【微生物实验报告】.docx

微生物实验报告一、实验目的我们在分子实验中将目的基因（Hsp16.3）转化进入大肠杆菌BL21，通过凝胶电泳检测，筛选出了能够表达目的基因的阳性菌落。本部分微生物实验则培养这一阳性菌落中挑出的细菌，使其快速繁殖从而产生大量细菌，并用IPTG诱导其产生大量蛋白（HSP16.3）。 在该实验中学生应学会：微生物发酵的基本原理；用IPTG诱导目的蛋白的表达以及在实验室内大规模培养微生物细胞或产物的方法。并且掌握自控发酵罐的构造、原理和操作程序，学习。对发酵工程有更多的了解。二、实验背景微生物发酵的基本理念就是利用各种人工控制手段为微生物创造最舒适的环境，促成其进行某种特定的代谢，以最大限度地获得目的产物。对于微生物生长来说，各种重要的影响因子：水，温度，盐，氧气，碳源，氮源，生长因子等的差异，都有可能造成重要的影响。因此在发酵过程中，适当的控制罐内的上述因子，以使其适应所需，显得尤为重要。 一般而言，发酵并不仅仅只是单纯的细胞扩增的过程的还包括上游的菌种处理，培养基和灭菌锅的处理 以及下游的目的产物的分离纯化过程，很有可能这些上下游的过程的成本或者劳动消耗还要超过 在发酵中的投入。具体的讲，其中上游工程包括优良种株的选育，最适发酵条件（pH、温度、溶氧和营养组成）的确定，营养物的准备等。发酵工程中要有严格的无菌生长环境，包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；还有种子培养和生产培养的不同的工艺技术。此外，根据不同的需要，发酵工艺上还分类批量发酵：即一次投料发酵；流加批量发酵：即在一次投料发酵的基础上，流加一定量的营养，使细胞进一步的生长，或得到更多的代谢产物；连续发酵：不断地流加营养，并不断地取出发酵液。下游工程指从发酵液中分离和纯化产品的技术：包括固液分离技术（离心分离，过滤分离，沉淀分离等工艺），细胞破壁技术（超声、高压剪切、渗透压、表面活性剂和溶壁酶等），蛋白质纯化技术（沉淀法、色谱分离法和超滤法等）最后还有产品的包装处理技术（真空干燥和冰冻干燥等）。三、实验设备及试剂1、实验材料可诱导表达目的蛋白HSP16.3的重组大肠杆菌BL21(卡那霉素卡那霉素抗性）2、实验设备：超净工作台、恒温震荡培养箱、250mL、500mL三角瓶、7L发酵罐、722S分光光度计、BioFlo 110 Fermentor 及配套设备、高温灭菌锅、高速台式离心机、7ml离心管3、实验试剂胰蛋白胨（Tryptone）、酵母抽提物（Yeast extract）、氯化钠（NaCl）、磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O）、葡萄糖（glucose）、卡那霉素（Km）、异丙基硫代D半乳糖苷（IPTG）、磷酸或硫酸、氢氧化钠（NaOH）、泡敌(antifoam)或豆油四、实验步骤 8月24日种子培养液的配制及发酵罐的准备1、 培养基的配置1.1 LB培养基(200mL/小组,400mL大组)Tryptone10g/LYeast extract5g/LNaCl10g/L1 mol/L NaOH调节pH值至7.5，加入蒸馏水定容, 121高压灭菌20min。于灭菌的LB液体培养基中，按终浓度50g/mL加入过滤除菌的Km贮存液(HSP16.3)表1  LB培养基配制方法1.2 发酵培养基Tryptone40 g（10g/L终浓度）Yeast extract60 g（15g/L终浓度）NaCl40 g（10g/L终浓度）去离子水定容至3.3L搅拌至溶液澄清121高压灭菌30min表2  发酵培养基配制方法补料：葡萄糖（4瓶）88g去离子水定容至160 mL115高压灭菌20min接种时加至发酵罐中K2HPO4（1瓶）52 g去离子定容至100 mL115高压灭菌20min接种时加至发酵罐中NaOH（2瓶）40 g蒸馏水定容至200 mL，115高压灭菌20min，补料时加至发酵罐中表3  发酵培养基的补料1.3 IPTG贮存液IPTG 2.38g溶于10mL双蒸水中，过滤除菌，分装，20冻存备用。1.4 10%磷酸或硫酸121 高压灭菌20min，备用。1.4 40%氢氧化钠溶液   121高压灭菌20min，备用。1.5 泡敌（antifoam）1mL   分装在 冷冻管中，121高压灭菌20min备用2、 种子液的准备2.1 预培养    取平板上单菌落接种于50mL Km/LB培养基中（装在250mL的三角形），37，200rpm/min培养8小时。22 二级种子液的准备(200mL)按1%的接种量接入装有100ml Km/LB的250ml培养瓶中，37，200rpm/min培养12hrs后接入发酵罐，接种浓度为200ml/4L。3、 发酵罐的准备3.1 清洗发酵罐拆卸并清洗发酵罐的各个部分，随后组装发酵罐。3.2校正pH电极的零点和满刻度1) 打开发酵罐系统的动力开关，选择“fermentation”,“screen”调至“calibration”，“enter”确认。 2) 用“”调至“zero”。 3) 把pH电极浸入pH值为6.86的标准缓冲液中, 调至read档后输入6.86。 4) 用“”键调到“span”档。 5) pH电极用蒸馏水清洗后浸入pH为4.01的标准缓冲液中, 调至read档后输入4.01。 6) 重复校正2次，直至read的值与所设值相差在0.02以内。 3.3 安装发酵罐，创造密封环境 在灭菌前，要对发酵罐进行部分安装以便创造整体的无菌环境。具体安装部分是：进气孔橡胶管，出气孔冷凝器，冷凝管进出水孔，pH电极，取样设备，补碱孔橡胶管。其中补料孔一共有3孔，因此要用橡胶管把除补碱孔之外的其余两孔短接，以创造封闭环境。对于所有与外界连通的橡胶管，都要用滤膜封口，以免灭菌过程中有细菌进入罐体。在灭菌前，要在发酵罐中发酵原液再灭菌。同时要注意封闭直接与发酵罐原液连通的硅胶管，以免高温灭菌时液体溢出。3.4高温灭菌 将配制好的培养基、试剂及处理好的发酵罐一起放入高压灭菌锅中， 115高温灭菌30min。 8月25日重组大肠杆菌的高密度发酵与目标产物的大量表达1、发酵罐的预处理1.1 接上pH电极的插头, 接通底部冷却水管和空气出口处的冷凝器上的冷却水管, 将各硅酮管置于相应的蠕动泵上。1.2 把搅拌马达置于搅抖联动装置上。2、校正DO电极的满刻度利用光标将搅拌速度调至800r/min，把通气量调节到4.0L/min/4L发酵液(1vvm)。调到calibration界面，光标调至DO处，“span”档，设定读数为100，反复调节几次，直至稳定至100，转至menu界面（同时校正零点）。3、再次校正PH电极虽然灭菌前已经校正过pH，但高温灭菌时会有漂移，因此在发酵开始前要再次校正。在发酵罐中取出一点样，用pH计测出其pH值，pH电极设定界面重新设定PH值。4、其他参数设定1) 把光标调到Agit档，设定最小值为200r/min。2) 把光标调到DO档,设定参数为30 调整为与溶氧偶联检测。3) 把光标调到Agit档，设定最大值为800r/min。 4) 把光标调到pH档,设定参数为7.0，调整为自动检测。 5) 把光标调到“Temperature”档, 设定温度为37。6) 接上碱瓶，打开自动检测系统。5、离心管的称量准备若干支5ml离心管，标号并准确称重，用于盛装各次取样的菌液及上清液。 6、 发酵罐的接种培养6.1 加料1）将蘸满乙醇的棉花球缠在接种口外套上，点燃火焰以前将接种口的盖子旋松。2）点燃棉花球，取掉盖子，立即通过火焰向发酵罐中加入1瓶葡萄糖溶液、1瓶K2HPO4溶液、1管抗生素4ml、2瓶过夜培养的LB培养液及少量消泡剂。3）将盖子内口置于火焰内，接种后，用摄子将盖子准确放回原位，旋紧。4）打开记录实验过程的专用软件。6.2 取样发酵过程中，每隔1小时取样5ml*2放入事先称好重量的两支离心管内，待测细胞干重和发酵液糖含量变化。a) 测定OD600（取样品瓶中剩余液，测前吹打均匀）b) 用糖试纸粗测糖含量，葡萄糖浓度降至5g/L或最高转速下降时，补加葡萄糖。补糖后立即取样，仅保存上清，待测糖含量。c) 当OD600在8-10之间时，加IPTG1管（4ml，1000X），之后每罐每2小时取100ml，4保存。d) 气泡多时（超过发酵罐空气体积的一半），加入少量消泡剂。e) 约8h后，发酵结束。 *注：分光光度计测量吸光度值时，有时需要稀释，保证吸光度值在0.3-0.8之间，否则结果不准确。 8月26日发酵动力学曲线测定及分析1、标准曲线配置10g/L葡萄糖标准溶液100ml。 配置葡萄糖标准试样于25mL有刻度试管中： 葡萄糖浓度g/L 0 1 2 3 4 5 67葡萄糖标准溶液体积/ml 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.7H2O /ml1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.40.3表4  标准曲线葡萄糖溶液的配制1.1各加入2.0ml的水杨酸反应液，沸水加热2min。1.2冷却后定容至25ml，摇匀，作为标准样。1.3以空白调零，测定标样的OD540，绘制标准曲线。2样品葡萄糖的测定2.1 取26个干燥洁净的25ml玻璃试管分别标记，分别向其中加入0.75ml的去离子水和0.25ml的样品菌液。2.2分别向玻璃试管中加入3,5-二硝基水杨酸2ml，置于100沸水锅中煮沸2min。2.4冷却后定容至25ml，摇匀，作为待测样。2.5测定OD540，由此计算发酵液中的糖含量。 3、细胞干重的测定发酵过程中收集的样品，8000r/min离心10min（上清转移至干净的试管中，测糖用），加入5 mL去离子水，充分重悬细菌，再次离心，然后采用冰冻干燥法或100烘干除去细胞中水分（2小时），称重。4、发酵结果分析1)绘制溶氧、转速、OD600、细胞干重、葡萄糖浓度随时间变化的曲线图，分析各个阶段：延滞期、对数期、稳定期和衰亡期的细菌生长状况与底物，溶氧等关系。2)生化电泳图（产物表达-时间图）。3)分析计算大肠杆菌在对数生长期的代时,与理论值比较4)其他讨论五、实验结果和分析 1、大肠杆菌生长曲线1.1 实验过程操作记录时间操作操作人员0小时0分钟（开始发酵）取样5ml*2（1）范玉杰，张艺君40分钟因碱泵内残留空气较多，调pH8.0并迅速调回7.0以碱液将空气挤出1小时0分钟取样5ml*2（2）李冰冰，林之祺2小时0分钟取样5ml*2（3）李超畅，朱忻怡3小时0分钟取样5ml*2（4）郑世喜，吉贞颖20分钟取样测OD（未留样）30分钟取样5ml*2（51），测OD及糖量40分钟取样300ml*1（0h）加Glucose补料，加IPTG诱导剂50分钟取样5ml*2（5-2），测OD4小时0分钟取样5ml*2（6）范钰琨，孙笑尘40分钟取样800ml*1移至另一组的发酵罐作为种子5小时0分钟取样5ml*2（7）宋泽穹，李婕30分钟取样300ml*2（2h）加消泡剂6小时0分钟取样5ml*2（8）李一善，王一30分钟取样5ml*2（9），测OD及糖量加Glucose补料40分钟取样5ml*2（10），测OD及糖量7小时0分钟取样5ml*2（11）张艺君，朱忻怡30分钟取样300ml*2（4h）40分钟取样5ml*2（12）表5  发酵过程操作记录 【分析】综合数据：1、总共发酵时间8小时。2、5ml取样（测OD、糖量，测DNS曲线）26次，300ml取样（留做生化实验）4次，800ml转移（转移至另一组做种）一次。3、补加葡萄糖2次，补加IPTG诱导剂1次，补加消泡剂1次。1.2 发酵过程综合数据H   min   温度   转速     pH  溶氧   OD600  含糖量0037.0 2007.02 100.0 0.285 20001037.0 2467.02 35.4 2037.0 2287.01 22.8 3037.0 2637.01 34.7 4037.0 3177.00 27.5 5037.0 3196.99 33.0 1037.0 3536.98 28.5 0.592 1000-20001037.0 4066.97 23.3 2037.0 4386.95 21.0 3037.0 4666.95 36.5 4037.0 5156.95 33.3 5037.0 5166.95 28.2 2037.1 5486.95 28.8 2.250 1000-20001037.1 5776.95 27.0 2037.1 6096.95 27.1 3037.1 6436.95 28.8 4037.1 6736.95 29.6 50371 7016.95 28.9 3037.1 7236.95 30.7 5.740 1000-20001037.1 7436.95 28.3 2037.1 7676.95 30.1 6.280 3037.1 7886.95 29.7 8.240 1000-20004037.1 7896.95 29.9 5037.1 8006.95 27.9 10.000 4037.1 8006.94 21.7 11.300 1000-20001037.1 8006.94 15.0 2037.1 8006.93 8.1 3037.1 8006.92 5.6 4037.1 8006.91 6.75037.0 8006.94 8.85037.0 8006.93 7.1 15.840 1000-20001037.0 8006.95 16.2 2037.0 8006.95 16.4 3037.0 8006.95 19.6 4037.0 8006.95 10.3 5037.0 8006.95 28.3 6037.0 8006.95 29.1 18.400 1000-20001037.0 7926.95 30.1 2036.9 6706.95 29.8 3036.9 7636.95 28.9 17.680 10004037.0 7526.95 29.9 16.560 1000-20005037.0 7546.95 29.0 7037.0 7476.95 29.7 19.000 1000-20001037.0 7406.95 30.1 2037.0 7326.95 36.3 3037.0 5956.95 30.9 4036.9 6146.95 23.1 21.880 1000-2000表6  发酵过程综合数据 【分析】1、温度、pH：由于有电热毯、冷却水的调节，温度始终保持恒定不变。虽然大肠杆菌在发酵过程会不断产生酸性代谢物，但是因为碱泵不断向罐内输送无菌的NaOH溶液，因此发酵罐内的pH没有太大的变化。2、转速、溶氧：在机器运作之前已设定转速与溶氧相藕连，因此当罐内溶氧量较高时转速会保持在一个比较低的水平；当罐内溶氧量较低时，转速就会一直保持800满速，以较快的搅拌来保证发酵罐内溶氧的平衡。3、OD600、含糖量：见后文分析。图1  发酵过程转速曲线图2  发酵过程转溶氧曲线【分析】转速与时间的关系曲线基本正常，符合一般情况。可以发现，在350分钟左右出现了不符合折线走势的数据，对比前面的操作表格可以发现，转速突然跌落的点在6小时20分钟；溶氧突然跌落的点在5小时40分钟。根据当时的观察可知，在5小时30分钟至5小时50分钟，由于中途取样较多（300ml*2），并添加了消泡剂，因此溶氧的值一直在波动之中，且波动幅度较大（最低7%，最高30%）。图3  发酵过程测得OD600曲线【分析】除了在400分钟处曲线出现了一次突变，其他数据和整体走向都符合正常。400分钟处OD600数值异常的原因在后文整体分析会详细说明。2、发酵过程中细菌质量浓度的测量试管净重（g）试管实重（g）菌体干重（g）平均值（g）每升干重（g）2.95482.95620.00140.000950.1900 2.95722.95770.00052.72322.72570.00250.00240.4800 2.99352.99580.00233.03893.04580.00690.006851.3700 2.64752.65430.00683.03563.04980.01420.014152.8300 2.99883.01290.01412.91842.93890.02050.01993.9800 3.03323.05250.01933.02543.04720.02180.02154.3000 2.81442.83560.02122.99473.01640.02170.02174.3400 3.03323.05490.02173.05023.08300.03280.033256.6500 2.82932.86300.03372.71542.75380.03840.03777.5400 2.90952.94650.0373.03353.07180.03830.038757.7500 3.03313.07230.03922.97073.00410.03340.03446.8800 2.99073.02610.03542.97053.00730.03680.03577.1400 2.91382.94840.03462.91902.95630.03730.0367.2000 2.86362.89830.0347表7  大肠杆菌干重随时间变化数据表图4  发酵过程菌体浓度曲线【分析】由于OD600在一定程度上反映了样品中菌体的浓度，因此与OD600曲线相似，菌体浓度除了在400分钟处出现一次突变，其他一切正常，符合适应期到对数期到稳定期的趋势。3、发酵过程中葡萄糖浓度的测量3.1 葡萄糖标准溶液曲线葡萄糖溶液浓度 g/LOD5400010.19420.41330.61140.80750.99161.17171.331表8  葡萄糖标准溶液浓度及OD540图5  葡萄糖溶液浓度与OD540关系标准曲线3.2 发酵过程中样品葡萄糖浓度曲线样品OD540平均值平均葡萄糖浓度g/L1A1.180 1.1252.3083B1.070 2A1.100 1.0832.2208B1.066 3A0.989 0.95951.9635B0.930 4A0.808 0.79351.6177B0.779 5-1A0.553 0.57151.1552B0.590 5-2A1.585 1.5123.1146B1.439 6A1.494 1.4643.0146B1.434 7A1.147 1.16152.3844B1.176 8A0.919 0.88551.8093B0.852 9A0.805 0.80651.6448B0.808 10A1.894 1.93.9229B1.906 11A1.750 1.80653.7281B1.863 12A1.794 1.80053.7156B1.807 表9  发酵过程中样品葡萄糖溶液OD值及对应浓度图6  发酵罐内葡萄糖浓度曲线【分析】观察上图后我们可以很轻松的发现两次补加葡萄糖的时间。第一次补加葡萄糖是在3小时40分钟，即220分钟。在120分钟后，细菌生长进入对数期，因此在120分钟至200分钟期间葡萄糖的消耗量骤然增加。在220分钟已出现明显不足，因此我们选择了补加葡萄糖。第二次补加葡萄糖是在400分钟。观察220分钟补加葡萄糖之后至400分钟的区间段，可以很明显的看出葡萄糖消耗量依旧快速，细菌仍处于对数期。当然，葡萄糖浓度曲线的优秀还是依赖于近乎完美的标准曲线。在步骤颇多、容易出错的测DNS曲线实验中达到如此精度实属不易啊，第二罐的全体罐员都太优秀了！4、菌体浓度与葡萄糖浓度随时间变化趋势的对比将葡萄糖浓度和菌体浓度和OD600三组数据放在同一张图上进行对比观察，得到菌体浓度、葡萄糖浓度与OD600随时间变化曲线。发酵时间（h）OD600菌体浓度（g/L）葡萄糖浓度（g/L）00.2850.192.308310.5920.482.220822.2501.371.963535.7402.831.61773.58.2403.981.15523.810.0004.33.1146411.3004.343.0146515.8406.652.3844618.4007.541.80936.517.6807.751.64486.716.5606.883.9229719.0007.143.72817.721.8807.203.7156发酵时间（h）图7 菌体浓度、葡萄糖浓度、OD600曲线对比图【分析】1、关于细菌生长曲线的时期：观察图中的曲线走势可知，0-2小时为适应期，菌体尚未进行高效率的生长；2-6小时为对数期，在6小时30分钟的时候曲线出现了一次突变（这个在下面详细说明原因），之后细菌进入了稳定期。图中尚未出现衰亡期。2、关于曲线的一次突变：观察上图中三条曲线的走向可发现，在6小时40分钟左右三条曲线均出现突变：OD600的数值变小，菌体浓度变小，葡萄糖浓度变大。对此我的解释是，在这个关键时间点，发酵罐内的菌仍处于对数期，但是罐内的葡萄糖浓度已经太低而不足以让菌正常生长。在及时加入葡萄糖之前，菌因为养分不够而出现小面积死亡现象，导致该时间点的菌体浓度和OD600均出现明显下滑。经过取样测糖浓度后，我们在第一时间往发酵罐内添加了葡萄糖，于是细菌继续生长进入平台期，即出现了之后的曲线。对照表5发酵罐操作记录可以发现，在该时间点确实出现了补加葡萄糖的操作。五、生化实验结果看到这样的结果，我心里只能想到两个字：悲剧。其实无论从结果上看还是数据上看，我们的微生物实验都算得上做的很成功了。我们的罐是整个实验课程4个罐里唯一一个一次成功的罐，一切数据都很正常甚至很优秀。因此在做后续的生化实验时我所在的小组果断选择了自己的菌跑胶而不用助教培养菌，可能这也是因为我们对微生物实验的结果太满意了吧。然而乐极生悲，我们的生化实验在跑胶后发现，我们的菌基本没有需要的Hsp蛋白，跑胶结果近乎空白。微生物实验结果这么优秀而无法在生化实验中得到验证，这实在是太遗憾了。经过分析后我们觉得，造成这种结果的有以下几个原因：1、菌液在培育过程中表达Hsp的基因因为环境等因素丢失了；2、发酵时加IPTG出现了操作上的失误，比如在火上过多的停留了导致IPTG过热而变性，因此并没有诱导菌体内的基因合成Hsp蛋白；3、菌内的杂蛋白太多而Hsp蛋白太少，仅存的一点Hsp蛋白在生化试验过滤的时候被消耗掉了。其实最近我才知道，我们的小组是整个班里唯一一个用自己培养的菌跑胶的小组，当然，这是后话了。六、思考题1、如何获得发酵过程中所需的无菌空气？ 辐射灭菌、加热灭菌静电除菌、介质过滤除菌。 2、发酵过程中搅拌的作用是什么？1、使空气和发酵液充分混合，促进溶氧。 2、使发酵液中的各物质混合均匀，保证罐中各处营养物质、酸碱度等保持均一；3、保持罐中液体流动，加快热传递，使各处温度一致。3、在发酵过程中调节溶氧的方法有哪些？1、调节搅拌转速。2、调节通风速率。3、罐体中的挡板能将气泡切碎，也增强了溶氧效果。另外，调节罐压、基质浓度、温度和加入表面活性剂等也会对溶氧产生影响。4. 为什么在大肠杆菌培养过程中, pH上升发酵就结束？大肠杆菌产生的代谢物呈酸性，生长过程中会使发酵液pH下降。pH上升，说明细菌的代谢速度下降，菌体自溶，细胞液外流，培养液中氨基氮增加导致pH值上升。而这一现象说明了细胞进入衰亡期，此时应结束发酵。5. 发酵过程中如何防止噬菌体污染？1、在发酵开始前，对发酵罐进行高温高压灭菌。将整个发酵罐与外界连通的接口全部封住，形成封闭环境，然后再高温115摄氏度下杀菌30分钟。2、采用过滤薄膜，保证罐内的空气不受污染。3、保证发酵罐周围的环境清洁，定时进行消毒处理。4、在上罐前和发酵过程中进行试漏处理，保证发酵罐的封闭性，防止噬菌体进入发酵罐。5、一旦发现噬菌体感染以后，对发酵罐进行加热处理后，将发酵液转移到消毒后的发酵罐进行补种，或是添加噬菌体抑制剂防止进一步的侵染。6.为了更好分析发酵过程，除了分析糖变化，pH，溶氧，温度外，最好还要检测哪些数据？水分含量，无机盐含量，氮源变化，碳氮含量比。七、致谢这次微生物综合实验总体来说还是很成功的，发酵过程中不仅没有受到噬菌体的感染，溶氧、pH、温度、等一切数据也都正常，同时糖含量的DNS曲线结果也非常优秀。在此感谢陈金春老师给予我们的指导，感谢助教孟德川对我们的帮助和解惑，感谢第二罐的罐长孙笑尘及副罐长陈智弘的付出，同时也感谢我们第二大罐所有罐员的努力和付出！八、参考文献微生物学实验指导，陈金春，陈国强，清华大学出版社，2005年8月