12酶在生物技术领域的应用解析.pptx

酶的应用 生物技术领域生物技术又称生物工程，主要包括基因工程、细胞工程、酶工程和发酵工程等四个方面的内容，这些内容都是以生物体及其代谢产物为主要研究对象。酶是生物催化剂，在生物体及其代谢过程中是必不可少的。现在介绍酶在细胞工程和基因工程中起着关键性作用的几个方面的应用情况。酶在生物技术领域的应用主要有三种：I.用酶除去细胞壁II.用酶进行大分子切割III.用酶进行分子拼接一、酶在除去细胞壁方面的应用 微生物细胞和植物细胞的表层都有细胞壁。细胞壁对微生物和植物维持其细胞的形状和结构起着重要作用，可保护细胞遭外界因素的破坏。但在生物工程方面，很多时候都需要除去细胞壁。例如：胞内物质的提取 微生物和植物细胞的许多物质，如胞内酶、胰岛素及干扰素等微生物和植物细胞的许多物质，如胞内酶、胰岛素及干扰素等基因工程菌的产物，天然抗氧化剂等植物细胞次级代谢产物基因工程菌的产物，天然抗氧化剂等植物细胞次级代谢产物都存在于细胞内。为了将这些细胞内物质提取出来都存在于细胞内。为了将这些细胞内物质提取出来,很多时候很多时候都需要将细胞壁破坏或除去。都需要将细胞壁破坏或除去。原生质体的制备 在制备原生质体或提取胞内某些稳定性较差的活性物质时在制备原生质体或提取胞内某些稳定性较差的活性物质时,既要既要除去细胞壁除去细胞壁,又要不损伤其他成分。这样就不能采用激烈的破又要不损伤其他成分。这样就不能采用激烈的破碎方法碎方法,而只能利用各种具有专一性的酶。而只能利用各种具有专一性的酶。根据不同细胞的结构和细胞壁组分的不同根据不同细胞的结构和细胞壁组分的不同,除去细胞壁时所采用的酶也有所区别。除去细胞壁时所采用的酶也有所区别。除去细菌细胞壁除去细菌细胞壁 细菌的细胞壁主要成分是肽多糖。细菌的细胞壁主要成分是肽多糖。革兰氏阴性细菌的细胞壁除了肽多糖以革兰氏阴性细菌的细胞壁除了肽多糖以外，还有一层脂多糖。外，还有一层脂多糖。除去革兰氏阳性细菌的细胞壁是采除去革兰氏阳性细菌的细胞壁是采用从蛋清中分离得到的用从蛋清中分离得到的溶菌酶溶菌酶。该酶专。该酶专一地作用于细菌细胞壁的肽多糖分子中一地作用于细菌细胞壁的肽多糖分子中N-乙酰胞壁酸与乙酰胞壁酸与N-乙酰氨基葡萄糖之间乙酰氨基葡萄糖之间的的-1，4-键。而对于革兰氏阴性菌需键。而对于革兰氏阴性菌需由由溶菌酶溶菌酶和和EDTA共同作用才能达到较共同作用才能达到较好地除去细胞壁的效果。这是由于好地除去细胞壁的效果。这是由于EDTA可作用于脂多糖的缘故。可作用于脂多糖的缘故。除去酵母细胞壁除去酵母细胞壁 酵母的细胞壁分为两层，外层由磷酸酵母的细胞壁分为两层，外层由磷酸甘露糖和蛋白质组成，内层由甘露糖和蛋白质组成，内层由-葡聚糖构葡聚糖构成细胞壁的骨架。成细胞壁的骨架。除去酵母细胞壁主要采用除去酵母细胞壁主要采用-1，3-葡聚葡聚糖酶糖酶。该酶作用于细胞壁内层的。该酶作用于细胞壁内层的-葡聚糖葡聚糖分子中分子中-1，3-糖苷键，使作为细胞壁骨架糖苷键，使作为细胞壁骨架的的-葡聚糖水解，而使细胞壁破坏。由于葡聚糖水解，而使细胞壁破坏。由于蜗牛的消化液中含有较多的蜗牛的消化液中含有较多的-1，3-葡聚糖葡聚糖酶，故常用于酵母的破壁。此外，若酶，故常用于酵母的破壁。此外，若-葡葡聚糖酶与磷酸甘露糖酶及蛋白酶联合作用，聚糖酶与磷酸甘露糖酶及蛋白酶联合作用，则可使细胞壁的内外两层同时被破坏，而则可使细胞壁的内外两层同时被破坏，而显著提高破壁效果。显著提高破壁效果。除去霉菌细胞壁除去霉菌细胞壁 毛霉、根霉等藻菌纲霉菌的细胞壁毛霉、根霉等藻菌纲霉菌的细胞壁主要由几丁质主要由几丁质(N-乙酰乙酰-D-氨基葡萄糖以氨基葡萄糖以-1，4-键结合而成键结合而成)和壳多糖和壳多糖(氨基葡氨基葡萄糖以萄糖以-1，4键结合而成键结合而成)等多种物质等多种物质组成。破壁时主要采用放线菌或细菌组成。破壁时主要采用放线菌或细菌产生的产生的壳多糖酶壳多糖酶、几丁质酶几丁质酶及及蛋白酶蛋白酶等多种酶的混合物。这些混合多酶制等多种酶的混合物。这些混合多酶制剂一般称之为细胞壁溶解酶剂一般称之为细胞壁溶解酶。米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌纲米曲霉、黑曲霉和青霉等半知菌纲霉菌的细胞壁的主要组分是几丁质和霉菌的细胞壁的主要组分是几丁质和-葡聚糖等。破壁时主要使用葡聚糖等。破壁时主要使用-1，3-葡聚糖酶葡聚糖酶和和几丁质酶几丁质酶的混合物。的混合物。植物细胞壁的破除植物细胞壁的破除 植物细胞壁主要由纤维素、半植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素、木质素和果胶等组成。破纤维素、木质素和果胶等组成。破除植物细胞壁主要采用除植物细胞壁主要采用纤维素酶纤维素酶、半纤维素酶半纤维素酶和和果胶酶果胶酶组成的混合酶。组成的混合酶。这几种酶大多数是由霉菌发酵产生。这几种酶大多数是由霉菌发酵产生。利用酶除去细胞壁，除了要根利用酶除去细胞壁，除了要根据细胞的结构特点选用适宜的酶之据细胞的结构特点选用适宜的酶之外，还必须控制好酶作用条件和时外，还必须控制好酶作用条件和时间。此外，若用酶除去细胞壁以制间。此外，若用酶除去细胞壁以制备原生质体时，必须在反应系统中备原生质体时，必须在反应系统中添加添加渗透压稳定剂渗透压稳定剂，维持，维持高渗状态高渗状态而使制备得到的原生质体不致破裂。而使制备得到的原生质体不致破裂。二、酶在大分子切割方面的应用 生物工程经常与生物大分子打交道。在许多情况下需要把大分子切割成较小的分子或片断，以便在生物工程的有关领域使用。在生物大分子的切割过程中往往要求在特定的位点上进行，这就只能借助于具有专一性的各种水解酶或其他酶类才能做到限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链限制性核酸内切酶在基因工程中用以从双链DNADNADNADNA分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒分子中切取所需的基因，并用同一种酶将质粒DNADNADNADNA或或或或噬菌体噬菌体噬菌体噬菌体DNADNADNADNA切开切开切开切开,以便进行以便进行以便进行以便进行DNADNADNADNA的体外重组。在应用时的体外重组。在应用时的体外重组。在应用时的体外重组。在应用时可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。可根据需要选用适宜的限制性核酸内切酶。如：如：1）Alu I酶识别顺序有酶识别顺序有4个碱基，作用位点在识别顺序内个碱基，作用位点在识别顺序内(箭头表箭头表示切点位置示切点位置)，作用后产生平整末端：，作用后产生平整末端：2）Asu I酶识别顺序有酶识别顺序有5个核苷酸，作用后产生黏性末端：个核苷酸，作用后产生黏性末端：DNADNA外切核酸酶外切核酸酶 DNADNA外切核酸酶在基因工程中用于载体或基因片段的切割加外切核酸酶在基因工程中用于载体或基因片段的切割加工。当获得的基因载体或基因片段太大时，可利用工。当获得的基因载体或基因片段太大时，可利用DNADNA外切酶外切酶从两条链的末端各除去若干个核苷酸，从两条链的末端各除去若干个核苷酸，而使而使DNADNA片段变小一些片段变小一些,以满足使用的需要以满足使用的需要;当获得的当获得的DNADNA片段为平整末端时片段为平整末端时,为使它变成为使它变成粘性末端粘性末端,可以采用从可以采用从55端或端或33端作用的端作用的DNADNA外切酶外切酶,以获得所以获得所需的带有粘性末端的需的带有粘性末端的DNADNA片段片段,以利于体外重组以利于体外重组DNADNA。该酶还可。该酶还可从从DNADNA生产脱氧核苷酸生产脱氧核苷酸 这是一类以脱氧核糖核酸(DNA)分子末端开始逐个除去末端核苷酸的酶。这些酶中有些可以从DNA链的5-末端开始作用，有些从3-末端开始作用，有些则可同时作用于5-末端和3-末端。它们的作用方式如图所示。碱性磷酸酶碱性磷酸酶 碱性磷酸酶可以除去DNA或RNA链中的5-磷酸。在基因工程中主要用在为防止质粒DNA的自我环化而除去5-磷酸，或在用32P对DNA或RNA进行5-末端标记之前除去5-磷酸。碱性磷酸酶还可以用于水解核苷酸生成核苷，并在酶标免疫测定方面应用。核酸酶核酸酶S1S1 该酶作用于单链DNA或RNA。在基因工程中，用于从具有单链末端的DNA分子中除去单链部分的核苷酸，而变成平整末端的双链DNA。在以mRNA为模板，合成互补DNA(cDNA)时，往往会发生“发夹状环”，用核酸酶S，就可使这些“发夹状环”除去。自我剪切酶自我剪切酶u 自我剪切酶(self-cleavage ribozyme)是一类催化本身RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。具有自我剪切功能的R酶RNA的前体。它可以在一定条件下催化本身RNA进行剪切反应，使RNA前体生成成熟的RNA分子和另一个RNA片段。u 1984年，阿比利安(Apirion)发现T4噬菌体RNA前体可以进行自我剪切，将含有215个核苷酸(nt)的前体剪切成为含139个核苷酸的成熟RNA和另一个76核苷酸的片段。u 已发现的具有自我剪切功能的R酶越来越多，通过自我剪切酶对自身RNA的剪切作用，可以获得各种所需的RNA或多聚核苷酸。RNARNA剪切酶剪切酶uRNA剪切酶是催化其它RNA分子惊醒剪切反应的核酸类酶。u例如：核糖核酸类酶P（RNase P）的核酸组分M1 RNA 在高浓度镁离子存在的条件下，可催化tRNA前体的剪切反应，除去部分RNA片段，而成为成熟的tRNA分子。三、酶在分子拼接方面的应用DNADNA连接酶连接酶 DNA连接酶是1967年发现的能使双链DNA的缺口封闭的酶。它催化DNA片断的5-磷酸基与另一DNA片断的3-OH生成磷酸二酯键。在基因工程中，主要采用的是T4-DNA连接酶，该酶是由T4-噬菌体感染大肠杆菌细胞后产生的，可用于具黏性末端的两个DNA片断的连接，也可用于有平整末端的两个DNA片段的连接。故此可将由同一种限制性核酸内切酶切出的载体DNA和目的基因连接起来，成为重组DNA。该酶是基因工程中常用的工具酶。许多酶都具有分子拼接能力，能将两个或多个分子连接在一起而合成较大的分子。这些酶类在生物体内是至关重要的，它们催化各种各样的生物合成反应。DNADNA聚合酶聚合酶 DNA聚合酶是一类催化DNA复制和修复DNA分子损伤的酶。主要包括大肠杆菌DNA聚合酶I，大肠杆菌DNA聚合酶，大肠杆菌DNA聚合酶和T4-DNA聚合酶，水栖耐热菌(Thermus aquaticus)耐热DNA聚合酶(Taq DNA polymerase)等。这类酶的作用方式基本相同，即催化一个脱氧核苷三磷酸加到模板或引物的3-OH上，并放出一个焦磷酸分子。DNA聚合酶的共同特点：(1)需要模板或引物。(2)不能起始新的DNA链的合成。(3)催化脱氧核苷三磷酸加到DNA链的3OH末端。(4)合成的方向是从5末端至3末端。末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶u末端脱氧核苷酸转移酶（TDT)从小牛胸腺分离得到，其作用是向DNA的3-OH末端转移脱氧核苷酸。在基因工程中是利用该酶给DNA片段加上一段同聚体，形成附加末端。采用32P 或者荧光标记的脱氧核苷酸进行3-末端标记，以便与DNA的分离检测。反转录酶反转录酶 该酶又称依赖于RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，以脱氧核苷三磷酸为底物，合成DNA。该酶在基因工程中广泛应用于从mRNA反转录生成互补的DNA(cDNA)，以获得所需的基因。现在利用各种反转录酶进行反转录PCR，可以简便、快速地获得所需的基因。在使用时，首先要经过分离纯化，获得单一的RNA作为模板使用，如果RNA不纯，将会产生错误反转录。此外需要设计和合成一段由1530个碱基组成的与模板RNA互补的PCR引物，才能进行反转录。蛋白酶蛋白酶u利用蛋白酶进行有机的研究非常引人注目，并取得显著成果。u例如，用金属蛋白酶催化N-末端经修饰保护的L-天冬氨酸与L-苯丙氨酸缩合生成甜味剂天苯肽或称为阿斯巴甜。利用-胰凝乳蛋白酶催化苯丙氨酸与丙氨酸合成二肽等。脂肪酶和酯酶脂肪酶和酯酶u脂肪酶和酯酶在水溶液中催化脂类水解成为有机酸和醇，而在非水相介质或微水有机介质中却可催化其逆反应，使醇和酸合成酯。u利用这种技术可以在含微量水的有机介质中获得大量不饱和脂肪酸的油脂以及其它酯类，有着极其广阔的应用前景。自我剪接酶自我剪接酶 自我剪接酶(self-splicing ribozyme)是在一定条件下催化其本身RNA分子同时进行剪切和连接反应的核酸类酶。自我剪接酶都是RNA前体。根据其结构特点和催化特性的不同，该亚类可分为两个小类，即含I型IVS的R酶和含型IVS的R酶。I型IVS与四膜虫rRNA前体的间隔序列(IVS)结构相似，需要鸟苷(或5-鸟苷酸)及镁离子(Mg2+)参与，才能催化rRNA前体的自我剪接。型IVS则与细胞核mRNA前体的IVS结构相似，在催化mRNA前体的自我剪接时，需要镁离子参与，但不需要鸟苷或鸟苷酸。通过自我剪接酶的催化作用，可以将原来由内含子隔开的两个外显子连接在一起，成为成熟的RNA分子。其催化反应如下式所示：