Waters ACQUITY UPLC方法转换指南.pdf

Waters 中国有限公司培训中心中国有限公司培训中心2006ACQUITY UPLCTM方法转换指南方法转换指南2006 Waters Corporation从HPLC到UPLC的方法转换2006 Waters Corporation从从HPLC 转换到转换到 UPLCAbsorbance 254 nmMinutes0102030123Absorbance 254 nmMinutes02.65.2123原来原来30 分钟的分钟的 HPLC图图转换后转换后 5.2 分钟的分钟的 UPLC图图2006 Waters Corporation关于方法转换的特别提示关于方法转换的特别提示?新的新的UPLC 方法也许会和之前的方法也许会和之前的 HPLC 方法不同方法不同 操作条件操作条件,例如例如,流速流速 运行时间运行时间 表现表现?但是但是,新的新的UPLC方法必须达到方法必须达到HPLC方法的目标要求方法的目标要求 相关被分析物的完全分离相关被分析物的完全分离 峰纯度峰纯度 确切地鉴别峰确切地鉴别峰 定量的准确度和精密度定量的准确度和精密度2006 Waters Corporation方法转换需考虑的因素方法转换需考虑的因素?通常的通常的 HPLC方法转换包括三个类别方法转换包括三个类别:更换一个色谱柱的品牌到另一个品牌更换一个色谱柱的品牌到另一个品牌从一台仪器换到另一台仪器从一台仪器换到另一台仪器同时更换仪器和色谱柱同时更换仪器和色谱柱?只有在把只有在把HPLC的方法转化为的方法转化为UPLC仪器方法仪器方法(用用UPLC柱柱)之后之后,才能真正认识到才能真正认识到UPLC的好处的好处需要同时更换仪器和色谱柱需要同时更换仪器和色谱柱2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息得到现有方法和结果的信息?选择新的或是目标柱选择新的或是目标柱色谱柱化学色谱柱化学直径直径?在现有条件的基础上选择目标条件在现有条件的基础上选择目标条件?评估转换的结果评估转换的结果?如需要再进行优化如需要再进行优化2006 Waters Corporation所需的信息：原始的方法所需的信息：原始的方法?色谱柱色谱柱 色谱柱化学(键合配体,品牌,粒径大小)色谱柱化学(键合配体,品牌,粒径大小)柱内径柱内径?色谱条件色谱条件 流动相流动相 流速流速 梯度曲线：包括再生和再平衡梯度曲线：包括再生和再平衡 温度温度?样品样品 稀释稀释 浓缩浓缩 分子量分子量 进样体积进样体积2006 Waters Corporation所需的信息：原始的结果所需的信息：原始的结果?色谱图色谱图 峰数目峰数目 保留保留 分离度分离度?定量定量 检测限检测限 定量限定量限 线性范围线性范围 准确度准确度 精密度精密度2006 Waters Corporation所需的信息：原始的仪器所需的信息：原始的仪器?梯度产生的模式梯度产生的模式 带有梯度比例阀的单泵带有梯度比例阀的单泵(低压梯度低压梯度)双泵双泵(二元高压梯度二元高压梯度)品牌和型号品牌和型号?系统体积系统体积(死体积和滞后体积死体积和滞后体积)用于测量的值和方法用于测量的值和方法?进样装置进样装置?检测模式检测模式2006 Waters Corporation例子：原始的方法例子：原始的方法室温室温:21-22流速流速:1.50 mL/min样品分析物样品分析物:咖啡因咖啡因(100mg/mL)氢化奎尼丁氢化奎尼丁(33mg/mL)3-氨基二苯酮氨基二苯酮(39mg/mL)分子量分子量:小于小于 500 amu样品稀释剂样品稀释剂:DMSO进样体积进样体积:10L检测波长检测波长:254nm流动相流动相:A:0.05%TFA 水溶液水溶液B:0.05%TFA 乙腈溶液乙腈溶液2006 Waters Corporation例子：原始的梯度曲线例子：原始的梯度曲线Gradient StepTime since injectionFlow Rate%A%BCurveInitial01.5955*6112151.55953201.55954301.59552006 Waters Corporation例子：原始的柱子例子：原始的柱子固定相固定相:XTerra MS C18粒径粒径:5 mID:4.6 mm长度长度:150 mm计算:计算:dp150,000 m5 m=30,000L2006 Waters Corporation例子：原始的仪器例子：原始的仪器?Waters Alliance 2695 溶液输送管理器溶液输送管理器 低压混合的单泵梯度低压混合的单泵梯度?Waters Alliance 2695 样品管理器样品管理器?Waters 2487 TUV at 254nm2006 Waters Corporation例子：原始的结果例子：原始的结果吸光度 254 nm分钟1230102030分离度(1,2)=12分离度(2,3)=282006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息得到现有方法和结果的信息?选择新的或是目标柱选择新的或是目标柱 化学品化学品 直径直径?在现有条件的基础上选择目标条件在现有条件的基础上选择目标条件?评估转换的结果评估转换的结果?如需要再进行优化如需要再进行优化2006 Waters Corporation目标柱：目标柱：ACQUITY UPLC 柱柱?键合相键合相 ACQUITY UPLC BEH C18 ACQUITY UPLC BEH Shield RP18 ACQUITY UPLC BEH C8 ACQUITY UPLC BEH Phenyl?查看色谱柱选择性表找到与之前的柱子最相近的查看色谱柱选择性表找到与之前的柱子最相近的2006 Waters Corporation反相柱选择性表反相柱选择性表SunFire C18YMC-Pack PolymerC18Hypersil CPS CyanoYMC-Pack CNWaters Spherisorb S5 PHypersil BDS PhenylNova-Pak PhenylYMC-PackPhenylHypersil PhenylInertsil Ph-3YMC-Pack Pro C4YMCbasicSymmetry C8YMC-Pack Pro C8Nova-PakC8XTerraMS C18Symmetry C18YMC-PackPro C18Inertsil ODS-3YMC-Pack ODS-ANova-PakC18YMC JsphereODSL80Nucleosil C18Waters Spherisorb ODS2Waters Spherisorb ODS1Resolve C18Bondapak C18YMC-Pack ODSAQYMC Jsphere ODSH80YMC Jsphere ODSM80Inertsil CN-3Waters Spherisorb S5CNNova-Pak CN HPSymmetryShield RP8SymmetryShield RP18XTerra RP8XTerra RP18-0.6-0.300.30.60.91.21.51.82.12.42.733.33.6-1.5-0.50.51.52.53.5(ln amitriptyline/acenaphthene)XTerraMS C8Luna C18(2)ACQUITY UPLCBEH C18XTerraPhenylLuna Phenyl HexylChromolithTMRP-18AtlantisdC18Zorbax XDB C18ACT Ace C18Zorbax SB C18SunFire C8LunaC8(2)ACQUITY UPLCBEH C8ACQUITY UPLCBEH Phenyl(ln k acenaphthene)ACQUITY UPLCShield RP182006 Waters Corporation(ln k acenaphthene)XTerraMS C18Hypersil Elite C18Inertsil ODS-3Kromasil C18Inertsil ODS-2Hypersil HyPurity Elite C18Luna C18YMC-Pack Pro C18Zorbax Eclipse XDB C18Zorbax Rx C18Prodigy C18Symmetry C18SymmetryShield RP18Supelcosil LC-ABZ+PlusSupelcosil LC DB-C18Zorbax Extend C18XTerra RP18Luna C18(2)Polaris C18-A-0.200.20.40.60.811.522.533.5(ln amitriptyline/acenaphthene)1.01.2AtlantisdC18YMC-Pack ODSAQEXPANDED VIEWACQUITY UPLC C18ChromolithTMRP-18Nucleosil C181.5现代现代“C18 色谱柱区域色谱柱区域”2006 Waters Corporation目标柱的规格目标柱的规格ACQUITY UPLC BEH 柱柱?内径内径?通常用通常用 2.1mm?只有在特殊情况下用只有在特殊情况下用 1.0mm 严格的样品限量严格的样品限量 流路直接接至流路直接接至MS?柱长柱长 如果主要目标是速度如果主要目标是速度?以以50 mm 柱长为起点柱长为起点(L/dp=29,500)如果主要目标是分离度如果主要目标是分离度?以以100 mm 柱长为起点柱长为起点(L/dp=58,900)2006 Waters Corporation目标柱的规格目标柱的规格4.6 x 150 mm XTerra MS C18(5 m)柱柱2.1 x 50 mm ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 m)柱柱缩放到缩放到2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤?得到现有方法和结果的信息得到现有方法和结果的信息?选择新的或是目标柱选择新的或是目标柱 化学品化学品 直径直径?在现有条件的基础上选择目标条件在现有条件的基础上选择目标条件?评估转换的结果评估转换的结果?如需要再进行优化如需要再进行优化2006 Waters Corporation目标条件目标条件:参数参数?参数参数 流动相流动相 温度温度 几何缩放几何缩放?进样量进样量?流速流速?等度方法只需要调整流速和进样量等度方法只需要调整流速和进样量?梯度曲线梯度曲线?几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化2006 Waters Corporation目标条件目标条件:流动相流动相?用完全相同的流动相用完全相同的流动相 添加剂添加剂 pH 离子强度离子强度 有机溶剂有机溶剂 组成百分比组成百分比?只有在评估几何转换之后如果需要优化再做修改只有在评估几何转换之后如果需要优化再做修改2006 Waters Corporation目标条件目标条件:温度温度?温度直接影响每一个色谱机理温度直接影响每一个色谱机理?在方法转换当中温度一定要保持一致在方法转换当中温度一定要保持一致?溶剂预热是必需的溶剂预热是必需的 溶剂在原来柱中的时间是溶剂在原来柱中的时间是1.66分钟分钟 溶剂在优化的目标柱中的时间是溶剂在优化的目标柱中的时间是15秒秒 热转换的时间很少热转换的时间很少?ACQUITY UPLC 柱稳定装置可用于调节大约柱稳定装置可用于调节大约0.5 到到0.75 mL/min的流速的流速2006 Waters Corporation溶剂预热的影响溶剂预热的影响Absorbance 254 nm01.53.0黑色=带柱稳定装置黑色=带柱稳定装置蓝色=不带柱稳定装置蓝色=不带柱稳定装置注意注意:对于不同峰的影响不同对于不同峰的影响不同Minutes2006 Waters Corporation目标条件目标条件:参数参数?参数参数 流动相流动相 温度温度 几何缩放几何缩放?进样量进样量?流速流速?等度方法只需要调整流速和进样量等度方法只需要调整流速和进样量?梯度曲线梯度曲线?几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化2006 Waters Corporation目标条件：进样量目标条件：进样量?用完全相同的样品用完全相同的样品同样的浓度同样的浓度同样的稀释倍数同样的稀释倍数?计算对应于柱体积的进样体积计算对应于柱体积的进样体积2006 Waters Corporation未计算进样体积未计算进样体积4.6 x 150mm2.1 x 50mm20 L 进样量进样量/2.49mL=0.8%20 L 进样量进样量/0.17mL=12%注注:2.49mL 为为 4.6 x 150mm 柱的柱体积柱的柱体积0.17mL 为为 2.1 x 50mm 柱的柱体积柱的柱体积2006 Waters Corporation计算进样体积计算进样体积目标进样体积目标进样体积=原来的进样体积原来的进样体积 X目标柱体积目标柱体积原来的柱体积原来的柱体积计算计算10L 进样量在进样量在 4.6 x 150mm柱上到柱上到 2.1 x 50mm柱柱10 L x 3.14 x 1.12 x 503.14 x 2.32 x 150=0.0680.172.49=10 Lx 10 L x=0.7 L2006 Waters Corporation目标条件：进样量目标条件：进样量?用同样的样品用同样的样品 同样的浓度同样的浓度 同样的稀释倍数同样的稀释倍数?计算对应于柱体积的进样体积计算对应于柱体积的进样体积?建议在建议在ACQUITY UPLC 上的最小进样体积为上的最小进样体积为0.5-1 L 如果计算出的进样体积太小如果计算出的进样体积太小?用起始强度的流动相稀释用起始强度的流动相稀释5-10倍倍 在在2.1 x 50mm 上上5L为最大进样体积为最大进样体积2006 Waters Corporation目标条件目标条件:参数参数?参数参数 流动相流动相 温度温度 几何缩放几何缩放?进样量进样量?流速流速?等度方法只需要调整流速和进样量等度方法只需要调整流速和进样量?梯度曲线梯度曲线?几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化2006 Waters Corporation目标条件：流速目标条件：流速?调节流速调节流速,由于线速度一定由于线速度一定,因此流速与柱内径的平方成比例因此流速与柱内径的平方成比例?对于小颗粒的填料可调节线速度对于小颗粒的填料可调节线速度2006 Waters Corporation几何缩放流速：计算几何缩放流速：计算d2目标柱目标柱d2 原始柱目标柱流速原始柱目标柱流速=原柱流速原柱流速 x x r2(目标柱目标柱)x r2(原始柱原始柱)简化为简化为:目标柱流速目标柱流速=原柱流速原柱流速 x1.5 mL/min X 2.124.62=0.31 mL/min将在将在4.6x150mm柱上的柱上的1.5 mL/min流速缩放到流速缩放到 2.1x50mm柱上柱上2006 Waters Corporation几何缩放流速：保持线速度不变几何缩放流速：保持线速度不变2006 Waters Corporation在在UPLC上增加线速度上增加线速度2006 Waters Corporation目标条件目标条件:参数参数?参数参数 流动相流动相 温度温度 几何缩放几何缩放?进样量进样量?流速流速?等度方法只需要调整流速和进样量等度方法只需要调整流速和进样量?梯度曲线梯度曲线?几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化2006 Waters Corporation目标条件：梯度曲线目标条件：梯度曲线?以柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间以柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间?将每一分段计算为一定数量的柱体积将每一分段计算为一定数量的柱体积?计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间?计算在计算在UPLC的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间2006 Waters Corporation原始的梯度曲线原始的梯度曲线梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线初始初始01.5955*6112151.55953201.55954301.59552006 Waters Corporation用于缩放的原始梯度曲线用于缩放的原始梯度曲线梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线梯度段时间梯度段时间(min)梯度段梯度段(cv)初始初始01.5955*61102151.55950155103201.55954301.59552006 Waters Corporation梯度分段：用柱体积来描述梯度分段：用柱体积来描述对于对于 15分钟分钟1.5mL/min 在在 4.6 x 150mm 柱上柱上梯度体积梯度体积=流速流速 x 时间时间=1.5mL/min x 15min=22.5mL柱体积柱体积=x r2x L =3.14 x 2.32 x 150 =2.49mL梯度体积梯度体积柱体积柱体积梯度段梯度段(cv)=梯度段梯度段=22.5mL2.49mL=9.03 cv2006 Waters Corporation原始的用于缩放的梯度曲线原始的用于缩放的梯度曲线梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线梯度段时间梯度段时间(min)梯度段梯度段(cv)Initial01.5955*61102151.559501559.03103201.55953.014301.59556.022006 Waters Corporation几何缩放几何缩放在在0.31 mL/min流速下缩放到流速下缩放到 2.1 x 50 mm 柱柱梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线梯度段时间梯度段时间(min)梯度段梯度段(cv)Initial00.31955*611020.3159509.0330.315953.0140.319556.022006 Waters Corporation缩放梯度分段时间保持同样的梯度段缩放梯度分段时间保持同样的梯度段(cv)原始步骤原始步骤2:15 min 以以1.5 mL/min 梯度段梯度段9.03cv计算目标步骤计算目标步骤 2:?min 以以 0.31 mL/min保持梯度段保持梯度段(9.03cv)目标柱体积目标柱体积(2.1 x 50)=0.17mL梯度分段体积梯度分段体积=梯度段梯度段(cv)x 目标柱体积目标柱体积=9.03cv x 0.17mL=1.54mL梯度分段时间梯度分段时间=梯度分段体积梯度分段体积/流速流速=1.54mL/0.31 mL/min=5 min2006 Waters Corporation缩放用于缩放用于2.1x50mm的梯度表的梯度表?在恒定线速度下调节在恒定线速度下调节 2.1 x 50mm的流速的流速梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线梯度段时间梯度段时间(min)梯度段梯度段(cv)Initial00.31955*6110250.3159505.01.679.033.3336.670.315953.01410.000.319556.022006 Waters Corporation目标条件：梯度表目标条件：梯度表?用几个柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间用几个柱体积为单位来描述百分比变化的梯度区间?将每一分段计算为一定数量的柱体积将每一分段计算为一定数量的柱体积?计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间计算在几何缩放的流速下输送相同倍数柱体积溶剂到目标柱需要的时间?计算在计算在UPLC的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间的流速下输送相同倍数柱体积的溶剂到目标柱需要的时间2006 Waters Corporation对于对于 UPLC增加线速度增加线速度2006 Waters CorporationUPLC 缩放缩放?在在 0.6 mL/min流速下缩放到流速下缩放到 2.1 x 50 mm 柱柱梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线梯度段时间梯度段时间(min)梯度段梯度段(cv)Initial00.6955*611020.659509.0330.65953.0140.69556.022006 Waters Corporation评估最佳流速：评估最佳流速：UPLC?考虑考虑 1.7m 目标柱的颗粒度目标柱的颗粒度(2.1mm内径内径)?假想温度和粘度是直接转移的假想温度和粘度是直接转移的?调整流速在调整流速在van Deemter 曲线和相近的分子量的基础上曲线和相近的分子量的基础上 0.6 mL/min 对于小分子对于小分子?平均平均 500 dalton(分子量分子量)分子分子 0.1 mL/min 对于大分子对于大分子,因为扩散较慢因为扩散较慢?例如例如,2,000 dalton 肽肽2006 Waters Corporation缩放缩放 UPLC 流速流速梯度时间以维持梯度段不变梯度时间以维持梯度段不变(cv)原始步骤原始步骤2:15 min 以以 1.5 mL/min梯度段梯度段 9.03cv计算目标步骤计算目标步骤 2:?min以以0.60 mL/min 保持梯度段保持梯度段(9.03cv)目标柱体积目标柱体积(2.1 x 50)=0.17mL梯度区间体积梯度区间体积=梯度段梯度段(cv)x 目标柱体积目标柱体积=9.03cv x 0.17mL=1.54mL梯度区间时间梯度区间时间=梯度区间体积梯度区间体积/UPLC 流速流速=1.54mL/0.60 mL/min=2.61min2006 Waters CorporationUPLC 缩放缩放在0.6 mL/min流速下缩放到 2.1 x 50 mm 柱梯度段梯度段时间时间流速流速%A%B曲线曲线梯度段时间梯度段时间(min)梯度段梯度段(cv)Initial00.6955*611022.610.659502.610.879.031.7433.480.65953.0145.220.69556.022006 Waters Corporation目标条件目标条件:几何缩放和几何缩放和UPLC 线速度调整线速度调整?参数参数 流动相流动相 温度温度 几何缩放几何缩放?进样量进样量?流速流速?等度方法只需调整流速和进样量等度方法只需调整流速和进样量?梯度曲线梯度曲线?几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化几何缩放的目的是为了减少评估和优化转换方法所带来的变化?调整到调整到 UPLC 的线速度的线速度2006 Waters CorporationHPLC 转换到转换到 UPLCAbsorbance 254 nmMinutes0102030123Absorbance 254 nmMinutes0102030123转换的 5.2 分钟 UPLC原始的 30 分钟 HPLC相同时间标尺2006 Waters CorporationHPLC 转化到转化到 UPLCAbsorbance 254 nmMinutes0102030123Absorbance 254 nmMinutes02.65.2123原始的 30 分钟 HPLC转换的 5.2分钟 UPLC放大时间标尺2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤?搜集关于现存的方法和结果的信息搜集关于现存的方法和结果的信息?选择新的或目标柱选择新的或目标柱 化学品化学品 尺寸规格尺寸规格?仪器的比较仪器的比较?在几何缩放的考虑下选择目标条件在几何缩放的考虑下选择目标条件?评估转换的结果评估转换的结果?需要时进行优化需要时进行优化2006 Waters Corporation评估结果评估结果?峰匹配峰匹配 数峰个数数峰个数 考察峰间距考察峰间距 严格考察基线中出现的和缺少的小峰严格考察基线中出现的和缺少的小峰 匹配洗脱顺序和分离度匹配洗脱顺序和分离度?进一步进行通常的定量评估进一步进行通常的定量评估 分离度分离度 检出限检出限(LOD)定量限定量限(LOQ)2006 Waters Corporation原始的原始的 HPLC 方法方法Absorbance 254 nmMinutes4.6 x 150 mm,5m分离度 1/2=12分离度 2/3=2812301020302006 Waters CorporationUPLC 分离度分离度在在HPLC的时间标尺上的时间标尺上Absorbance 254 nmMinutes0102030123UPLC 优化后 2.1 x 50 mm分离度1/2=11分离度2/3=262006 Waters Corporation成比例的放大图成比例的放大图Absorbance 254 nmMinutes02.65.2123UPLC 优化 2.1 x 50 mm分离度 1/2=11分离度 2/3=262006 Waters Corporation原始的原始的 30 分钟的分钟的HPLC方法方法Absorbance 254 nmMinutes1230102030基线和未知峰的存在关注微量组分基线和未知峰的存在关注微量组分2006 Waters Corporation5.2 分钟分钟 UPLC放大图放大图Absorbance 254 nm02.65.2123同样的分离能力和灵敏度关注微量组分同样的分离能力和灵敏度关注微量组分Minutes2006 Waters Corporation成功进行方法转换的步骤成功进行方法转换的步骤?搜集关于现存的方法和结果的信息搜集关于现存的方法和结果的信息?选择新的或目标柱选择新的或目标柱 化学品化学品 尺寸规格尺寸规格?仪器的比较仪器的比较?在几何缩放的考虑下选择目标条件在几何缩放的考虑下选择目标条件?评估转换的结果评估转换的结果?需要时进行优化需要时进行优化2006 Waters Corporation优化转化的方法优化转化的方法?ACQUITY UPLC 和反相和反相HPLC运用的是同样的理论运用的是同样的理论?之前所用的一切理论仍然适用之前所用的一切理论仍然适用 所有的化学操作仍然适用所有的化学操作仍然适用 所有的策略仍然与之前相同所有的策略仍然与之前相同 仿真软件在一些例子中已经验证过是很有用的仿真软件在一些例子中已经验证过是很有用的,就像是就像是在通常的在通常的HPLC上一样上一样?优化总是要进行的优化总是要进行的,但过程会大大加快但过程会大大加快2006 Waters Corporation总结总结?方法可以从方法可以从HPLC 直接转换至直接转换至ACQUITY UPLC 分离度增加分离度增加 速度增加速度增加 检测限增加检测限增加?许多参数可以也必须做一定的处理以保证原来的许多参数可以也必须做一定的处理以保证原来的结果结果?注意通往成功的细节注意通往成功的细节