生物产品分析与检验实验指导.doc

实验一、乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物检验
一、实验目的
1.了解酸乳中乳酸菌分离原理
2. 学习并掌握乳酸菌饮料中乳酸菌菌数的检测方法。
二、实验 原理
活性酸奶需要控制各种乳酸菌的比例，有些国家将乳酸菌的活菌数含量作为区分产品品种和质量的依据。
由于乳酸菌对营养有复杂的要求，生长需要碳水化合物、氨基酸、肽类、脂肪酸、酯类、核酸衍生物、维生素和矿物质等，一般的肉汤培养基难以满足其要求。测定乳酸菌时必须尽量将试样中所有活的乳酸菌检测出来。要提高检出率，关键是选用特定良好的培养基。采用稀释平板菌落计数法，检测酸奶中的各种乳酸菌可获得满意的结果。
三、实验材料
1.培养基
改良MC培养基(Modified Chalmers培养基)
2.仪器和器具
无菌移液管（25ml,1ml），无菌水（225ml带玻璃珠三角瓶，9ml试管），无菌培养皿，旋涡均匀器。
恒温培养箱。
四、实验方法
流程：酸奶→稀释→制平板→培养→检查计数
1.样品稀释
先将酸奶样品搅拌均匀，用无菌移液管吸取样品25ml加入盛有225ml无菌水的三角瓶中，在旋涡均匀器上充分振摇，务必使样品均匀分散，即为10-1的样品稀释液，然后根据对样品含菌量的估计，将样品稀释至适当的稀释度。
2.制平板
选用2~3个适合的稀释度，培养皿贴上相应的标签，分别吸取不同稀释度的稀释液1ml置于平皿内，每个稀释度作2个重复。然后用溶化冷却至46℃左右的 改良MC培养基倒平皿，迅速转动平皿使之混合均匀，冷却成平板。
3.培养和计数
将平皿倒置于40℃恒温箱内培养24~48h，观察长出的细小菌落，计菌落数目，按常规方法选择30~300个菌落平皿进行计算。
五、结果
1.指示剂显色反应
乳酸菌的菌落很小，1~3mm，园形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暗黄色。由于产酸菌落周围能使CaCO3产生溶解圈，酸碱指示剂呈酸性显色反应。
2.镜检形态
必要时，可挑取不同形态菌落制片镜检确定是乳杆菌或乳链球菌。保加利亚乳杆菌呈杆状，成单杆、或双杆菌或长丝状。嗜热链球菌，呈球状，成对、或短链、或长链状。
3.计数结果
公式：平均菌落数×稀释倍数
稀释度

重复
1
2
1
2
1
2
菌落数

平均数

报告

八、思考
1.为什么乳酸菌的检测关键是选用特定良好的培养基？
2.培养基中为什么要加CaCO3？

实验二、发酵制品中大肠菌群的测定
一、实验目的
1、学习食品中大肠菌群检测程序、方法；
2、掌握食品中大肠菌群检测结果的报告方式。
二、实验原理
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
三、实验材料
1、设备和材料
温箱、水浴锅、天平、显微镜、均质器或乳钵、温度计、平皿、试管、发酵管、吸管、载玻片、接种针
2、培养基及试剂
乳糖—胆盐发酵管、乳糖发酵管、蛋白胨水、靛基质试剂、麦康凯、伊红美蓝琼脂（EMB）、远腾氏琼脂、革兰氏染色液
3、样品
发酵香肠
四、实验方法与步骤
1、采样及稀释
①以无菌操作将检样25g放于含有225ml灭菌生理盐水，用均质器，以8 000～10000r/min的速度处理1min，做成1∶10的均匀稀释液。
②用1ml灭菌吸管吸取1：10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇混匀，做成1：100的稀释液，换用1支1ml灭菌吸管，按上述操作依次作10倍递增稀释液
③根据食品卫生要求或对检验样品污染情况估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。也可直接用样品接种。
2. 乳糖初发酵试验
即通常所说的假定试验。其目的在于检查样品中有无发酵乳糖产生气体的细菌。
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；1ml及1ml以下者，用单料乳糖发酵管。每一个稀释度接种3管，置（36±1）0C温箱内，培养（24±2）h，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产生者，则按下列程续进行
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂板或麦康凯琼脂平板上，置（36±1）0C温箱内，培养18h~24h，然后取出，观察菌落形态并作革兰氏染色镜检和复发酵试验。
4.乳糖复发酵试验
即通常所说的证实试验，其目的在于证明从乳糖初酵管试验呈阳性反应的试管内分离到的革兰氏阴性无芽胞杆菌，确能发酵乳糖产生气体。
在上述的选择性培养基上，挑取可疑大肠菌群1~2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置（36±1）0C的温箱内培养（24±2）h，观察产气情况。
凡乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性无芽胞杆菌，即报告为大肠杆菌阳性；凡乳糖发酵管不产气或革兰氏染色为阳性，则报告为大肠杆菌为阴性。
5.报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml（g）食品中大肠菌群的最可能数。
试管编号
稀释度
初发酵
分离实验
形态
复发酵
试验结果
1

2

3

4

5

6

7

8

9

报告

实验三 伤寒疫菌免疫力实验
一、实验目的
学习如何进行伤寒疫菌免疫力测定.
二、实验原理
伤寒是一种由伤寒杆菌感染所致的、使人衰弱并威胁生命的肠道传染病。伤寒患者会有持续发热、疲倦、食欲不振、严重头痛、脾脏胀大、便秘或腹泻的情况出现。副伤寒的病征与伤寒相似，但程度一般较轻，它是由另一类的沙门氏菌所引起的。
伤寒及副伤寒的传播途径是经由一些受到病者或带菌者的粪便或尿液所沾染的饮食而传播。带菌者是一些经感染后而康复的人士，但在体内仍存着病菌。若食物及饮品曾由一些不断排放病菌的人员处理、或饮用和冲洗食物的水受到污水所污染，便有机会传播伤寒及副伤寒病。该疾病在缺少充分的排污系统和环境卫生设施的发展中国家比较多见。据美国疾病控制和预防中心报道，全世界每年约有1600万人发生伤寒，其中大约60万人死于该疾病。
三、实验材料
小鼠 毒菌 伤寒 疫苗
四、实验步骤
将经56℃30分钟加温杀菌（或用其他方法杀菌），不加防腐剂的菌液稀释为每1ml含伤寒菌2.5×108。用该菌液免疫体重为14~16g小鼠至少30只，每只皮下注射0.5ml，注射2次，间隔7天，末次免疫后9~11天进行毒菌攻击。免疫组小鼠每只腹腔注射1 MLD的毒菌（含于0.5ml中），同时应用同批饲养或体重与免疫组相同的小鼠3组（每组至少5只）作对照，分别于腹腔注射2、1及1/2 MLD 的毒菌（各含于0.5ml中）。观察3天，对照组小鼠感染2 MLD及1 MLD者应全部死亡，感染1/2 MLD者要有部分死亡。免疫组至少保护70%小鼠活存。
五、实验结果：

实验四 光化学荧光分析法测定氨苄青霉素
一 实验目的
学会氨苄青霉素的测定方法
二、实验原理
氨苄青霉素(Ampicillin) 为临床上常用控制细菌感染的一类重要的青霉素类抗生素,属广谱抗菌素，对大多数G+菌的抗菌作用不及青霉素G,对阴性杆菌的作用超过青霉素。作用机制同青霉素。 但肠球菌对氨苄青霉素较为敏感,对G-杆菌作用较卡那霉素,庆大霉素弱,与四环素相仿,对伤寒杆菌,大肠杆菌的抗菌作用较强,绿脓杆菌和金葡菌对本品耐药.主要用于治疗敏感细菌所致的败血症、尿路感染、肺部感染、胆道感染等；治疗伤寒、副伤寒疗效与氯霉素相仿。本品在脑膜炎症时，脑脊液浓度较高，也适用于治疗由肺炎球菌、脑膜炎双球菌及流感杆菌引起的脑膜炎。与其他半合成青霉素类、氨基糖甙类及氯霉素等合用可增强疗效。
　 鉴于其特殊的药理作用,其质量控制就显得更为重要。目前国内外主要通过高效液相色谱法来测定氨苄青霉素的含量, 本实验采用光化学荧光分析法来测定其粉针剂中氨苄青霉素的含量。
三、实验材料
氨苄青霉素药物（市售）
RF-5000型荧光分光光度计
YE-1型荧光分光光度计
125W高压汞灯（破除玻璃外壳）
TOA型Ph计
2%甲醛溶液
四、 实验步骤：
将药物样品稀释，制定溶液，移取一定量的药物溶液于25ml干燥烧杯中，加入2.0ml,Ph=5.6缓冲溶液，加入至20.0ml混匀，移取2.00ml于10ml容量瓶中，加入1.00ml 2%甲醛，用2mol/L NaOH溶液定容至刻度，摇匀，避光放置40min,后于426nm处测量荧光相对强度。
五、 实验结果：
测量该药物中氨苄青霉素含量为
实验一 动物细胞培养
细胞培养是用无菌操作的方法将动物体内的组织(或器官)取出，模拟动物体内的生理条件，在体外进行培养．使其不断地生长、繁殖，人们借以观察细胞的生长、繁殖、细胞分化以及细胞衰老等过程的生命现象。
细胞培养的突出优点，一是便于研究各种物理、化学等外界因素对细胞生长发育和分化等的影响；二是细胞培养便于人们对细胞内结构(如细胞骨架等)、细胞生长及发育等过程的观察。因而细胞培养是探索和指示细胞生命活动规律的—种简便易行的实验技术，同时我们也不可忽略的另一个因素，那就是它脱离乐生物机体后的—些变化。
细胞培养技术目前已广泛地被应用于生物学的各个领域。如分子生物学、细胞生物学、遗传学、免疫学、肿痛学及病毒学等
为此有必要使学生在细胞培养方面得到一些初步的感性知识，了解动物细胞培养的基本操作过程，观察体外培养细胞的生长特征，对原代细胞与传代细胞有一个基本概念。
本实验分两次进行．即清洗与消毒和传代细胞的培养与观察。
Ⅰ清洗与灭菌
一、实验目的
能独立地进行用于细胞培养的各种器皿的清洗与消毒，掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过除菌法的操作，了解化学消毒法的使用方法。
二、实验原理
清洗与消毒是组织培养实验的第一步，是组织培养中工作量最大，也是最基本的步骤。体外培养细胞所使用的各种玻璃或塑料器皿对清洁和无菌的要求程度很高。细胞养不好与清洗不彻底有很大关系。清洗后的玻璃器皿，不仅要求干净透明，无油迹，而且不能残留任何物质。如有毒的化学物质，哪怕残留0．1个，也可能影响细胞生长。灭菌手段的选择十分重要，对不同的物品需采用不同的灭菌方法。假如选用的方法不对，即使达到了无菌却使被灭菌药品丧失了营养价值、生物学特性或其他使用价值也不行。以下在每种灭菌步骤中都介绍其使用范围。
三、实验材料、用品
材料：无臭氧型紫外灯，微孔滤膜(直径25)：孔径为0．22μm，微孔滤膜(直径90)：孔径为0．22 μm，过滤器(直径25)。
药品：70％或75％酒精，0．1％新洁尔灭，煤酚皂溶液(来苏儿水)，0．5％过氧乙酸，乳酸，37％甲醛，高锰酸钾，NaOH，盐酸，重铬酸钾，浓硫酸(工业)，DEPC水[体积分数0．1％的焦炭酸二乙酯(diethylpyroearbonate)]。
仪器：超净台，干燥箱，高压锅，过滤器，过滤泵。
四、实验步骤
(一)清洗
1．新玻璃器皿的清洗先用自来水刷洗，再浸泡5％稀盐酸以中和玻璃表面的碱性物质和其他有害物质。
2．使用过的玻璃器皿的清洗
(1)使用过的培养用品应立即浸入清水，避免干涸难洗。
(2)用洗涤剂清洗玻璃器皿，自来水清洗数遍，倒置自然干燥。
(3)浸酸性洗液过夜。
(4)从酸性洗液捞出后自来水冲洗10．15次去除残余酸液，蒸馏水涮洗3次，倒置烘干。
(5)包装(牛皮纸或一般纸)。
(6)高压(15磅20 min)或干热(170℃2 h)灭菌。
(7)贮存备用。
3．胶塞的处理
(1)新胶塞应先用清水清洗之后再用0．2％NaOH煮沸lO-20 min。
(2)自来水清洗10次。
(3)再用1％稀盐酸浸泡30 min。
(4)自来水清洗10次，蒸馏水涮洗3次。晾干，高压灭菌(见(二)消毒与灭菌)。旧胶塞不必用酸碱处理可直接用洗涤剂煮沸和清洗数次，过蒸馏水，晾干，包装并高压灭菌后，便可使用。
（二）消毒
1．物理消毒法
(1)紫外线消毒 用于消毒空气、操作台面和一些不能用干热、湿热灭菌的培养器皿，如塑料培养皿、培养板等。这是常使用的消毒方法之一。
(2)干热灭菌 主要用于玻璃器皿的灭菌。将用于细胞培养的器皿放人干燥箱内，加热至160℃，保温90－120 min。用于RNA提取实验的用品则需180℃，保温5－8 h。
(3)湿热灭菌 此方法也称为高压蒸汽灭菌，是最有效的一种灭菌方法。主要应用范围是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS、20×SSC等)。手动高压灭菌锅操作如下：
①首先查看高压锅内的水是否充足，放人物品盖好盖。
②加热高压锅。将放气阀打开，放气5—10 min，以排除锅内的冷空气。
③待锅内水沸腾后，落下放气阀继续升温升压，玻璃器皿等用15磅(121℃)30 min，胶塞、塑料制品、溶液等可用10磅(115 ℃)20 min。调节火力大小保持该压力。
④停止加热，待压力自然下降至0再打开放气阀排汽，开盖，取出高压灭菌的物品烘干。
电热自动灭菌锅使用说明(型号：SANYO Autoclave MLS-3020)：
①放气筒加水至LOW水平线处，将与高压锅相连的导气管插入放气筒里，然后将放气筒归于原位。
②打开高压锅盖，加入蒸馏水至高压锅底的水位线，水位线位于V型凹槽的1／3－2／3处。
③打开电源。
④设定高压温度及时间，高压锅的温度范围为105－121℃，高压灭菌一般采用121℃20—30 min。
⑤把待高压的物品置于高压锅内，顺时针方向将exhaust钮旋至close位置。
⑥关闭高压锅盖，旋至显示屏上左上角的红亮点刚出现为止。
⑦按start钮，开始高压，在温度达80℃时显示器开始显示温度，当温度达到所需的设定温度时，在显示屏的左下角有一长形的指示灯闪亮，直到高压时间结束后指示灯灭，此时蜂鸣器报警一声。当压力降至0 MPa时，蜂鸣器再报警一声。温度降至80℃时，蜂鸣器报警10次。显示屏温度指示消失，此时才可打开锅盖。
⑧关电源，开高压锅盖，取出已灭菌的物品，烘干。
(4)滤过除菌 用于培养用液和各种不能高压灭菌的溶液的灭菌。采用金属滤器和小型的塑料滤器，配上可以更换的微孔滤膜，极大地方便了操作。滤器型号按直径大小划分。如过滤量大的培养用液常用较大型号的金属滤器(直径90 mm、100 mm、142 mm……等)，配以过滤泵使用。过滤量较小的液体常用注射器推动的塑料小滤器(直径20 mm、25 mm等)。滤膜孔径有0．60 μm、0．45 μm、0．35 μm、0．22 μm、0．10μm等，以0．22 μm除菌最为保险，但对于较粘稠难滤过的液体，仍需选用孔径较大的滤膜。
①在过滤器上装上微孔滤膜，孔径为0．22μm。
②用布包好，湿热灭菌后使用。
2．化学消毒法
常用的消毒液有如下几种：
(1)70％(或75％)酒精：超净台里常备70％酒精棉球(卫生级酒精)，用于手和一些金属器械或工作台面的消毒。
(2)0．1％新洁尔灭：主要用于手和前臂的清洗以及工作后超净台面的清洁。超净台旁应常备盛有0．1％新洁尔灭溶液的容器及纱布。
(3)来苏儿水(煤酚皂溶液)：主要用于无菌室桌椅、墙壁、地面的消毒和清洗，以及空气喷撒消毒，特别是污染细胞的消毒处理。使用浓度请按瓶上说明。
(4)0．5％过氧乙酸：是强效消毒剂，10 min即可将芽孢菌杀死。用于各种物品的表面消毒，用喷撒和擦拭方式进行。
(5)乳酸蒸气：将乳酸放入坩锅内用酒精灯或电炉加热至沸腾为止。将门窗紧闭1—3 d。可将空气中漂浮的微生物杀死。
(6)37％甲醛加高锰酸钾：使用前先紧闭门窗。将37％甲醛用酒精灯或电炉加热至沸腾后断电或灭火。用一张纸盛好适量的高锰酸钾，迅速放人已加热好的甲醛中形成蒸气。1—3 d后方可达到消毒空气的目的。
3．煮沸消毒 急性消毒可用煮沸法，器械等煮沸15 min后使用。
五、注意事项
1．清洗玻璃制品时，浸酸之后一定要用自来水冲洗10—15次。因为残存的洗液对细胞粘附有很大影响。清洗塑料制品时要用棉花或柔软纱布擦洗。千万不要用硬毛刷，否则损害塑料表面后细胞不易贴壁。Tip和Tube一定要用超声清洗处理后逐个清洗。如没有洗净会影响下一次使用的效果。
2．干热灭菌时，应在白天使用烤箱，并不断观察，以免发生意外。当温度超过100℃时，不能再打开烤箱门。器皿烤完后，待温度降至100℃之下才能开烤箱门。金属器械和橡胶、塑料制品不能使用干热灭菌方法。．
3．高压灭菌后器皿务必晾干或烘干，以防包装纸潮湿发霉。
4．牛血清、大部分培养基、胰酶和一些生物制剂是有机溶液，均不能高压(如TdR，秋水仙素，谷氨酰胺，异硫氰酸胍，MOPS等)。
5．滤过除菌时，滤器在使用前先装好滤膜(有时可在上面加一层定性滤纸)，包好，经高压灭菌后才能使用。滤过酶类制剂时应待滤器温度降至室温下再进行。过滤时压力不宜过大，压力数字以2为宜。压力太大时微孔滤膜可能破裂，或使某些微生物变形而通过滤膜。装滤膜时位置要准确。另外滤器包装时，螺钉不要拧得太紧，以防高压蒸汽不能进入，待高压灭菌之后，再拧紧使用。
6．使用化学消毒法时，配制75％酒精应用卫生级，不要用化学纯、分析纯和优质纯酒精。来苏儿水不能用于皮肤消毒，它对皮肤有刺激性。空气消毒时，所有的物品要事先准备齐全并使消毒者有较方便的退出途径。因为甲醛或乳酸加热后放出的蒸气对人的角膜和呼吸道上皮有严重的刺激和伤害作用。
六、思考题
1．哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
2．紫外线消毒的适用范围和目的是什么?
II、传代细胞培养与观察
一、实验目的
了解传代细胞的传代方法及操作过程，学习观察体外培养细胞的形态及生长状况
二、实验原理
传代培养是指细胞从一个培养瓶以1：2或1：2以上的比例转移，接种到另一培养瓶的培养。
这种培养，第一步也是制备细胞悬液，当细胞长成致密单层时，它很容易被蛋白水解酶和EDTA)所破坏。所以—般采用胰蛋白酶和EDTA(乙二胺四乙酸盐)的混合物，做为消化液。
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。
三、实验用品
1、器材
解剖剪、解剖镊、眼科剪(尖头、弯头)、眼科镊(尖头、弯头)、培养皿、量筒、试管、锥形瓶、吸管、橡皮头、培养瓶(小方瓶或中方瓶)等。上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9．9xl04Pa(15磅)灭菌30min备用。
此外，还有显微镜、血细胞计数器、血细胞计数板、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、解剖板等。
2、试剂
L磷酸盐缓冲液(PBs)
无钙、镁溶液
细胞消化液：o．5％胰蛋白酶和o．4%EDTA
EMEM液
3%谷氨酰胺
o．5％台盘蓝染液等
3、材料
喉癌细胞
四、实验方法
在做传代细胞培养之前，首先将培养瓶置于显微镜下，观察培养瓶中细胞是否已长成致密单层，如已长成单层，即可进行细胞的传代培养。
1.营养液配制:
EMEM液                                90%
犊牛血清                              10%
双抗(1万单位／m1)               加至约100单位／m1
3％谷氛酞胺                           1m1
7．4％NaHCO3                    调pH至6．8—7．0
2．换液:
在酒精灯旁打开瓶塞，倒去瓶中的细胞营养液。
3.消化与分装
在上述瓶中加入1mlEDTA溶液，轻轻摇动，将溶液倒出。重复上述动作。加入适量消化液（0.02%EDTA或0.04％EDTA1ml十o．5％胰蛋白酶液0.2ml）以盖满细胞为宜，置于室温，停留1—2min后，翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层是否出现缝隙(针孔大小的空隙)，如出现缝隙，即可倒去消化液；如末出现缝隙，则可将瓶翻回，继续进行消化，直到出现缝隙为让。此时，可倒去消化液，加入新配制的营养液20m1。然后用吸管吸取培养瓶中的营养液，反复吹打瓶壁上的细胞层至瓶壁细胞全部脱落下来为止。此时，可继续轻轻地吹打细胞悬液，以使细胞散开。随之进行分装。
4．培养
分装好的细胞瓶上，做好标志，注明细胞代号、日期。置于培养架上，轻摇使细胞均匀分布，以免堆积成团。然后置于37℃培养。
5.观察
(1)观察体外培养细胞的几个问题；
细胞培养24h后，即可进行观察，观察的重点如下：
A.首先要观察培养细胞是否污染。主要观察培养液颜色的变化及混浊度
B.观察培养姬颜色变化及细胞是否生长。
C.如细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段。观察时可参照(2)的描述进行。
D．观察完毕，可用台盘蓝染液对细胞进行染色。以确定死、活细胞的比例。
(2)细胞的生长阶段及其形态特征
传代培养的细胞需逐日进行观察，注意细胞有无污染，培养液颜色的变化及细胞生长的情况。—般中层培养的细胞，从培养开始，经过生长、繁殖、衰老及死亡的全过程。它是一个连续的生长过程，但为了观察及描述，人为地将具分为5个时期，但各期间无明显绝对界限。现分别描述如下：
A．游离期：当细胞经消化分散成单个细胞后，由于细胞原生质的收缩相表面张力以及细胞膜的弹性。所以，此时细胞多为圆形，折光率高，此期可延续数h。
B．吸附期(贴壁)：由于细胞的附壁持性，细胞悬液静置培养一段时间(约7—8h)后，便附着在瓶壁上(此期不同细胞所需时间不同)。在显微镜下观察时可见瓶壁上有各种形态的细胞，如圆形、扁形、短菱形。细胞的特点，大多立体感强，细胞内颗粒少，透明。
C.繁殖期：培养l2h以后直到72h，细胞进入繁殖期，加速了细胞生长和分裂。此期包括由几个细胞形成的细胞岛(即由少数细胞紧密聚集而呈现的孤立细胞群，常散在地分布在瓶壁上)，到细胞铺满整个瓶壁(即所谓形成细胞单层)的过程。此期细胞形态为多角形(呈现上皮样细胞的特征)。细胞特点：透明，颗粒较少，细胞间界限清楚，并可隐约见到细胞核。根据细胞所占瓶壁有效面积的百分率，又可将其生长状况分为四级。以“十”的多少表示如下：
十：细胞占瓶壁有效面积(也就是细胞能生长的瓶壁面积)的25％以内有新生细胞。一般要观察3—5个视野内的细胞生长状况，然后加以综合分析判断。
十十：细胞占瓶壁有效面积的25—75％以内具新生细胞。
十十十：细胞占瓶壁有效面积的75—95％具新生细胞。细胞排列致密。但仍有空隙。
十十十十：细胞占瓶壁95％以上，细胞已长满或接近长满单层，细胞致密，透明度好。
从十十一十十十十为细胞的对数增长期(或称为指数增长期)。
D．维持期：当细胞形成良好单层后，细胞的生长与分裂都减缓，并逐渐停止生长，这种现象被称为细胞生长的接触抑制。此时细胞界限逐渐模糊，细胞内颗粒逐渐增多，且透明度降低，立体感较差。由于代谢产物的不断积累，维持液逐渐变酸。此时营养液已变为橙黄色或黄色。
E．衰退期：由于溶液中营养的减少和日龄的增长，以及代谢产物的累积等因素，此时细胞间可出现空隙，细胞中颗粒进一步增多，透明度更低，立体感很差。若将细胞经固定染色处理后，可见细胞中有大而多的脂肪滴及液泡。最后，细胞皱缩，逐渐死亡，从瓶壁上脱落下来。
五、思 考 题
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意乡项。
3．细胞培养获得成功的关键要素是什么?
3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。

实验二 植物细胞组织培养
一．实验目的
植物细胞和组织培养的技术性强，要求无菌操作，通过本实验可初步掌握常规的组织培养技术，加深对无菌操作的了解。
 二．实验原理
植物的全能性：植物体的任何一个细胞都具有生长分化成为一个完整植株的能力，称为植物的全能性。
植物组织培养就是利用植物的全能性进行离体无菌植物培养的一门技术。植物组织培养按其原始意义，就是指愈伤组织培养。但发展至今，其范围日益扩大，已包括植物和它的离体器官、组织、细胞和原生质体的离体无菌培养。因此，拥有几种不同水平的培养技术，即整体的、器官的、组织的、细胞的和原生质的培养技术。
    本实验选择豌豆为材料，豌豆（Pisum sativum）属豆科植物，是粮食、饲料和重要的蔬菜作物，也是遗传学家和植物生理学家感兴趣和乐于采用的实验植物，豌豆的根、茎、子叶、下胚轴、上胚轴、花芽等外植体，皆可形成愈伤组织，其中茎尖、幼胚、幼叶等器官可成功的再生成植株。茎尖培养可包括小至十几微米的茎尖分生组织（生长点）和大至几十毫米的茎尖或更大的芽培养。在实践应用上，常采用生长点的培养使患病植物去病毒，以达到挽救优良品种，提高产量和质量之目的。
 三．实验材料
仪器设备：1．酒精灯、三角烧瓶，培养皿；2．镊子、剪刀、剖针；3．双筒解剖显微镜；4．光照培养箱或温室；
材料 烟草无菌苗、豌豆幼苗。
试剂
（1）MS培养基，植物激素：NAA、6-BA等；
（2）饱和漂白粉液（次氯酸钠）；
（3）70%酒精、100%酒精、酒精棉球；
（4）无菌水 
四．实验步骤
豌豆苗的茎尖培养
⑴ 取发芽6天的豌豆幼苗10株，简取1厘米左右的茎尖，浸入70%的酒精中1分钟，再浸入饱和次氯酸钠溶液中消毒15分钟，（此步以后要求无菌）用无菌水中冲洗5次，在灭菌的滤纸上吸干水分，放入灭菌的培养皿中。
⑵ 在双目解剖镜下，用灭菌的解剖针剥去幼叶露出生长锥，用灭菌的解剖针挑取带着两至三个叶原基的生长锥。
⑶ 将挑好的茎尖移到MS+10.7μmol/L萘乙酸(NAA)+4.4μmol/L 6-苄基腺嘌呤（6-BA）的培养基上诱导愈伤组织形成，用封口膜将培养皿封好。
（4）在恒温培养箱中，26℃下,培养六周，形成愈伤组织，经继代后，可用于生根培养

实验三 酵母菌细胞融合实验
一、实验目的
学习酵母菌原生质体制备和再生技术，为了解酵母菌为材料的外源基因转移等技术奠定基础。
二、实验原理
酵母菌如酿酒酵母，在遗传学和分子生物学的研究中有很大作用，尤其是近些年来，随着科技的进步，酵母菌的遗传操作如转化、基因克隆和外源基因在酵母受体中的表达等技术都有了突破性的进展。作为受体系统的酵母菌原生质体在这些技术中有独特的地位。这种经溶菌酶处理脱壁后的细胞（脱壁不完全者称原生质球）既可以作为不同种属间细胞融合的母体，实现细胞器等大结构的转移，又可作为外源基因转移的受体，大大提高基因转移的效率。这些新技术不仅促进了酵母菌遗传学的发展，而且很多已应用到构建新的酿酒业酵母。
本实验以酿酒酵母为材料，进行原生质体的分离制备和再生。酵母菌原生质体的制备一般采用蜗牛酶、酵母溶菌酶或其它细胞壁溶解酶类。分离制备过程受许多因素的影响，如不同菌株的生长期、细胞浓度、溶菌酶类型和用量、处理时间和温度等。所以整个实验过程设计应综合考虑各种因素，才能获得较好的效果。分离制备的原生质体在适当的再生培养基上培养时，可以再生出细胞壁而恢复完整细胞状态，即完成再生过程，这也是以原生质体为受体的所有实验技术最终能实现的一个关键步骤。
在原生质体制备中，应选用适当生长时期的菌体作为分离的材料。一般来说，对数生长期的酵母菌细胞易脱壁，静止期细胞较难甚至不可能形成原生质体。而不同菌种的生长对数期也略有差异，一般在12～16小时之间（108细胞/ml）。制成的原生质体悬浮液在0℃条件下保存4～6小时，不会影响融合再生率。所以欲进行原生质体融合，应在制备后尽快进行，以免时间过长，影响再生。
分离过程中采用的β-巯基乙醇可使细胞壁组分中的二硫键破坏，使蜗牛酶易于分解细胞壁。此外，渗透压的调节可用0.8mol/L山梨醇、16％蔗糖，或者0.6mol/L KCl溶液。
三、实验材料
菌种：酿酒酵母SP-48、L-酵母：　　
器具和试剂：
恒温摇床、恒温水浴、显微镜、台式离心机、培养皿、试管、过滤灭菌装置。
液体YEPD：1000 ml 分装四瓶（蛋白胨 2% 葡萄糖 2% 酵母浸膏 1% 自然pH 值）
高渗YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液体培养基中加入2%琼脂
PB：2000 ml
柠檬酸：21克溶于1000毫升蒸馏水中 磷酸氢二钠：143.256克溶于2000毫升蒸馏水中
取柠檬酸溶液678毫升 取磷酸氢二钠溶液1322毫升 混合得2000毫升PB
高渗PB：取1000毫升PB加入KCL52.185克
PEG-CaCl：聚乙二醇6000 40克 加入至100毫升高渗PB溶液中 使氯化钙为0.4mol/l
0.2%β-巯基乙醇，无菌过滤器过滤.
蜗牛酶液:1.5% 蜗牛酶用高渗PB缓冲溶液配制，无菌过滤器过滤.
淀粉YEPDS：1000 ml (加入 kcl 52.5 g) YEPD 液体培养基中加入2%琼脂（蛋白胨 2% 淀粉 2% 酵母浸膏 1% 自然pH 值）
四、实验步骤
　　整个分离制备和再生过程于无菌条件下操作。
1.原生质体的制备:
(1) 菌种培养:将酵母菌sp-48和L-酵母活化转接新鲜斜面.自新鲜斜面分别挑取一环sp-48酵母和L-酵母转接入250ml完全培养基中,30℃振荡培养16-18h.
(2) 收集细胞：取上述对数生长期的酵母细胞培养液5ml,4000r/min离心10min，弃上清液.柠檬酸-磷酸缓冲液(PB)洗两次，收集菌体
(3) 预处理：取5ml0.2%β-巯基乙醇PB缓冲液于装有酵母泥的离心管中,30℃保温10min,以1000转/分离心10min,倾去上清液
(4) 脱壁：在装有处理过的SP－48,L-酵母菌泥的两只离心管中，分别加入5ml 1.5%蜗牛酶-PB溶液置30℃水浴中处理,取样镜检,当 80%以上的细胞转变为原生质体 2500r/min离心10min,用PB液离心洗涤，洗去酶液，加入4ml高渗PB液制成106/ml以上的原生质体液,测定形成率
原生质体形成率=(酶解前菌落计数-未形成原生质体菌数)/ 酶解前菌落计数×100%
2.原生质体再生率测定 :
将制备的原生质体稀释到2-3×107个/ml,各取1ml原生质体液用PB液稀释后涂布在高渗完全培养基（YEPDS）和完全培养基(YEPD).30℃培养2天计算菌落数,酶解前的菌液直接用无菌水稀释涂布完全培养基，培养后计算菌数。
原生质体再生率％＝

3.原生质体的融合:
(1). 将L-酵母的原生质体用紫外线灭活2分钟,在黑暗中保存20分钟, 2500rad/min离心10min,用2ml高缓冲液悬浮.
(2). 将两菌的原生质体悬浮液混合,离心,向沉淀中加入3mlPEG-CaCl2,振荡均匀, 30℃处理20min, 镜检并观察融合情况.
(3). 用高深缓冲液洗涤菌体沉淀, 2500rad/min离心10min.
(4). 立即用高深缓冲液稀释,取融合原菌液及10-1稀释液各0.1ml菌液,涂布于再生培养基平板上.
4.融合子的检出:
将融合液涂布在加有0.01%的放线菌酮和青霉素(100IU/ml)的再生培养基上,30℃进行培养2天,计算融合率.
融合率=×100%
五、实验结果
1.融合子的鉴定 : 观察比较两亲株和融合子的细胞形态
2..计算两亲本原生质体的形成率和再生率
3.计算融合率