面板功能执行 Empower 英文版亦能由软件执行英文版亦能由软件执行2004 Waters Corporation荧光检测器使用注意事项荧光检测器使用注意事项?不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生不是所有化合物都有荧光，有时需要衍生?检测器对溶解气体及其它“淬灭”物质(如甲醇)敏感,流动相最好能在线脱气检测器对溶解气体及其它“淬灭”物质(如甲醇)敏感,流动相最好能在线脱气?对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂极性和粘度、pH及样品浓度影响对Ex及Em的最佳，易受温度、溶剂极性和粘度、pH及样品浓度影响?检测池的耐压较低,注意出口管路要畅通检测池的耐压较低,注意出口管路要畅通?设置的发射波长至少要比激发波长高设置的发射波长至少要比激发波长高10nm2004 Waters Corporation流动相脱气与否的信号比较流动相脱气与否的信号比较MinutesColumn-Waters PAH Column,27 CEluent A:WaterEluent B:AcetonitrileGradient:60%B to 100%B usingcurve 9 in 12 minutesHold 11 minutesBack to initial conditionsFlow Rate 1.2 ml/minInjection:20ulTime programmedwavelength changesColumn-Waters PAH Column,27 CEluent A:WaterEluent B:AcetonitrileGradient:60%B to 100%B usingcurve 9 in 12 minutesHold 11 minutesBack to initial conditionsFlow Rate 1.2 ml/minInjection:20ulTime programmedwavelength changes20.521.022.01000 MV脱气未脱气Breeze with Fluorescence脱气未脱气Breeze with Fluorescence1231.Benzo(b)flouranthene 400 ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200 ppb3.Benzo(a)pyrene-200 ppb1.Benzo(b)flouranthene 400 ppb2.Benzo(k)fluoranthene-200 ppb3.Benzo(a)pyrene-200 ppb2004 Waters Corporation样品浓度对激发和发射波长的影响样品浓度对激发和发射波长的影响发射 激发 发射 激发 103M103M105M105M在庚烷中在庚烷中2004 Waters Corporation检测器的使用和保养检测器的使用和保养?如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)如长时间不用检测器可以关掉光源灯(UV,FL)仅在4小时以上不用时,才需关灯仅在4小时以上不用时,才需关灯频繁开关灯也会影响灯寿命频繁开关灯也会影响灯寿命?不要让缓冲液长期停滞在检测池内不要让缓冲液长期停滞在检测池内用纯水冲洗用纯水冲洗保存在纯甲醇中保存在纯甲醇中?示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面示差检测器及荧光检测器若与其它检测器串联使用,应将此两种检测器串在其它检测器的后面?不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗不用检测器的液晶显示屏时，应将其亮度调暗