食品中大肠菌群的检验.pptx

食品中大肠菌群检验食品中大肠菌群的检验第1页1.食品微生物检验意义l有害微生物对人类和生产影响：引发食品变质引发食物中毒造成人体患病食品中大肠菌群的检验第2页1.食品微生物检验意义l是衡量食品卫生质量主要指标,也是判定被检食品能否食用科学依据l能够判断食品加工环境及食品卫生情况,为卫生管理工作提供科学依据l能够有效地预防或降低食物中毒和人畜共患病发生l确保产品质量,防止不 必要损失食品中大肠菌群的检验第3页生产环境检验生产环境检验生产环境检验生产环境检验原辅料检验原辅料检验原辅料检验原辅料检验食品加工、储备、销售食品加工、储备、销售食品加工、储备、销售食品加工、储备、销售储步骤检验储步骤检验储步骤检验储步骤检验食品检验食品检验食品检验食品检验2.食品微生物检验范围食品中大肠菌群的检验第4页3.食品卫生标准中微生物指标l指示菌概念:在常规安全卫生监测中，用以指示检样卫生情况及安全性指示性微生物类型：普通性、特定性（如粪便污染）、其它项目：菌落总数、大肠菌群、耐热大肠菌群、总大肠菌群l食源性致病菌及其毒素沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌及其肠毒素、溶血性链球菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌、空肠弯曲菌、致病性大肠埃希氏菌等l霉菌酵母菌及其毒素黄曲霉毒素B1、B2等l其它项目抗生素残留、beta-内酰胺酶、商业无菌等食品中大肠菌群的检验第5页商业无菌l概念：罐头食品经过适度杀菌后，不含有致病性微生物，也不含有在通常温度下能在其中繁殖非致病性微生物。这种状态叫做商业无菌。l保温：低酸性罐头食品36，10天酸性罐头食品30 1，10天预定输往热带地域低酸性食品55 1，57天l每日检验 是否胖听、泄露开罐留样pH测定感官检验涂片染色接种食品中大肠菌群的检验第6页4.惯用仪器设备4.0 光学显微镜4.1 培养箱4.2 水浴箱食品中大肠菌群的检验第7页4.惯用仪器设备4.3 超净工作台：侧流式、直流式和外流式4.4 干燥箱4.5 高压蒸汽灭菌器食品中大肠菌群的检验第8页4.惯用仪器设备4.6 离心机4.7 滤菌器4.8 均质器（匀浆器）4.9 冰箱食品中大肠菌群的检验第9页4.惯用仪器设备l玻璃器材及其它试管三角烧瓶烧杯玻璃棒培养皿接种环涂布棒酒精灯移液管移液器剪刀、镊子试管架食品中大肠菌群的检验第10页一、试验目标一、试验目标l1.1.了解大肠菌群在食品检验中意义。了解大肠菌群在食品检验中意义。l2.2.掌握检验程序和步骤。掌握检验程序和步骤。l3.3.经过经过MPNMPN检索表检索得出试验结果。检索表检索得出试验结果。食品中大肠菌群的检验第11页二、基本原理二、基本原理l大肠菌群系指一群在大肠菌群系指一群在32323737下下24h24h内，能内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧革兰发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要起源于人畜氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要起源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量情况，推断食品中肠道致病菌污品卫生质量情况，推断食品中肠道致病菌污染可能。含有广泛卫生学意义。染可能。含有广泛卫生学意义。食品中大肠菌群的检验第12页大肠菌群食品卫生学意义大肠菌群食品卫生学意义l作为粪便污染食品指标菌，MPN值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低l作为肠道致病菌污染食品指针，大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在可能性就越高，但二者之间并不总是呈平行关系l要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能，主要是其污染程度即菌量食品中大肠菌群的检验第13页产产气气克雷白氏菌克雷白氏菌ETEC EIEC 阴沟阴沟肠肠杆菌杆菌EHEC 大肠菌群大肠菌群耐热大肠菌群（粪大肠耐热大肠菌群（粪大肠菌群）菌群）大肠杆菌产气气克雷白氏菌克雷白氏菌大大肠埃希氏菌埃希氏菌柠檬檬酸杆菌酸杆菌O157：H7大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道是人和温血动物肠道内普遍存在细菌，是粪便中主内普遍存在细菌，是粪便中主内普遍存在细菌，是粪便中主内普遍存在细菌，是粪便中主要菌种。普通生活在人大肠中要菌种。普通生活在人大肠中要菌种。普通生活在人大肠中要菌种。普通生活在人大肠中并不致病，但它侵入人体一些并不致病，但它侵入人体一些并不致病，但它侵入人体一些并不致病，但它侵入人体一些部位时，可引发感染部位时，可引发感染部位时，可引发感染部位时，可引发感染 。大肠菌群大肠菌群大肠菌群大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域用语，它并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域用语，它并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域用语，它并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指是含有一些特征一组与粪不代表某一个或某一属细菌，而指是含有一些特征一组与粪不代表某一个或某一属细菌，而指是含有一些特征一组与粪不代表某一个或某一属细菌，而指是含有一些特征一组与粪便污染相关细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一便污染相关细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一便污染相关细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一便污染相关细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致。普通认为可包含大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷致。普通认为可包含大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷致。普通认为可包含大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷致。普通认为可包含大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌等。伯氏菌和阴沟肠杆菌等。伯氏菌和阴沟肠杆菌等。伯氏菌和阴沟肠杆菌等。总大肠菌群总大肠菌群总大肠菌群总大肠菌群系指一系指一系指一系指一群在群在群在群在3737培养二十培养二十培养二十培养二十四小时能发酵乳糖、四小时能发酵乳糖、四小时能发酵乳糖、四小时能发酵乳糖、产酸产气、需氧和产酸产气、需氧和产酸产气、需氧和产酸产气、需氧和兼性厌氧革兰氏阴兼性厌氧革兰氏阴兼性厌氧革兰氏阴兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。性无芽胞杆菌。耐热大肠菌群耐热大肠菌群耐热大肠菌群耐热大肠菌群即粪大肠菌即粪大肠菌即粪大肠菌即粪大肠菌群，作为一个卫生指标菌，群，作为一个卫生指标菌，群，作为一个卫生指标菌，群，作为一个卫生指标菌，耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含耐热大肠菌群中很可能含有粪源微生物，所以耐热有粪源微生物，所以耐热有粪源微生物，所以耐热有粪源微生物，所以耐热大肠菌群存在表明可能受大肠菌群存在表明可能受大肠菌群存在表明可能受大肠菌群存在表明可能受到了粪便污染，可能存在到了粪便污染，可能存在到了粪便污染，可能存在到了粪便污染，可能存在大肠杆菌。不过，耐热大大肠杆菌。不过，耐热大大肠杆菌。不过，耐热大大肠杆菌。不过，耐热大肠菌群存在并不代表对人肠菌群存在并不代表对人肠菌群存在并不代表对人肠菌群存在并不代表对人有什么直接危害。有什么直接危害。有什么直接危害。有什么直接危害。致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌致病性大肠杆菌能引发食物能引发食物能引发食物能引发食物中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠中毒。致病性菌株能侵入肠粘膜上皮细胞，含有痢疾杆粘膜上皮细胞，含有痢疾杆粘膜上皮细胞，含有痢疾杆粘膜上皮细胞，含有痢疾杆菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠菌样致病力。肠致病性大肠杆菌（杆菌（杆菌（杆菌（EPECEPEC）、肠毒素性）、肠毒素性）、肠毒素性）、肠毒素性大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（大肠杆菌（ETECETEC）和肠侵）和肠侵）和肠侵）和肠侵袭性大肠杆菌（袭性大肠杆菌（袭性大肠杆菌（袭性大肠杆菌（EIECEIEC）等。）等。）等。）等。O157:H7O157:H7（EHEC)EHEC)肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻肠出血性大肠杆菌，感染性腹泻是近年来新发觉危害严重肠道传是近年来新发觉危害严重肠道传是近年来新发觉危害严重肠道传是近年来新发觉危害严重肠道传染病，已逐步成为威胁人群健康染病，已逐步成为威胁人群健康染病，已逐步成为威胁人群健康染病，已逐步成为威胁人群健康主要公共卫生问题。主要公共卫生问题。主要公共卫生问题。主要公共卫生问题。大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌隶属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌隶属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌隶属关系大肠菌群、粪大肠菌群、大肠杆菌隶属关系食品中大肠菌群的检验第14页GB 4789.3-GB 4789.3-大肠菌群计数大肠菌群计数第一法：大肠菌群第一法：大肠菌群MPNMPN计数法计数法第二法：大肠菌群平板计数法第二法：大肠菌群平板计数法三、检测方法三、检测方法食品中大肠菌群的检验第15页第一法：大肠菌群第一法：大肠菌群MPN计数法计数法食品中大肠菌群的检验第16页大肠菌群计数检验流程0将产气试管内样将产气试管内样品接种到品接种到BGLB肉汤肉汤LST不产气（不产气（-）小导管里无气泡小导管里无气泡LST产气（产气（+）食品中大肠菌群的检验第17页 需要用到培养基需要用到培养基（1 1）LSTLST肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤培养基：月桂基硫酸盐胰蛋白胨成份：成份：胰蛋白胨或胰酪胨（胰蛋白胨或胰酪胨（TryticaseTryticase）20g20g，NaCL NaCL 5.0g5.0g，乳糖，乳糖5.0g5.0g，K K2 2HPOHPO4 4 2.75g 2.75g，KHKH2 2POPO4 4 2.75g 2.75g，月桂基硫酸钠月桂基硫酸钠0.1g0.1g，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL。制法：制法：将各成份溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵将各成份溶解于蒸馏水中。分装到有倒立发酵管管20mm150mm20mm150mm试管中，每管试管中，每管10mL10mL。121121高压灭菌高压灭菌15min15min。最终。最终pH6.80.2pH6.80.2。食品中大肠菌群的检验第18页（2 2）BGLBBGLB：煌绿乳糖胆盐肉汤：煌绿乳糖胆盐肉汤成份：成份：蛋白胨蛋白胨10.0g10.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，牛胆粉溶，牛胆粉溶液液200mL200mL，0.1%0.1%煌绿水溶液煌绿水溶液13.3mL13.3mL，蒸馏，蒸馏水水800mL800mL，pH7.20.1pH7.20.1。制法：略制法：略食品中大肠菌群的检验第19页抑菌剂选择抑菌剂选择l大大肠肠菌菌群群检检验验中中惯惯用用抑抑菌菌剂剂有有胆胆盐盐、十十二二烷烷基基硫硫酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。酸钠、洗衣粉、煌绿、龙胆紫、孔雀绿等。l抑抑菌菌剂剂主主要要作作用用是是抑抑制制其其它它杂杂菌菌，尤尤其其是是革革兰兰氏氏阳阳性性菌菌生生长长。国国家家标标准准中中LSTLST肉肉汤汤利利用用十十二二烷烷基基硫硫酸酸钠钠作作为为抑抑菌菌剂剂，BGLBBGLB肉肉汤汤利利用用煌煌绿绿和和胆胆盐盐作作为为抑菌剂。抑菌剂。l抑菌剂虽可抑制样品中一些杂菌，而有利于大肠抑菌剂虽可抑制样品中一些杂菌，而有利于大肠菌群细菌生长和挑选，但对大肠菌群中一些菌株菌群细菌生长和挑选，但对大肠菌群中一些菌株有时也产生一些抑制作用。有时也产生一些抑制作用。食品中大肠菌群的检验第20页试验步骤及操作关键点：1）无菌取样并制作梯度稀释液；）无菌取样并制作梯度稀释液；2）样品匀液）样品匀液pH 值应在值应在6.57.5 之间，必要时分别之间，必要时分别用用1 mol/L NaOH 或或1 mol/L HCl 调整。调整。3）从制备样品匀液至样品接种完成，全过程不得超）从制备样品匀液至样品接种完成，全过程不得超出出15 min。食品中大肠菌群的检验第21页l4）初发酵试验）初发酵试验 每个样品，选择每个样品，选择3个适宜连续稀释度样品匀液个适宜连续稀释度样品匀液（液体样品能够选择原液），每个稀释度接种（液体样品能够选择原液），每个稀释度接种3管管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种）肉汤，每管接种1mL（如接种量超出（如接种量超出1 mL，则用双料，则用双料LST肉汤），肉汤），361 培养培养24 h2 h，观察倒管内是否有气泡，观察倒管内是否有气泡产生，产生，24 h2 h产气者进行复发酵试验，如未产产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至气则继续培养至48 h2 h，产气者进行复发酵试，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。验。未产气者为大肠菌群阴性。食品中大肠菌群的检验第22页LST结果判断结果判断l大肠菌群产气量，多者能够使发酵倒管全部充满大肠菌群产气量，多者能够使发酵倒管全部充满气体，少者能够产生比小米粒还小气泡。假如对气体，少者能够产生比小米粒还小气泡。假如对产酸但未产气乳糖发酵如有疑问时，能够用手轻产酸但未产气乳糖发酵如有疑问时，能够用手轻轻打动试管。轻打动试管。食品中大肠菌群的检验第23页5）复发酵试验）复发酵试验 用接种环从产气用接种环从产气LST肉汤管中分别取培肉汤管中分别取培养物养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，）管中，36 1培养培养48 h2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。阳性管。食品中大肠菌群的检验第24页6）大肠菌群最可能数（）大肠菌群最可能数（MPN）汇报）汇报 按按5）确证大肠菌群）确证大肠菌群LST阳性管数，检索阳性管数，检索MPN表（见附录表（见附录B），汇报每），汇报每g（mL）样）样品中大肠菌群品中大肠菌群MPN值。值。食品中大肠菌群的检验第25页表表B.1 大肠菌群最可能数（大肠菌群最可能数（MPN）检索表）检索表食品中大肠菌群的检验第26页第二法：大肠菌群平板计数法第二法：大肠菌群平板计数法食品中大肠菌群的检验第27页食品中大肠菌群的检验第28页 需要用到培养基需要用到培养基（1 1）VRBAVRBA：结晶紫中性红胆盐琼脂：结晶紫中性红胆盐琼脂成份：蛋白胨成份：蛋白胨7.0g7.0g，酵母膏，酵母膏3.0g3.0g，乳糖，乳糖10.0g10.0g，氯，氯化钠化钠5.0g5.0g，胆盐或，胆盐或3 3号胆盐号胆盐1.5g1.5g，中性红，中性红0.03g0.03g，结晶紫结晶紫0.002g0.002g，琼脂，琼脂15g15g18g18g，蒸馏水，蒸馏水1000mL1000mL，pH7.4pH7.40.1食品中大肠菌群的检验第29页1）样品稀释）样品稀释：如第一法：如第一法2）平板计数平板计数 选取选取2个个3个适宜连续稀释度个适宜连续稀释度,每个稀释度接种每个稀释度接种2个无个无菌平皿，每皿菌平皿，每皿1 mL。同时取。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿生理盐水加入无菌平皿作空白对照。作空白对照。3）及时将）及时将15 mL20 mL冷至冷至46 结晶紫中性红胆盐琼脂结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于覆盖平板表层。翻转平板，置于36 1 培养培养18 h24 h。试验步骤及操作关键点：食品中大肠菌群的检验第30页4）平板菌落数选择）平板菌落数选择 选取菌落数在选取菌落数在15 CFU150 CFU 之间平之间平板，分别计数平板上出现经典和可疑大肠菌板，分别计数平板上出现经典和可疑大肠菌群菌落。群菌落。经典菌落为紫红色，经典菌落为紫红色，菌落周围有红色胆盐菌落周围有红色胆盐沉淀环，菌落直径为沉淀环，菌落直径为0.5 mm 0.5 mm 或更大。或更大。食品中大肠菌群的检验第31页5）证实试验）证实试验 从从VRBA 平板上挑取平板上挑取10 个不一样类型经个不一样类型经典和可疑菌落，分别移种于典和可疑菌落，分别移种于BGLB 肉汤管肉汤管内，内，36 1 培养培养24 h48 h，观察产气，观察产气情况。凡情况。凡BGLB 肉汤管产气，即可汇报为肉汤管产气，即可汇报为大肠菌群阳性。大肠菌群阳性。食品中大肠菌群的检验第32页6）大肠菌群平板计数汇报）大肠菌群平板计数汇报 经最终证实为大肠菌群阳性试管百分比乘以经最终证实为大肠菌群阳性试管百分比乘以4）中计数平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每）中计数平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。）样品中大肠菌群数。例：例：10-4样品稀释液样品稀释液1 mL，在，在VRBA平板上有平板上有100个个经典和可疑菌落，挑取其中经典和可疑菌落，挑取其中10个接种个接种BGLB肉汤肉汤管，证实有管，证实有6个阳性管，则该样品大肠菌群数为：个阳性管，则该样品大肠菌群数为：1006/10104/g（mL）=6.0105CFU/g（mL）。）。食品中大肠菌群的检验第33页 三三 大肠菌群大肠菌群PetrifilmTM测试纸片法测试纸片法食品中大肠菌群的检验第34页四、美国四、美国FDAFDA标准方法标准方法行业标准采取两步法：行业标准采取两步法：用于对出口食品中大肠菌群进行检验用于对出口食品中大肠菌群进行检验 推测试验推测试验证实试验证实试验样品稀释后，样品稀释后，选择三个稀释选择三个稀释度，每个稀释度，每个稀释度接种三管度接种三管LST肉汤发酵肉汤发酵管。管。361培培养养482h，观察，观察是否产气。是否产气。将产气发酵管将产气发酵管培养物转种于培养物转种于煌绿乳糖胆盐煌绿乳糖胆盐（BGLBBGLB）肉汤）肉汤中，中，361培培养养482h ，观观察是否产气察是否产气。以以BGLBBGLB产产气为阳性，气为阳性，查查MPN表，表，汇报每汇报每ml（g）样品中大样品中大肠菌群肠菌群MPN值。值。食品中大肠菌群的检验第35页思索题思索题1大大肠肠菌菌群群检检验验分分哪哪几几个个步步骤骤？各各有有何何作作用用？2在在糖糖发发酵酵试试验验中中，若若发发觉觉发发酵酵倒倒管管内内存存在在极极微微小小气气泡泡，这这种种情情况况可可否否算算作作产产气气阳阳性性？3造成本试验误差主要原因有哪些？造成本试验误差主要原因有哪些？食品中大肠菌群的检验第36页