PCR分子标记.pptx

聚合酶链反应技术简称聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一技术，是一种利用种利用DNA变性和复性原理在体外进行变性和复性原理在体外进行特定的特定的DNA片段高效扩增的技术，可检片段高效扩增的技术，可检出微量靶序列（出微量靶序列（1个个copy）。在模板）。在模板DNA、引物和、引物和dNTP存在的条件下依赖于存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。聚合酶的酶促合成反应。仅需用极少量模板，在一对引物介导下，仅需用极少量模板，在一对引物介导下，在数小时内可扩增至在数小时内可扩增至100-200万万copy.第1页/共63页 PCR(Polymerase Chain Reaction)Threesteps:denaturation,primer annealing,polymerization.PCR反应分三步：变性、退火及延伸。反应分三步：变性、退火及延伸。第2页/共63页发展历史发展历史60s-70s60s-70s：基因的体外分离技术。：基因的体外分离技术。KhoranaKhorana（19711971）：美国教授、）：美国教授、19681968年诺贝年诺贝尔医学奖得主，提出尔医学奖得主，提出 “经过经过DNADNA变性，与合适变性，与合适引物杂交，用引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引物，并不断重聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆复该过程便可克隆tRNAtRNA基因基因”。第3页/共63页Kary Mullis(1985)Kary Mullis(1985)发明过程发明过程 Mullis Mullis 在在“偶然想出的聚合酶链反应偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到一文中写到:“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNADNA片片段的方法是在不可想象的情况下，段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在月即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。第4页/共63页专利官司专利官司 19871987年美国专利局专利授权年美国专利局专利授权 19891989年，年，DuPontDuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定异议，大小公司对簿公堂，将决定谁将获得诺贝尔奖。谁将获得诺贝尔奖。DuPontDuPont理由是，理由是，19711971年年PCRPCR的雏的雏形已由形已由KhoranaKhorana一系列文章阐明，并公布于众，应当一系列文章阐明，并公布于众，应当是公共产权。斯坦福大学是公共产权。斯坦福大学KornbergKornberg（研究（研究DNADNA聚合酶聚合酶获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都可以从可以从KhoranaKhorana等的文章中推知如何操作等的文章中推知如何操作PCRPCR。美国专利局驳回美国专利局驳回DuPontDuPont异议，地方法院判属异议，地方法院判属CetusCetusCetusCetus获胜后马上反诉，指出获胜后马上反诉，指出DuPontDuPont已侵犯另一项与已侵犯另一项与 PCRPCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCRPCR有关试剂和仪器。有关试剂和仪器。第5页/共63页PCRPCR发展速度发展速度惊人，没有一种技术能与之相比引用论文最多、应用范围十分广泛1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大籍英国科学家Michael Smith共获。第6页/共63页PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某在一个试管内将所要研究的目的基因或某一一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍万倍,肉眼能直接观察和判断；可从一根毛肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用几星期才能做到的事情，用PCR几小时便几小时便可完成。可完成。PCR技术是生物医学领域中的一技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。项革命性创举和里程碑。第7页/共63页Mullis最初使用的最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌聚合酶是大肠杆菌DNA聚聚合酶合酶I的的Klenow片段片段，其，其缺点缺点是：是：Klenow酶不耐高温酶不耐高温，90会变性失活，每次循会变性失活，每次循环都要重新加。环都要重新加。引物链延伸反应在引物链延伸反应在37下进行下进行，容易发生模板，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，产物特异性较差，合成的合成的DNA片段不均一。此种以片段不均一。此种以Klenow酶催化酶催化的的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于优点，但由于Klenow酶不耐热，在酶不耐热，在DNA模板进模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序技术操作程序添了不少困难。这使得添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。能引起生物医学界的足够重视。第8页/共63页1988年初，年初，Keohanog改用改用T4DNA聚合聚合酶进行酶进行PCR，其扩增的，其扩增的DNA片段很均一，片段很均一，真实性也较高，但每循环一次，仍需加真实性也较高，但每循环一次，仍需加入新酶。入新酶。1988年年Saiki等从温泉中分离的等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热中提取到一种耐热DNA聚合酶。聚合酶。第9页/共63页此酶特点此酶特点：耐高温，在耐高温，在70下反应下反应2h后其残留活性大于原后其残留活性大于原来的来的90%，在，在93下反应下反应2h后其残留活性是原来后其残留活性是原来的的60%，在，在95下反应下反应2h后其残留活性是原来的后其残留活性是原来的40%。在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。后再加新酶。大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高，此酶为效率，因而其灵敏性也大大提高，此酶为TaqDNA多聚酶多聚酶(TaqDNAPolymerase)。第10页/共63页PCR技术的基本原理技术的基本原理其特异性依赖于与靶序列两端互补其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。的寡核苷酸引物。模板模板DNA的变性：的变性：模板模板DNA经加热至经加热至93左右一定时左右一定时间后，使模板间后，使模板DNA双链或经双链或经PCR扩增形成的双链扩增形成的双链DNA解解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；备；模板模板DNA与引物的退火：与引物的退火：模板模板DNA变性成单链后，温变性成单链后，温度降至度降至55左右，引物与模板左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合；单链的互补配对结合；引物的延伸：引物的延伸：DNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqDNA聚合酶聚合酶的作用下，以的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互链互补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需个循环需24min，23h就能将待扩目的基因扩增放大就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。几百万倍。第11页/共63页标准的标准的PCR反应体系：反应体系：10扩增缓冲液扩增缓冲液10ul4种种dNTP混合物混合物各各200umol/L引物引物各各10100pmol模板模板DNA0.12ugTaqDNA聚合酶聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至加双或三蒸水至100ul第12页/共63页PCR反应五要素：参加反应五要素：参加PCR反应的物质反应的物质主要有五种即引物、酶、主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和、模板和Mg2+引物：引物是引物：引物是PCR特异性反应的关键，特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度互补的程度第13页/共63页设计引物应遵循以下原则：引物长度：引物长度：15-30bp，常用为，常用为20bp左右。左右。引物扩增跨度：引物扩增跨度：以以200-500bp为宜，特定条件下为宜，特定条件下可扩增长至可扩增长至10kb的片段。的片段。引物碱基：引物碱基：G+C含量以含量以40-60%为宜，为宜，G+C太少扩太少扩增效果不佳，增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。核苷酸的成串排列。避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体，端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。产生非特异的扩增条带。第14页/共63页设计引物应遵循以下原则：引物引物3端的碱基，特别是最末及倒数第端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致端碱基不配对而导致PCR失败。失败。引物中有或能加上合适的酶切位点，被引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。库的其它序列无明显同源性。第15页/共63页引物量：引物量：每条引物的浓度每条引物的浓度0.11umol或或10100pmol，以最低引物量产生所需要的，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。二聚体的机会。第16页/共63页dNTP的质量与浓度的质量与浓度dNTP的质量与浓度和的质量与浓度和PCR扩增效率有密切扩增效率有密切关系，关系，dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，小量分装，浓度后，小量分装，-20冰冻保存。冰冻保存。多次冻融会使多次冻融会使dNTP降解。在降解。在PCR反应中，反应中，dNTP应为应为50200umol/L，尤其是注意，尤其是注意4种种dNTP的浓度要相等的浓度要相等(等摩尔配制等摩尔配制)，如其，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。浓度过低又会降低引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产物的产量。产量。dNTP能与能与Mg2+结合，使游离的结合，使游离的Mg2+浓度降低。浓度降低。第17页/共63页模板的量与纯度模板的量与纯度，是，是PCR成败与否的关键成败与否的关键环节之一，传统的环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用纯化方法通常采用SDS和蛋白酶和蛋白酶K来消化处理标本。来消化处理标本。第18页/共63页Mg2+浓度浓度Mg2+对对PCR扩增的特异性和产量有显著扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的的影响，在一般的PCR反应中，各种反应中，各种dNTP浓度为浓度为200umol/L时，时，Mg2+浓度浓度为为1.52.0mmol/L为宜。为宜。Mg2+浓度过浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低浓度过低会降低TaqDNA聚合酶的活性，聚合酶的活性，使反应产物减少。使反应产物减少。第19页/共63页变性温度与时间：变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致变性温度低，解链不完全是导致PCR失失败的最主要原因。一般情况下，败的最主要原因。一般情况下，9394lmin足以使模板足以使模板DNA变性，若低于变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。因为高温环境对酶的活性有影响。第20页/共63页退火退火(复性复性)温度与时间：温度与时间：退火温度是影响退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至性后温度快速冷却至4060，可使引物和，可使引物和模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于长度。对于20个核苷酸，个核苷酸，G+C含量约含量约50%的引的引物，物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。为选择最适退火温度的起点较为理想。第21页/共63页引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：的温度：Tm值值(解链温度解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度复性温度=Tm值值-(510)在在Tm值允许范围内，值允许范围内，选择较高的复性温度可选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。，足以使引物与模板之间完全结合。第22页/共63页(c)(c)(b)(b)引物引物引物引物2 2553333335555(d)d)新引物新引物新引物新引物5533靶靶靶靶DNADNA的扩增的扩增的扩增的扩增(a)(a)5533引物引物引物引物1 13 3 553355引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链单位长度的链单位长度的链单位长度的链单位长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链不同长度的链5 5 3 3 3355引物引物引物引物1 1互补链互补链互补链互补链引物引物引物引物2 2互补链互补链互补链互补链目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出）聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图(e)(e)(f)(f)(g)(g)第23页/共63页温度温度温度温度（）时间时间时间时间（minmin）9494727260609494变性变性变性变性（1min1min）60 60 退火退火退火退火（1min1min）72 72 延伸延伸延伸延伸（1.5min1.5min）循环循环循环循环1 1 循环循环循环循环2 2 循环循环循环循环3 3PCRPCRPCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期反应的温度循环周期PCR PCR PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNADNADNA变性、引变性、引变性、引变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是应参数是应参数是应参数是94949494变性变性变性变性1min1min1min1min，60 60 60 60 退火退火退火退火1min1min1min1min，72 72 72 72 延伸延伸延伸延伸1.5min1.5min1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。第24页/共63页proceduresprocedurestemplate(DNA or template(DNA or RNA),RNA),primers,primers,Taq enzyme,Taq enzyme,10PCR buffer,10PCR buffer,MgMg+,+,5mmol/L dNTPs5mmol/L dNTPspre-denaturation-pre-denaturation-denature completelydenature completelyDenaturationDenaturationannealingannealingElongationElongationcycles:25-30cycles:25-30第25页/共63页Taq DNA聚合酶分离:1969年，美国黄石国家公园温泉分子量:94KDa活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg第26页/共63页Taq DNA聚合酶离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。忠实性:没有校正单核苷酸错配功能-致命弱点。一般出错率为210-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。第27页/共63页Taq DNA聚合酶抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS及许多其他化学药剂。内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。保存:在-20至少6个月。第28页/共63页PCR污染及其对策强大扩增能力+检测的敏感性极微量的污染便可导致假阳性污染源的追踪点样器和加样器;离心机;微解剖刀;浓缩用具、真空瓶;电泳装置;紫外灯箱;乙醇或水浴锅;冰箱门把手、实验台面等第29页/共63页污染的预防(1)隔离不同操作区(2)分装试剂(3)改进实验操作(4)专用加样器(5)结果的重演第30页/共63页PCRPCR技术的应用技术的应用第31页/共63页遗传性疾病地中海贫血的基因诊断血友病苯丙酮尿症第32页/共63页传染性疾病传染性疾病肝炎性病肿瘤第33页/共63页法医学法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。第34页/共63页植物遗传育种构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化第35页/共63页畜 牧畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段构建基因图谱检测基因整合与表达：转基因鱼第36页/共63页植物保护杀虫病原微生物的基因型鉴定植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分第37页/共63页其他考古学植物分类学群体生态学第38页/共63页定点突变技术（定点突变技术（site-directedmutagenesis)通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用来研究某个氨所编码的氨基酸序列，常用来研究某个氨基酸对蛋白质的结构、催化活性以及结合基酸对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也用于改造配体能力的影响，也用于改造DNA调控元调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。切位点等。第39页/共63页55333355靶靶靶靶DNADNA片段片段片段片段引物引物引物引物A A5 55 5引物引物引物引物AA3333PCRPCRPCRPCRPCRPCR3 33 35555PCRPCR引物引物引物引物B B引物引物引物引物C C5 55 53333混合混合混合混合,变性变性变性变性,退火退火退火退火5533553333553355+DNADNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶5533335555333355用引物用引物用引物用引物B B和和和和C C作作作作PCRPCRPCRPCRPCRPCR定点诱变定点诱变定点诱变定点诱变2 2、PCRPCR用于基因突变用于基因突变第40页/共63页 逆转录聚合酶链式反应逆转录聚合酶链式反应(RTPCR)第41页/共63页 RT-PCR间接用来扩增从间接用来扩增从RNA分子得到的分子得到的一段特异序列。一段特异序列。RNA首先被逆转录为首先被逆转录为cDNA。用位于一段特异序列或者一个基因。用位于一段特异序列或者一个基因两侧的引物生成以两侧的引物生成以cDNA为模板的为模板的PCR产产物成为一个标准的物成为一个标准的PCR反应。得到阳性产反应。得到阳性产物说明存在着特异的物说明存在着特异的RNA序列序列。第42页/共63页对于一个成功的对于一个成功的PCR反应来说，寡聚核反应来说，寡聚核苷酸引物是最重要的组分。引物的长度苷酸引物是最重要的组分。引物的长度范围通常在范围通常在18至至25个核苷酸之间。用常个核苷酸之间。用常规条件扩增的规条件扩增的PCR产物的长度范围为产物的长度范围为1001000bp。第43页/共63页实时定量PCRReal-time Quantity PCR第44页/共63页定量定量PCR是在是在PCR定性技术基础上发展起定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技技术是一种在术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团反应体系中加入荧光基团利用荧光信号积累实时监测整个利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板模板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠的定量而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点无污染性、具实时性和准确性等特点。第45页/共63页作用原理作用原理实时荧光定量实时荧光定量PCR常用的检测模式五种：常用的检测模式五种：（1）TaqMan探针探针（2）SYBRGreen（3）LUX引物引物（4）Molecularbeacon（5）荧光谐震能量传递（）荧光谐震能量传递（FRET,Rocheproduct）第46页/共63页TaqMan探针方法的作用原理探针方法的作用原理:原理：原理：利用利用Taq酶的酶的53外切核酸酶活性外切核酸酶活性并在并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记过程中反应体系加入一个荧光标记探针。探针。TaqMan探针探针5端标以荧光端标以荧光发射基团发射基团，3端标以荧光端标以荧光猝灭基团猝灭基团。该探针在。该探针在PCR过程中过程中不能被延伸。当探针保持完整时，不能被延伸。当探针保持完整时，3端猝灭端猝灭基团抑制基团抑制5发射基团的荧光发射。发射基团的荧光发射。第47页/共63页在在PCR的的退火期退火期，探针与引物所包含序列，探针与引物所包含序列内的内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引模板发生特异性杂交。延伸期引物在物在Taq酶作用下沿酶作用下沿DNA模板延伸，当到模板延伸，当到达探针处，达探针处，Taq酶发挥酶发挥53外切核酸酶活外切核酸酶活性，继而发生置换，切断探针后，发射基性，继而发生置换，切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度增这时荧光探测系统便会检测到光密度增加。模板每复制一次，就有一个探针被切加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，伴有一个荧光信号的释放。断，伴有一个荧光信号的释放。第48页/共63页由于被释放的荧光基团数目和由于被释放的荧光基团数目和PCR产物产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板准确定量。由于扩增产物短时术可对模板准确定量。由于扩增产物短时效率较高，故扩增长度一般为效率较高，故扩增长度一般为50150bp。第49页/共63页实时实时PCRPCR技术原理技术原理第50页/共63页探针设计一般应符合以下条件：探针设计一般应符合以下条件：(1)GC(1)GC碱基含量在碱基含量在40%-60%40%-60%。（2 2）避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G G。（3 3）避免）避免55端为端为G G，因为因为G G对荧光可能有抑制作用，对荧光可能有抑制作用，尽量使尽量使C C个数多于个数多于G G。（4 4）长度应在）长度应在15-2515-25个碱基左右，以保证结合的个碱基左右，以保证结合的特异性。特异性。（5 5）探针的）探针的TmTm值要比引物的值要比引物的TmTm值至少高出约值至少高出约1010另外，探针与引物不能形成二聚体，另外，探针与引物不能形成二聚体，位置与上游引位置与上游引物尽量接近但不要重叠。物尽量接近但不要重叠。第51页/共63页(2)SYBRGreenI荧光染料的原理荧光染料的原理SYBRGreenI是一种只与双链是一种只与双链DNA小沟结小沟结合的染料，当它与合的染料，当它与DNA双链结合时，发出双链结合时，发出荧光；从荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信号强度代表了双链号强度代表了双链DNA分子的数量。它的分子的数量。它的缺点是在于能与非特异性双链缺点是在于能与非特异性双链DNA（如引（如引物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能通过熔解曲线分析得到解决。通过熔解曲线分析得到解决。第52页/共63页第53页/共63页(3)LUX引物引物LUX引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物，新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一个引物引物3端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对，发夹结构打开，产生荧光信号。使用夹结构打开，产生荧光信号。使用LUX引物，不需引物，不需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供了宽松的条件。宽松的条件。第54页/共63页图.LUX引物工作原理第55页/共63页Lux引物引物第56页/共63页LUXTM 技术的优势1.通过 methode设计适合客户的实验的LUXTM Primer。2.购买已经验证，即用的LUXTM Primer这些引物只适合看家基因（40）和人类基因。3.通过和Invittrogen Custom LUXTM Primer服务中心联系，由专家给您设计适合您实验的新的引物。第57页/共63页分子标记（分子标记（Molecularmarker）第58页/共63页优点优点数量丰富、信息量大；数量丰富、信息量大；与生长发育无关，取材不受限制；与生长发育无关，取材不受限制；较多共显性，信息量完整较多共显性，信息量完整在真核生物中，基因组在真核生物中，基因组DNADNA多态性要远远多多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的存在着大量的不编码的DNADNA序列，它们的变序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约异不受或较少地受自然选择的制约第59页/共63页Applications种质资源研究种质资源研究品质纯度鉴定（包括品质纯度鉴定（包括DNADNA指纹鉴定）指纹鉴定）构建遗传连锁图构建遗传连锁图基因定位（基因定位（QTLQTL）标记辅助选择标记辅助选择比较基因组研究比较基因组研究基因克隆（图位克隆）基因克隆（图位克隆）生物起源、进化、医学及法医学生物起源、进化、医学及法医学第60页/共63页RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymorphism)by Botstein(1980)基本原理：基本原理：物种的基因组物种的基因组DNADNA在限制性在限制性内切酶内切酶作用下，作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的的DNADNA作作探针探针，把与被标记，把与被标记DNADNA相关的片段检测出来，相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。从而构建出多态性图谱。优点优点:共显性，非常稳定共显性，非常稳定缺点：缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱；检测步骤多，周期长，费时、费钱；用作探针的用作探针的DNADNA克隆制备、保存不方便；克隆制备、保存不方便；放射性同位素放射性同位素 自从人的自从人的RFLPRFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLPRFLP图谱。图谱。第61页/共63页RAPD(Random Amplified Polymorphism DNA)1990:Williams(DuPont)：RAPD;Welsh(Cal.BiologyInst.)：AP-PCR(ArbitraryPrimer-PCR)=Random Primer-PCR=Oligo Primer-PCR=SODA(Small Oligo DNA Analysis）RapidandsimpleRandomprimer:9-10bp第62页/共63页与常规与常规PCRPCR的不同的不同A.引物长度短常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。B.退火温度低RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37。第63页/共63页