RNA的生物合成转录后加工和调节.pptx

暨南大学药学院1内容第四篇 遗传信息的储存、传递和调控16章章 DNA的复制及的复制及损伤修复修复17章章 RNA的生物合成、的生物合成、转录后加工和后加工和调节18章章 蛋白蛋白质的生物合成及其加工修的生物合成及其加工修饰19章章 基因表达的基因表达的调控控20章章 重重组DNA技技术21章章 基因基因诊断与基因治断与基因治疗暨南大学药学院217章 RNA的生物合成、转录后加工和调节暨南大学药学院3第一节 基因转录的基本性质n转录是以DNA单链为模板，NTP为原料，在DNA依赖的RNA聚合酶催化下合成RNA链的过程。nDNA上的转录区域称为转录单位位 n转录是基因表达的第一阶段也是基因调节的主要阶段。暨南大学药学院4转录与复制的异同相同相同差异差异转录转录复制复制模版模版DNA一条链一条链2条条原料原料核苷三磷酸核苷三磷酸NTPdNTP碱基配对碱基配对遵从碱基配对遵从碱基配对A-U,G-C,T-A聚合酶聚合酶依赖依赖DNA的酶的酶RNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶产物产物多核苷酸链多核苷酸链RNA双链双链DNA特点特点不对称转录不对称转录半保留半不半保留半不连续连续暨南大学药学院5结构基因构基因 DNA分子中编码RNA的区段模板模板链 Watson W链 负链编码链 Crick C链 正链不不对称称转录 不同基因的模板链核编码链并不是固定在某一条链上。暨南大学药学院6RNA聚合聚合酶特点特点：以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物；以DNA为模板；按53方向合成；无需引物的存在能单独起始链的合成；合成时，第一个引入的NTP是以三磷酸形式存在；在体内DNA双链中仅一条链作为转录的模板；RNA的序列和模板是互补的；RNA聚合酶无校正能力。原核生物的RNA聚合酶细菌中只有一种真核生物的RNA聚合酶真核生物有三类不同的第二节 RNA聚合酶暨南大学药学院7RNA的酶促合成暨南大学药学院8一、原核生物的RNA聚合酶大肠杆菌RNA聚合酶的组成450kd，5个亚基2个Alpha亚基参与全酶的组装及识别启动子亚基与NTP及新生链结合亚基与模板DNA结合亚基辨认转录起始点，延伸阶段与核心酶分离，一种转录辅助因子暨南大学药学院9因子原核只有一种RNA聚合酶，但有多种因子在不同的条件下被表达，并与相应启动子结合基因启动子35和10区的保守序列是其识别位点暨南大学药学院10RNA polymerase in prok.Core EnzymeHolo Enzyme for elongationfor initiation依靠静电作用力依靠静电作用力依靠空间结构依靠空间结构非专一性与非专一性与DNA 结合结合专一性与专一性与 DNA结合结合结合常数；结合常数；1011/mol结合常数；结合常数；1014/mol半衰期；半衰期；60衰期；数小时衰期；数小时cover60bp 暨南大学药学院11基因 产物 功能E.coli RNA Pol 的结构和功能rpoA 2 亚基(每个40kD)酶的连接，装配启动子的识别结合某些活化因子rpoB 亚基(160kD)rpoC 亚基(160kD)rpoD 亚基(3290kD)和底物结合 催化核心和模板结合和启动子结合识别模板链暨南大学药学院12原核生物原核生物RNApol(Core)的结构与功能的结构与功能Enzyme MovementDNA coding strand()Rewinding point()Unwinding point()RNA binding site RNA/DNA hybrid()DNA template strand Holo Enzyme 使使 DNA 形成形成10-17bp的解链区的解链区 暨南大学药学院13RNA 聚合酶需执行多功能：识别DNA双链上的启动子；使DNA在启动子处解链成单链；通过阅读启动子序列，RNA聚合酶确定它自己的转录方向和模板链；最后当它达到终止子时，通过识别停止转录 暨南大学药学院14二、真核生物的RNA聚合酶已发现有3种对抑制剂鹅膏覃碱的敏感性有差异转录产物不同暨南大学药学院15转录何处开始？启动子DNA模板上被RNA聚合酶识别并结合形成转录起始复合物的区段。原核生物启动子真核生物启动子第三节 与转录有关的DNA结构暨南大学药学院16一、原核生物启动子研究方法研究方法 足迹法足迹法p340起始点起始点 A or G10区区 一致序列TATAAT pribnow box35区区 一致序列TTGACA 因子识别位点，全酶结合于此，Sextama box1035区区间隔序列隔序列 长短比序列重要暨南大学药学院17大肠杆菌启动子的保守序列暨南大学药学院18RNA聚合酶I 的启动子rRNA 45s RNA，再加工成5.8s,18s,28s rRNA，启动子由核心启动子和上游的调控元件组成二、真核生物启动子暨南大学药学院19RNA聚合酶II 的启动子有有有有3 3处顺处顺式作用元件式作用元件式作用元件式作用元件90的GC盒，70的CAAT盒，30处的TATA盒转录转录起点起点起点起点与原核生物相似，大多为A或GmRNA，种种类繁繁杂，启动子多样性，还发现其其它的相关元件它的相关元件。各种元件有不同的组合。II是最活跃的聚合酶。暨南大学药学院20真核RNA聚合酶II启动子和增强子通过蛋白质的介导互相结合，形成环，启动转录暨南大学药学院21真核启动子含有的各种元件和分布暨南大学药学院22RNA聚合酶III的启动子催化snRNA,tRNA,5S RNA的转录需要其它辅助因子共同作用snRNA启动子与蛋白质基因启动子相似tRNA,5S RNA内部启动子暨南大学药学院23真核RNA启动子的基因内启动子和基因外启动子暨南大学药学院24真核启动子不同于原核的特点有多种元件；结构不恒定；它们的位置、基序、距离和方向都不完全相同；有的有远距离的调控元件存在，如增强子、沉默子等；这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作用；不直接和不直接和RNA Pol结合合。暨南大学药学院25转录的起始转录的延伸转录的终止第四节 转录过程暨南大学药学院26转录的起始原核生物转录的起始真核生物转录的起始暨南大学药学院27原核生物的转录起始1.核心核心核心核心酶酶在 因子因子因子因子的参与下与模板的DNA接触，生成非专一的，不稳定的复合物在模板上移动；2.起始起始起始起始识别识别：全酶与模板的启动子结合，产生封闭的“酶-启启动子二元复合物子二元复合物”（closed binary complex）；3.酶紧密地结合在启动子的-10序列处，模板DNA局部变性，形成“开放的启开放的启开放的启开放的启动动子二元复合体子二元复合体子二元复合体子二元复合体”（open binary complex）；4.酶移动到转录起始点上，第一个rNTP转录开始，因子释放，形成酶-启启动子子-rNTP三元复合体三元复合体。暨南大学药学院28E.coli转录的起始暨南大学药学院29真核生物的转录起始每种RNA聚合酶都需要一些蛋白质辅助因子，即转录因子，transcription factor（I,II,III类分别对应于聚合酶）转录起始RNA聚合酶I催化的RNA聚合酶II催化的RNA聚合酶III催化的暨南大学药学院30RNA聚合酶I催化的起始转录起始点上游有2个顺式作用元件，核心核心元件元件core element和上游和上游调控元件控元件UCE。RNA聚合酶I催化的转录需要2种转录因子，上游上游结合因子合因子UBF和和选择性因子性因子1，SL1。SL1有4个亚基，一个一个是TATA盒盒结合蛋白合蛋白TBP,另3个个是TBP相关因子TAF。暨南大学药学院31p342UBF和UCE结合令DNA发生弯曲，使相距上百bp的UCE 和核心元件靠拢，接着SL1和polI相继结合到UBF-DNA复合物上，完成复合物的组建，开始转录。暨南大学药学院32 Pre-rRNA Allows RNApol binding complex to initiate RNApol 暨南大学药学院33RNA聚合酶II催化的起始转录因子因子：需要较多的转录因子参与转录起始复合物的起始复合物的组装装：TFII-D与TATA盒结合，如无如无如无如无TFII-ATFII-A的存在，的存在，的存在，的存在，TFII-DTFII-D启启启启动动子复合物与抑子复合物与抑子复合物与抑子复合物与抑制因子制因子制因子制因子结结合合合合。TFII-A存在时与TFII-D结合成D-A复合物，防止复合物与抑制因子的结合，继而与TFII-B结合。聚合聚合酶酶与与TFII-FTFII-F先形成复合物后再先形成复合物后再结结合到合到DNADNA上上，此时不能启动转录，必须TFII-E和TFII-H/TFII-J的参与。TFII-HTFII-H是最后加入的因是最后加入的因是最后加入的因是最后加入的因子，有解旋子，有解旋子，有解旋子，有解旋酶酶的活性的活性的活性的活性，使起始部位DNA解链。TFII-HTFII-H还有蛋白激酶活性，使使使使pol IICpol IIC端多个端多个端多个端多个丝丝氨氨氨氨酸残基磷酸化酸残基磷酸化酸残基磷酸化酸残基磷酸化，这是聚合酶离开起始点继续转录的重要因素。暨南大学药学院34真核生物的转录RNA Pol 的转录起始暨南大学药学院35RNA Pol 的转录起始暨南大学药学院36TATA +1 Wilds minor groove TFII A TBP of D pre-TIC TFII F RNApol IITFII B Basic TIC conclusion暨南大学药学院37mRNA Promoter clearance Transcription startingEHJE H B D AJ暨南大学药学院38RNA聚合酶III催化的起始需要3个蛋白质因子TFIII-A,B,C。tRNA基因基因转录的起始的起始：在DNA上的调控序列位于起始转录位点的下游，称为内部启动子。有2个调控区，A盒和B盒。5s RNA基因基因转录的起始的起始：除了TFIII-B,C外，还需要TFIII-A，首先TFIII-A结合到下游C盒，然后TFIII-C结合到A盒和B盒，继而是类似tRNA的转录暨南大学药学院39TFIII C+1 A box B box tDNA TFIIIB TBPBRFB暨南大学药学院40TFIIIB allows RNApol III to bindand initiate transcription tRNA RNApolIII+1暨南大学药学院41 RNApolIIITFIIIC TFIIIA +1 A box C box TFIIIB rRNA 5s pre-rRNA transcription暨南大学药学院42转录的延伸延伸阶段，原核和真核比较相近。聚合酶如何向转录起始点下游移动？转录区的模板如何形成局部单链区？暨南大学药学院43原核生物的延伸原核生物的延伸：核苷酸链中的的一个磷酸二酯键形成后，因子从全酶中解离出来，核心酶沿DNA分子移动。真核生物真核生物：RNA聚合酶需要较多的转录因子，起始后酶的移动也靠多种转录因子的共同作用使酶的构象发生改变来实现，如在TFII-H的作用下，polII C端端丝氨酸的磷氨酸的磷酸化酸化是向下游移动的重要因素。暨南大学药学院44转录的延伸延伸时RNA 聚合酶以稳定收缩和突然伸展的方式在DNA上“爬行”，稳定的收缩是指RNA聚合酶从35bp长连续地收缩到28bp，然后前端又突然向前伸展8bp,RNA聚合酶又恢复到35 bp长。暨南大学药学院45转录泡p345在转录延伸的过程中，DNA双链需要解开1020bp，形成的局部单链区象一个小泡为了保持局部的转录泡状态，在RNA聚合酶下游的DNA需要不断的解链，可使其下其下游的游的DNA越缠越紧，形成正超螺旋形成正超螺旋，而其上游的上游的DNA链变得松弛，产生负超螺旋超螺旋。解旋酶和拓扑酶可以消除这些螺旋暨南大学药学院46第一个磷酸二酯键的形成是由第一个核苷酸的3OH与第二个核苷酸的5磷酸之间脱水形成的。第一个核苷酸的第一个核苷酸的5三磷酸保留三磷酸保留在转录局部形成的RNA:DNA杂合双链之间的力比DNA双链的弱，存在存在A:U配配对，延长中的RNA链的5端会被重新形成的DNA双链挤出，使合成中的RNA链的5端游离端游离于于转录复合物复合物。暨南大学药学院47转录的终止生物转录的终止处有特殊结构的存在，称为终止止子子 在原核细胞中有两种不同的终止子，一种是强终止子止子，另一种是弱弱弱弱终终止子止子止子止子。强终止子在体外实验中，无需其他任何因子的帮助就可以终止核心酶，这种终止子被称为内部内部内部内部终终止子止子止子止子（intrinsic terminators）。弱终止子需要在一种蛋白质因子（rho factor）的帮助一才能终止，所以又称为依依赖性性终止子止子（Rho-dependent terminator）暨南大学药学院48强终止子的结构强终止子的结构有三个特点：有回文有回文结构存在结构存在。由它转录出mRNA可形成茎环结构，可阻止RNA 聚合酶的前进；茎的区域富内含茎的区域富内含G-C，使茎环不易解开，使茎环不易解开；强终止子强终止子3端上有端上有6个个U，由于它和模板形成的连续U-A配对较易打开，从而便于释放出RNA。暨南大学药学院49弱终止子的结构它也可形成茎环结构，但在茎中的茎中的G.C含量少含量少，茎环易打开。在其其3端也没有端也没有寡聚寡聚U，因此RNA 聚合酶合成此段RNA后，由于茎环的存在可使聚合酶暂停一下，若此时因子因子追上来和聚合酶结合，那么转录即可终止，若无因子聚合酶还可越过终止进行“通读”。暨南大学药学院50RNA聚合酶转录mRNA因 子 附 着 到mRNA识 别 位点因子在RNA聚合 酶 后 面 沿mRNA移动RNA聚合酶在终止位点停留，因子赶上了聚合酶在转录泡中因子解开DNA-RNA杂合链终止RNA聚合酶，因子和RNA被释放在原核mRNA转录中依赖性终止机制暨南大学药学院51依赖性终止子，其共同特点是C丰富，G缺乏暨南大学药学院52RNA聚合酶转录 出 mRNA后核糖体结合到mRNA上核糖体在突变位点解离因 子 追 上 了RNA聚合酶转录提前终止无义突变时因子可能使转录提前终止暨南大学药学院53原核转录的过程暨南大学药学院54真核生物转录的终止机制了解不多，且3种聚合酶的转录终止不完全相同。RNA聚合聚合酶I催化的转录有18bp的终止子序列，可被辅助因子识别。RNA聚合聚合酶II和和III催化催化转录的的终止子止子，可能有与原核生物不依赖因子的终止子相似的结构和终止机制，即有GCGC的茎的茎的茎的茎环结环结构构构构和和和和连续连续的的的的U U。由于成熟的mRNA3端已被切除了一段，并加入了polyA尾巴，具体的转录终止点目前尚未认识。暨南大学药学院55真核生物的转录终止爪蟾rDNA的转录终止位点真核生物的RNA大部分都要经过加工，包括剪切和加上poly(A)，因此对于其终止的情况了解因此对于其终止的情况了解很少，只有少数的例子搞得比较清楚很少，只有少数的例子搞得比较清楚。前体RNA转录的终止是随着组织的变化而变化。例如在爪蟾中有两个重要的转录终止位点：T2和T3。T2是28SrRNA序列3末端下游约235bp序列。T3是排列在下一个转录单位的上游约200bp处。T2和T3都含有7个碱基的保守序列：5-GACTTGC-3。T2是前体rRNA转录的初始终止位点。T3是作为是作为“失败失败-保险保险”的终止位的终止位点点，由于rDNA转录单位是串联排列的，所以“失败-保险”终止系统让RNA Pol分子可能在一个转录单位上起始和转录。暨南大学药学院56第五节 RNA转录后加工原核生物RNA转录后的加工mRNA转录后的加工rRNA转录后的加工tRNA转录后的加工真核生物RNA转录后的加工rRNA转录后的加工tRNA转录后的加工mRNA转录后的加工暨南大学药学院57原核生物RNA转录后的加工mRNA的加工的加工：mRNA转录产物，一般无需加工即具有活性，可作为翻译的模板。但近年也发现要添加3polyA的现象。tRNA,rRNA的加工修饰较多。rRNA的加工的加工：rRNA基因常与一些tRNA基因混合组成一个操纵子，呈有序排列。RNA酶III对其转录产物进行切割，其产物还需再加工才成为成熟的rRNA，具体机制不明。暨南大学药学院58原核生物RNA转录后的加工tRNA的加工的加工：原核生物tRNA的初始转录产物有几种形式，1、与rRNA相连；2、相同的几个拷贝连在一起；3、不相同的几个连在一起。要经过多个加工程序才能成为成熟的tRNA。参与tRNA加工的酶类有多种包括：RNA酶III，RNA酶D，RNA酶P，tRNA核苷酸转移酶暨南大学药学院59真核生物RNA转录后的加工rRNA的加工的加工：有5s，5.8s，18s，28s四种，其中5.8s，18s，28s 是由RNA聚合酶I催化一个转录单位（中度重复序列），产生45s rRNA前体，rRNA转录后加工包括前体rRNA与蛋白质结合，然后再切割和甲基化。转录在核仁进行，新生的前体迅速与蛋白质结合成前体核糖体颗粒，然后，其中的RNA经一系列切割先产生18s rRNA，该RNA与蛋白质组成核糖体的小亚基。余下的部分再拼接成5.8S,28S rRNA。前体rRNA的切割在特殊序列位点，可能是由核仁小RNA(snoRNA)催化。前体前体rRNA还接受蛋氨酸提供的甲基还接受蛋氨酸提供的甲基被甲基化被甲基化，在切割加工后，甲基化仍保留，甲基化的位点在脊椎动物中是高度保守的。5sRNA 在核质中转录无需加工在核质中转录无需加工进入核仁与28s，5.8s rRNA及蛋白质一起组成核糖体的大亚基，以大亚基的形式通过核孔进入胞浆。暨南大学药学院60真核生物RNA转录后的加工tRNA的加工的加工：包括切除和碱基修切除和碱基修饰，有些需要剪接。所有所有tRNA5端比成熟端比成熟tRNA多多一段序列，由一段序列，由RNaseP切除切除。有些tRNA基因在反密码环处含有内含子，剪接加工与前体mRNA的加工有所不同：在内含子两端切割去除内含子后将外显子连接，没有转酯反应。暨南大学药学院61真核生物mRNA转录后加工RNA聚合酶II催化转录，初始产物为核不核不均一均一RNA(hnRNA)，新生的hnRNA从开始形成到转录终止，就逐步与蛋白质形成不均一核糖核蛋白不均一核糖核蛋白颗粒粒，前体mRNA加工的顺序是形成5帽子结构、内切酶去除3端序列、polyA聚合酶催化形成尾巴；剪接取出内含子变成成熟的mRNA暨南大学药学院625帽的形成P348经鸟苷酰转移酶催化与另一个经鸟苷酰转移酶催化与另一个GTP作用作用在鸟嘌呤在鸟嘌呤7甲基转移酶作用下，以甲基转移酶作用下，以S-腺腺苷蛋氨酸为甲基来源苷蛋氨酸为甲基来源再经再经2甲基转移酶催化甲基转移酶催化5帽子的类型帽子的类型暨南大学药学院63前mRNA3端切除及加polyA尾除组蛋白的mRNA外，真核生物所有的mRNA都有3polyA尾。polyA上游上游1035bp有有AAUAAA序列序列，下游约下游约50bp有富含有富含GU序列序列，这这2处序列是剪切和加尾所需的处序列是剪切和加尾所需的信号信号。暨南大学药学院64mRNA的剪接剪接splicing几乎所有真核生物的核前体mRNA都有特征的GU/AG序列，称为GU-AG规则。内含子离3剪切点2050bp范围内有一个A也是不变的，称为分支点分支点。分支点附近也有保守序列。暨南大学药学院65剪接过程p350由核小RNA与蛋白质组成的核小核糖核蛋白与内含子结合，通过snRNA中的U1snRNA与5剪接点互补结合，U2snRNA与内含子分支点序列互补，以及snRNP之间的相互作用，内含子折叠，使内含子两侧的外显子靠近，利于剪接反应的进行。剪接反应通过2次转酯，释放出套索状套索状结构构的第一内含子。暨南大学药学院66核mRNA从核内转运至胞浆mRNA在胞浆中的定位胞浆中mRNA的稳定性第六节 mRNA的转运及其在胞浆中的定位、稳定性暨南大学药学院67核mRNA从核内转运至胞浆前体mRNA（hnRNA）的加工在核内特定加工在核内特定的的亚核核结构（核基构（核基质）中）中进行行。随着新合成的mRNA链延长，不断有hnRNP结合到链上，同时形成剪接体。加工成熟后，去除剪接的蛋白质，但有不少蛋白质结合，形成信使核糖核蛋白信使核糖核蛋白mRNP，成熟成熟mRNA以以mRNP的形式从的形式从细胞核内通胞核内通过核核孔孔进入胞入胞浆。mRNPs在核内呈在核内呈盘绕状状，当它通过核孔时就呈非盘绕状。暨南大学药学院68核mRNA从核内转运至胞浆mRNA的的5端起端起导引作用引作用，进入胞浆后即与核糖体结合，牵制住mRNA。5端帽子端帽子结构构在在mRNA从核内从核内转运至胞运至胞浆过程的程的作用是作用是被被转运机制运机制识别。mRNP进入胞浆后，与与与与mRNAmRNA结结合的蛋白合的蛋白合的蛋白合的蛋白质质会会会会发发生更生更生更生更换换，从核内随mRNA转运至胞浆的hnRNP的蛋白质组分解离，重新进入细胞核。组成mRNP的蛋白质组分结合到mRNA链上，特别是在3polyA结合蛋白（PABP），PABP与核内结合在polyA上的结合蛋白（PABPII）是不同的蛋白质。mRNP中蛋白蛋白质与与RNA的比例的比例比hnRNP中的少。暨南大学药学院69mRNA在胞浆中的定位胞浆中的mRNA和核糖体一起与粗面内质网的膜紧密结合。结合在mRNA3polyA的PABP又与肌动蛋白微丝组成的细胞骨架结合。某些mRNA3非翻非翻译区有特殊序列区有特殊序列指引指引mRNA在在细胞胞质中的位置中的位置。机制不清楚。暨南大学药学院70胞浆中mRNA的稳定性不同的不同的不同的不同的mRNAmRNA稳稳定性相差定性相差定性相差定性相差悬悬殊殊殊殊根据功能不同而有所差异，真核生物多数mRNA半衰期可达数小时，调节因子的mRNA只需短时表达，半衰期较短。mRNA的33端非翻端非翻端非翻端非翻译译区的区的区的区的AUUUAAUUUA重复序列重复序列重复序列重复序列是不稳定因素。许多半衰期短的mRNA含有这类序列。mRNA的降解是可以的降解是可以调控的。控的。转铁蛋白受体mRNA的稳定性调节，与其非翻译区铁应答元件IRE重复序列有关。暨南大学药学院71思 考 题RNA有很多种，它们分别由哪一种RNA聚合酶催化合成？和因子在转录过程中的作用是什么？homework不同RNA聚合酶的启动子有什么特征？RNA聚合酶II催化的转录起始有何特点？homework真核生物RNA转录后加工的内容是什么？真核生物内含子是如何剪接的？核RNA如何转运至胞浆？homework暨南大学药学院72