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作物无性繁殖课程结业论文

中国马铃薯组织和细胞培养研究进展

学生姓名王佳
所在学院应用技术学院
班级07农学
学号 410

中国·大庆
二〇一〇年·十一月

中国马铃薯组织和细胞培养研究进展
摘要: 简述了近20年来, 中国马铃薯组织和细胞培养, 包括茎尖、 花药、 花粉、 胚、 子房、 胚乳、 叶片、 茎段、 块茎、 原生质体、 悬乳细胞等多种外植体培养以及离体块茎生产种质离体保存取得的重要进展, 讨论了马铃薯组织和细胞培养的应用前景及存在问题。
关键词: 马铃薯;组织培养;细胞培养;离体块茎生产;种质离体保存
马铃薯(SolanumtuberosumL.)属茄科茄属双子叶植物, 栽培马铃薯为同源四倍体无性繁殖作物。马铃薯是植物组织和细胞培养的模式作物之一, 其组织和细胞培养技术已相当完善, 而且在试管苗快繁和脱毒种薯的生产上已取得了巨大的经济效益。近20年来, 中国在马铃薯组织和细胞培养方面也取得了不少研究成果。本文将简要的介绍中国在这方面的研究进展, 并结合我们自己的一些研究成果作一评述。
1.茎尖培养
茎尖培养又叫分生组织培养, 是包括马铃薯在内的许多植物脱除病毒的重要手段。现在, 世界上所有生产马铃薯的主要国家, 在生产中都使用这一技术。中国于70年代初, 由吉林农业大学、 辽宁省农科院和黑龙江省克山农科所对茎尖组织培养进行了初步试验, 取得了一定进展。
影响马铃薯茎尖培养产生无病毒植株的因素主要有茎尖大小、 培养基、 培养条件和病毒的种类。一般茎尖越小, 脱毒效果越好, 但不容易成活。合适的离体茎尖应该是带1—2个叶原基的马铃薯生长点。中国学者培养马铃薯茎尖主要采用革新培养基和Ms培养基。马铃薯茎尖培养脱毒从易到难的顺序如下:马铃薯卷叶病毒(PLRV)、 马铃薯A病毒(PVA)、 马铃薯Y病毒(PVY)、 马铃薯奥古巴花叶病毒(PAMV)、 马铃薯M病毒(PVM)、 马铃薯X病毒(PVX)、 马铃薯S病毒(PVS)和马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTV)。此顺序也不是绝正确, 会因品种、 培养条件、 病毒的不同株系等而有所变化。中国科学院遗传研究以Ms附加0.8mg/LGA3培养基培养2个马铃薯早熟品种”男爵”和”红纹白”的茎尖生长点发育成了植株。黄楚材等(1980)[1]以MA培养基培养马铃薯茎尖, 经3个多月的离体培养长成带根小苗, 用X、 Y血清鉴定, 在129株中获得无X、 Y病毒的马铃薯品种”双季1号”小苗27株。林长春等(1959)[2]采用MA附加0.1—0.5g/LBAp、 05mg/LGA3、 0.01mg/LNAA培养基培养马铃薯茎尖, 生产出无PVX、 PVY等5种病毒10个品种的试管苗67株, 另外还有500个品种(系)获得了试管苗。
2.器官培养
2.1花药和花粉培养
马铃薯普通栽培种为同源四倍体, 其遗传分复杂。经过花药和芬粉培养:①能够在短期内获纯合四倍体材料;②利用单倍体和双单倍体可使隐性基因得以表示, 从而提高选择效率;③双单倍体容易和二倍体野种杂交, 从而能够有效的利用野生种质;④经过纯系间杂交或与2n配子材料杂交, 可获得性状整齐一致的后代, 为选育不分离的实生种子提供优良亲本。因此, 该项技术在马铃薯的遗传育种研究中具有重要的理论与实践意义。中国学者曾在马铃薯花药培养方面进行了广泛的研究, 取得了许多重要的理论与实践成果。朱明凯等(1985)[3]以MS附加0.5rng/LKT和lmg/L2,4-D培养早熟四倍体栽培种的花药发现, 以胚状体诱导成苗比愈伤组织诱导成苗率高, 从愈伤组织分化出的苗有混倍体(2n=28, 32)、 双单倍体(2n=24)和四倍体(2n=48), 而从胚状体诱导成苗均为双单倍体(2n=24)。在马铃薯花药培养中, 低湿预处理、 高温前处理、 培养基中添加50umol/LAgNO3, 均可提高花药培养再生植株的频率。中国马铃薯花药培养的研究, 大多数都是由普通四倍体栽培种诱导双单倍体植株, 也有一些由双单倍体植株和二倍体野生种诱导单倍体植株的报道。关于马铃薯花粉培养, 在中国研究者甚少, 左秋仙等(1990)[4]采用液体浅层培养法培养四倍体栽培种的花粉仅得到了愈伤组织, 而未获得再生植株。
2.2胚培养
在庞大的马铃薯家族中, 由于种间杂交形成的杂种胚乳发育不良或胚乳之间的不亲和性, 致使胚在早期败育, 因而难以将野生种和近缘栽培种的优良基因转移到普通栽培种中。采用胚培养技术能够克服上述困难, 从而获得种间或属间杂种, 而且还能够打破种子休眠, 缩短育种年限。王蒂等(1991)[5]的研究结果表明, 杂交后10d以上的幼胚才能形成完整植株, 培养早期暗处理25d和高浓度蔗糖(80g/L)有助于幼胚发育成植株, 成熟胚对光照和蔗糖浓度的选择性降低。
2.3子房培养
对于用花药培养难以成功或诱导率极低的马铃薯品种(系), 末授粉子房培养是获得单倍体植株的一条重要途径。对雄性不育的品种或因环境因素影响而不能开花的品种(系), 经过子房培养也可诱导单倍体植株。另外, 离体子房培养对于阐明果实的形态发生、 生理生化等过程提供了一个很好的实验系统。因此, 离体子房培养在植物体细胞遗传学中具有重要的意义。当前, 同花药培养相比, 马铃薯子房培养离实际应用尚有较大的距离, 有待从培养技术上进一步深人研究。陶自荣等(1988)[6]以Ms附加一定激素的培养基培养未授粉的四倍体栽培种马铃薯子房, 从”乌盟601”和”中心24”两个品种获得了绿色小植株, 其绿苗诱导率分别为3.3%和2.8%, 经根尖细胞学检查获得的植株为双单倍体。
2.4胚乳培养
胚乳是胚发育过程中提供养料来源的主要场所, 胚乳组织还是一团匀质的薄壁细胞, 没有任何器官发生和维管分化。另外, 胚乳像胚一样也是杂交组织, 但其倍性不同于胚。因此, 经过胚乳培养又可能得到倍性不同的植株, 从而应用于马铃薯染色体工程的研究中。另外, 经过胚乳培养能够研究某些天然产物的生物合成。刘淑琼等(1981)[7]以MS附2.0mg/LNAA、 0.lmg/LBAP、 500mg/LCH和5%蔗糖的培养基上培养马铃薯品种”上海72332”的胚乳, 其愈伤组织的诱导频率为12.6%, 将愈伤组织转移到分化培养基上, 个别胚乳愈伤组织分化出了芽和小植株。研究结果认为, 在马铃薯未成熟胚乳培养中, 胚乳愈伤组织的诱导不需要胚参加, 低浓度的赤霉素(0.lmol/L)有益于马铃薯胚乳愈伤组织分化芽和小植株。
2.5叶片、 茎段、 块茎等组织的培养
中国学者从马铃薯幼茎切段、 幼芽、 叶肉细胞、 、 叶片、 块茎盘等许多种外植体培养还获得了再生植株。韩善华等(1982)[8]的研究结果表明, 在幼茎切段培养中, 生长素2, 4-D诱导愈伤组织的效果最好, 当其浓度为2mg/L时, 诱导频率可这97.8%。在苗的分化中, 细胞分裂素6-BA的存在是必不可少的。在分化培养基中加人100mg/L硫酸腺嘌呤和100mg/L水解乳蛋白, 不但有利于愈伤组织的生长, 而且对苗的分化也有一定的促进作用。
3细胞悬浮培养
马铃薯悬浮细胞培养能够为突变体筛选、 无性系变异、 原生质体的分离和培养、 遗传转化、 次生代谢物生产、 种质资源库的建立、 人工种子的制备等多项研究提供良好的实验系统。祁新等(19%)[9]以马铃薯品种”春薯1号”为供试材料, 进行了马铃薯悬浮细胞培养的研究, 结果表明, 马铃薯幼嫩组织是建立悬浮细胞系的优良外植体, 将诱导出的愈伤组织用摄子夹碎后置于液体培养基中, 在120r/min、 24士2℃、 黑暗下, 每5d继代一次能够建立良好的悬浮细胞系。
4原生质体培养
植物原生质体的分离和培养是进行体细胞融合的关键技术环节和基础。在中国, 马铃薯原生质体培养的研究, 与国外相比差距甚大。当前共有7个马铃薯品种(系)的原生质体培养获得了再生植株, 原生质体来源于无菌试管苗叶片、 实生苗子叶和下胚轴。培养方法均采用液体浅层静止培养。李耿光等(1988)[10]观察到马铃薯叶肉原生质体分裂能力与材料的培养条件有关, 将试管苗培养于温度25士l℃、 200Olx、 16h光照下, 容易得到大量具有活力的原生质体。并观察到由叶肉原生质体再生的植株在叶形、 叶色、 叶片大小、 茎叶绒毛、 分枝情况、 植株生长势等形态学方面发生了变异。而且在染色体数目上也发生了明显的变异, 具有正常四倍体染色体数的频率很低, 而非整倍染色体数频率很高。另外, 王蒂等(1999)[11]对马铃薯花粉原生质体的分离还进行了研究, 结果表明, 1%蜗牛酶和0.5%崩溃酶的混合酶液游离马铃薯小孢子原生质体效果最好, 对分离得到的花粉原生质体用0.1%荧光增白剂检测表明脱壁完全, FDA荧光检测表明花粉原生质体具有生活力。花粉原生质体的分离成功, 将有可能使马铃薯四倍体栽培种的花粉原生质体和二倍体野生种的体细胞原生质体进行配子-体细胞杂交成为可能, 最终得到四倍体杂种植株, 从而为利用野生种的优良基因开辟一条新的途径。
5块茎离体生产
离体培养生产马铃薯块茎, 其优点是体积小、 重量轻和无菌的, 而且不受季节的限制, 但其在田间生长植株完好。离体培养生产块茎, 可用作输出马铃薯种质的崭新方法, 并有可能成为商品种子。在离体培养条件下, 诱导马铃薯试管薯的研究已引起了中国学者的普遍重视, 并已取得了许多有价值的研究成果。
6种质离体保存
马铃薯为无性繁殖作物, 繁殖器官体积大, 含水量高, 贮藏过程中易发芽, 需年年田间种植, 而且为大株行距作物, 占用土地面积大, 还易受病毒侵染造成退化, 因此用常规方法保存数目庞大的马铃薯种质几乎成为不可能的事情。采用组织培养技术建立无菌试管苗保存马铃薯种质具有许多优点, 免去了大田种植保存的费工费时以及危险性, 贮藏空间小, 繁殖系数高, 而且便于提供原种、 地区间发放和国际间交流。马铃薯种质保存的方法主要有试管苗及微型块茎的低温贮藏和组织或细胞的深低温贮藏。中国学者在马铃薯种质离体保存方面也进行了一定的研究。林长春等(1959)[2]在Ms培养基中添加3mg/L脱落酸(ABA)和4%甘露醇, 存放550d的试管苗存活率可达36%。再加上用塑料薄膜封口代替棉塞, 可使试管苗继代保存期延长到1—1.5年转移一次。
7问题与展望
经过20多年的研究, 中国马铃薯组织和细胞培养已经取得了长足的发展, 但与国际上的研究相比, 仍存在不少困难尚待进一步的深人研究。茎尖培养脱出病毒的效果及品种的范围仍需扩大, 花药培养诱导双单倍体及单倍体的频率较低, 而且受基因型的限制, 花粉培养尚未再生植株;胚、 子房及胚乳培养诱导成株的品种很少, 其培养条件需进一步优化;细胞悬浮系的建立及单细胞的分离培养效率尚待提高;原生质体培养还未程序化;离体块茎的诱导及贮存在生理生化机理方面有待深人探讨, 以便达到系统化操作的程度;种质低温和深低温保存及其遗传稳定性未进行广泛研究等。以上诸多问题的解决, 有赖于马铃薯同仁们的共同协作努力, 可望不久的将来取得重大突破。马铃薯组织和细胞培养的研究, 除用茎尖培养获得无毒苗进行大规模种薯生产已取得巨大经济效益外, 其它诸项研究大多数仍停留在实验室阶段。要将这些技术应用于马铃薯的遗传育种和生产实践中, 必须强调的是各项技术要综合应用, 而且与常规育种研究要相结合, 最终才能培育出优良的马铃薯品种, 从而进一步地为生产实践服务。另外, 经过组织和细胞培养诱发体细胞无性系变异, 可提供常规育种无法比拟的新机会和优越性, 从而为马铃薯品种改良做出重大贡献。
[参考文献]
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[2]林长春, 李其文.马铃薯茎尖脱毒与种质资源试管保存的研究.马铃薯杂志.1989,3(2):73—78
[3]朱明凯, 程天庆, 高湘玲等.早熟马铃薯四倍体栽培种花药诱导成株.园艺学报, 1985, 12(3):177—180
[4]左秋仙, 李淑媛, 林自安等.马铃薯花粉粒的分离培养和愈伤组织的形成.马铃薯杂志.1990, 4(1):19—22
[5]王蒂.冉毅东.戴朝曦.马铃薯花药培养中高温前处理的作用及不同基因型的反应..马铃薯杂志, 1991, 5(2):79—82
[6]陶自荣, 刘敏颂, 朱仲纯.马铃薯未传粉子房培养诱导双单倍体植株.遗传学报, 1988, 15(5):329—334
[7]刘淑琼, 母锡金.马铃薯离体胚乳培养的研究.植物学报, 1981, 23(1):72—74
[8]韩善华, 郑国倡.马铃薯幼茎(芽)愈伤组织的诱导和植株再生.实验生物学报, 1982, 15(1):111—115
[9]祁新, 王权, 顾德峰等.马铃薯悬浮细胞培养.吉林农业大学学报, 1996, 18(1):21—24
[10]李耿光, 张兰英.马铃薯叶肉原生质体再生植株的研究.植物学报, 1998, 30(1):21—24
[11]王蒂, 司怀军, 王清.马铃薯花粉原生质体分离的研究.园艺学报, 1999, 26(5):323—326