7-FCM参考样品.pptx

FCM参参考考样样品品参考标准样品在参考标准样品在FCM使用中的意义使用中的意义 参考标准样品在参考标准样品在FCM中使用，中使用，为了监测仪器的液流，电子和各为了监测仪器的液流，电子和各个光学系统的稳定性，校正和调个光学系统的稳定性，校正和调试仪器的试仪器的CV值，最大限度的提高值，最大限度的提高仪器的分辨能力，参考标准样品仪器的分辨能力，参考标准样品的主要作用如下的主要作用如下:参考标准样品在参考标准样品在FCM使用中的意义使用中的意义1.调整仪器在高性能的工作状态。调整仪器在高性能的工作状态。2.由于由于FCM的测量是相对的，而不是的测量是相对的，而不是绝对的，绝对的，所以参考细胞有助于单个所以参考细胞有助于单个样品或一组样品的测量参数的解释。样品或一组样品的测量参数的解释。3.参考标准细胞可供监测工作状态下参考标准细胞可供监测工作状态下的仪器稳定性，以使所测参数的可靠的仪器稳定性，以使所测参数的可靠性和可比性。性和可比性。参考标准样品在参考标准样品在FCM使用中的意义使用中的意义4参考细胞可被用于监测染色过程。参考细胞可被用于监测染色过程。5能够用于校验能够用于校验FCM分选术的回收分选术的回收 纯度。纯度。参考标准样品具备的特性参考标准样品具备的特性1 一个标准样品，应具有较恒定的一个标准样品，应具有较恒定的 体积大小体积大小2 具有较恒定荧光发射量子具有较恒定荧光发射量子3 细胞的形状较一致细胞的形状较一致4 在液流中的流动取向较一致在液流中的流动取向较一致参考标准样品具备的特性参考标准样品具备的特性5 在悬液中可保持高度的单分散状在悬液中可保持高度的单分散状 态，放置较长时间不会聚集、态，放置较长时间不会聚集、不改变其形状、体积大小及其不改变其形状、体积大小及其 光学特性光学特性参考标准的使用方法参考标准的使用方法1 外标法外标法：标准样品在流式分析试：标准样品在流式分析试 验样品前或后测量验样品前或后测量,以校正仪器在工作条件以校正仪器在工作条件 下的稳定性。下的稳定性。参考标准的使用方法参考标准的使用方法缺点缺点：由于参考样品与试样品不由于参考样品与试样品不 同步染色，以及在实验过同步染色，以及在实验过 程中仪的漂移，可能引起程中仪的漂移，可能引起 定量检测的误差，因此近定量检测的误差，因此近 年在流式细胞定量检测中年在流式细胞定量检测中 已被摒弃。已被摒弃。1 外标法外标法参考标准的使用方法参考标准的使用方法2内标法内标法:内标法是将标准样品与内标法是将标准样品与 实验样品按一定的细胞实验样品按一定的细胞 数混悬在一起进行同步数混悬在一起进行同步 染色染色,参考标准的使用方法参考标准的使用方法优点：这种方法可以避免外表法引优点：这种方法可以避免外表法引 入的误差入的误差,避免因染色、光源避免因染色、光源 强度的瞬时波动，以及细胞强度的瞬时波动，以及细胞 流速的变化和流束与激光束流速的变化和流束与激光束 焦点的漂移造成的实验结果焦点的漂移造成的实验结果 偏差。偏差。内标法内标法参考标准的使用方法参考标准的使用方法内标法内标法优点：内标法可保证标准样品与实优点：内标法可保证标准样品与实 验样品在同样条件下制备和验样品在同样条件下制备和 测量，可使测量误差降到最测量，可使测量误差降到最 小限度。内标法在流式细胞小限度。内标法在流式细胞 测量术已广泛应用。测量术已广泛应用。参考样本的制备方法参考样本的制备方法非生物标准样本非生物标准样本生物性标准样品生物性标准样品参考样本的制备方法参考样本的制备方法非生物标准样本非生物标准样本 塑料微球已广泛应用于参考标准塑料微球已广泛应用于参考标准样品，这些塑料小球可分为两种：样品，这些塑料小球可分为两种：参考样本的制备方法参考样本的制备方法非生物标准样本非生物标准样本 无荧光塑料小球：无荧光塑料小球：可用于散射光可用于散射光的校正，此种统一大小无荧光微球，的校正，此种统一大小无荧光微球，对于校正仪器光散射是非常有用的。对于校正仪器光散射是非常有用的。最好采用最好采用10m大小（于正常人淋巴大小（于正常人淋巴细胞大小相似），通过微球大小的细胞大小相似），通过微球大小的测量，可以对实验样品细胞的面积，测量，可以对实验样品细胞的面积，直径，横截面积和体积作出相对大直径，横截面积和体积作出相对大小的判断。小的判断。参考样本的制备方法参考样本的制备方法非生物标准样本非生物标准样本标记有荧光染料的塑料微球：标记标记有荧光染料的塑料微球：标记荧光染料多选用荧光染料多选用PI、EB、FITC、AO等，荧光染色的塑料微球可用于等，荧光染色的塑料微球可用于调整和监测光散射和荧光信号的检调整和监测光散射和荧光信号的检测。对不同荧光染色细胞所结合的测。对不同荧光染色细胞所结合的荧光分之的数目和细胞体积的大小荧光分之的数目和细胞体积的大小进行较准确的计算。进行较准确的计算。参考样本的制备方法参考样本的制备方法 流式细胞仪对于微球分辨率的大流式细胞仪对于微球分辨率的大小，取决于微球大小是否一致，分辨小，取决于微球大小是否一致，分辨率的大小一般用变异系数率的大小一般用变异系数(Coeffience of Variation CV)来表来表示，目前有的生产厂家出售的商品微示，目前有的生产厂家出售的商品微球已表明球已表明CV值。光散射值。光散射CV值为值为1.22%，荧光，荧光CV值为值为2.22.8%。非生物标准样本非生物标准样本参考样本的制备方法参考样本的制备方法 非生物性塑料小球可作为长期使非生物性塑料小球可作为长期使用于流式的标准样品，其配制方法用于流式的标准样品，其配制方法和保存方法根据出售厂家的产品说和保存方法根据出售厂家的产品说明。但各种微球多要避光保存，因明。但各种微球多要避光保存，因白炙光可使荧光微球的荧光淬灭。白炙光可使荧光微球的荧光淬灭。在冰箱内保存要防止冷冻结冰和悬在冰箱内保存要防止冷冻结冰和悬液干燥破坏微球，在长期使用过程液干燥破坏微球，在长期使用过程中或换批号时要做对比鉴定。中或换批号时要做对比鉴定。非生物标准样本非生物标准样本参考样本的制备方法参考样本的制备方法非生物标准样本非生物标准样本生物性标准样品生物性标准样品参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品某些生物性颗粒某些生物性颗粒 可作为短期标准，例如植物花可作为短期标准，例如植物花粉、一些真菌等，可作为体积大小粉、一些真菌等，可作为体积大小的光散射标准，但是由于其准确性的光散射标准，但是由于其准确性较差，产生误差较大，且在水中不较差，产生误差较大，且在水中不易保存和易发生体积大小、光学型易保存和易发生体积大小、光学型号特征等方面的变化，因此很少在号特征等方面的变化，因此很少在FCM中使用。中使用。参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 在在FCM中最常用的生物细胞中最常用的生物细胞参考标准样品是鸡红细胞、人的淋参考标准样品是鸡红细胞、人的淋巴细胞，近年来有人使用了虹鳟鱼巴细胞，近年来有人使用了虹鳟鱼红细胞、元鱼血细胞等红细胞、元鱼血细胞等参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品 生物细胞不但可作为调整仪器生物细胞不但可作为调整仪器的标准样品，并可用一种已知某种的标准样品，并可用一种已知某种生物化学成分含量（如生物化学成分含量（如DNA）的标的标准细胞作为实验样品细胞生物化学准细胞作为实验样品细胞生物化学成分含量的计算标准成分含量的计算标准 这些细胞一般采用内标法这些细胞一般采用内标法参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品鸡红细胞：鸡红细胞：鸡红细胞在体内为一终末细胞，鸡红细胞在体内为一终末细胞，其其DNA含量是均匀一致的，相当于含量是均匀一致的，相当于正常人淋巴细胞正常人淋巴细胞(二倍体细胞二倍体细胞)DNA含含量的量的35%，FCM测定其测定其DNA含量分含量分布组方图。所得结果为单一狭窄、布组方图。所得结果为单一狭窄、对称的正态峰对称的正态峰参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品鸡红细胞：鸡红细胞：参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品鸡红细胞：鸡红细胞：鸡血红细胞既可作为鸡血红细胞既可作为DNA内参内参标准，也可以作为调整仪器的标准样标准，也可以作为调整仪器的标准样品，美国品，美国Stanford大学医学部成功的大学医学部成功的使用鸡血红细胞调试仪器，其使用鸡血红细胞调试仪器，其CV值值最好可达最好可达2%参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品鸡红细胞：鸡红细胞：鸡血红细胞作为内参标准样品，鸡血红细胞作为内参标准样品，放入实验样品的比例为放入实验样品的比例为510:100。鸡血红细胞制备简单，来源丰富，价鸡血红细胞制备简单，来源丰富，价格低廉，是一种值得提倡的内参标准。格低廉，是一种值得提倡的内参标准。参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 虹鳟鱼红细胞标准样品：虹鳟鱼红细胞标准样品：鳟鱼血细胞的鳟鱼血细胞的DNA含量相当含量相当于人二倍体细胞于人二倍体细胞(人淋巴细胞人淋巴细胞)80%左右，由于其左右，由于其DNA含量于接近人含量于接近人的二倍体细胞，其计算比值产生的二倍体细胞，其计算比值产生的误差较小，鳟鱼红细胞的误差较小，鳟鱼红细胞DNA含含量均一量均一 参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 虹鳟鱼红细胞标准样品：虹鳟鱼红细胞标准样品：近年来，已有大量报道使用近年来，已有大量报道使用该细胞作为该细胞作为DNA定量检测的内参定量检测的内参标准或仪器校正的标准样品标准或仪器校正的标准样品参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 虹鳟鱼红细胞标准样品：虹鳟鱼红细胞标准样品：Vindelov等使用鳟鱼和鸡血细等使用鳟鱼和鸡血细胞作为双内参标准，比较了鳟鱼胞作为双内参标准，比较了鳟鱼细胞和鸡血细胞于二倍体细胞细胞和鸡血细胞于二倍体细胞DNA含量的技术比值，结果发现含量的技术比值，结果发现鳟鱼细胞二倍体细胞鳟鱼细胞二倍体细胞DNA比值误比值误差较小差较小参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品鸡血红细胞和鳟鱼红细胞鸡血红细胞和鳟鱼红细胞DNA含量比较：含量比较：表表1 鸡、鳟鱼不同性别红细胞鸡、鳟鱼不同性别红细胞DNA含量含量 细胞类别细胞类别 雄雄 雌雌 P值值 鸡红细胞鸡红细胞 100.0 96.3 0.001 鳟鱼细胞鳟鱼细胞 100.0 100.6 0.023参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 人淋巴细胞悬液：人淋巴细胞悬液：正常人外周血终淋巴细胞是一终末正常人外周血终淋巴细胞是一终末细胞，具有细胞核细胞，具有细胞核DNA含量均一，细胞含量均一，细胞体积大小一致，形态相似的特点体积大小一致，形态相似的特点参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 人淋巴细胞悬液：人淋巴细胞悬液：作为适用的调整流式细胞的生物性作为适用的调整流式细胞的生物性参考样品，并已被确认为一致可靠的二参考样品，并已被确认为一致可靠的二倍体细胞倍体细胞DNA含量的参考标准，在肿瘤含量的参考标准，在肿瘤细胞细胞DNA倍体的研究中，已广泛用于倍体的研究中，已广泛用于DNA倍体的计算标准倍体的计算标准参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 元鱼血细胞：元鱼血细胞：元鱼血细胞的核元鱼血细胞的核DNA含量相含量相对于人二倍体细胞的对于人二倍体细胞的70%左右，左右，其核其核DNA含量均一，形态大小一含量均一，形态大小一致，国内已有作者采用元鱼细胞致，国内已有作者采用元鱼细胞作为流式细胞仪的参考指标作为流式细胞仪的参考指标参考样本的制备方法参考样本的制备方法生物性标准样品生物性标准样品生物细胞标准样品生物细胞标准样品 元鱼血细胞：元鱼血细胞：其变异系数可达其变异系数可达1.8%左右，左右，远低于鸡血红细胞。其来源丰富，远低于鸡血红细胞。其来源丰富，制备简单，一只元鱼可取制备简单，一只元鱼可取10ml血血液，在液，在80oC冰箱终保存两年以冰箱终保存两年以上无任何变化，是理想的生物性上无任何变化，是理想的生物性内参标准细胞。内参标准细胞。DNA定量分析参考标准定量分析参考标准 Tiersch等选择了等选择了39种脊椎动种脊椎动物细胞，应用物细胞，应用FCM定量分析这定量分析这些动物二倍体细胞的些动物二倍体细胞的DNA含量，含量，用于用于DNA含量分析的参考标准细含量分析的参考标准细胞胞DNA定量分析参考标准定量分析参考标准DNA定量分析参考标准定量分析参考标准DNA定量分析参考标准定量分析参考标准标本采集标本采集:使用人末梢血白细胞，牛、狗、使用人末梢血白细胞，牛、狗、猪、鼠、马采用末梢血白细胞，其猪、鼠、马采用末梢血白细胞，其他动物均采用全血细胞，他动物均采用全血细胞，(这些动这些动物的全血细胞均为有核红细胞物的全血细胞均为有核红细胞)DNA定量分析参考标准定量分析参考标准标本采集标本采集:他们还提出他们还提出DNA含量的计算公含量的计算公式，式，DNA含量的单位以微微克或沙含量的单位以微微克或沙克克Pico gram.Pg 10-9/克来表示克来表示 DNA定量分析参考标准定量分析参考标准PG7.0(X/S)(S/H)7.0：二倍体淋巴细胞二倍体淋巴细胞DNA含量值含量值 X：实验细胞组方图中实验细胞组方图中G0/1期细胞期细胞 峰的均道值峰的均道值 H：人淋巴细胞人淋巴细胞G0/1峰细胞均道值峰细胞均道值 S：内参考标准细胞内参考标准细胞G0/1峰的均道值峰的均道值DNA定量分析参考标准定量分析参考标准Announcements:1 对于标准样品细胞对于标准样品细胞DNA含量的计含量的计 算，不能使用染色体条数计算算，不能使用染色体条数计算 DNA含量含量DNA定量分析参考标准定量分析参考标准Announcements:人类的二倍体细胞有人类的二倍体细胞有46条染色体条染色体(DNA含量为含量为7.0)，在东南亚有一种，在东南亚有一种小鹿仅有小鹿仅有6条染色体，但其二倍体条染色体，但其二倍体细胞细胞DNA含量与人二倍体细胞含量与人二倍体细胞DNA含量相似，家马的二倍体细胞染色含量相似，家马的二倍体细胞染色体为体为64条，但其二倍体条，但其二倍体DNA含量比含量比人的二倍体细胞还少约人的二倍体细胞还少约10%DNA定量分析参考标准定量分析参考标准Announcements:2 在使用标准样品的过程中，不同在使用标准样品的过程中，不同的染色和不同的固定剂都会出现不的染色和不同的固定剂都会出现不同的定量分析结果，人的淋巴细胞同的定量分析结果，人的淋巴细胞与鸡血红细胞，鳟鱼和元鱼红细胞与鸡血红细胞，鳟鱼和元鱼红细胞DNA含量的所测比值含量的所测比值DNA定量分析参考标准定量分析参考标准DNA定量分析参考标准定量分析参考标准Announcements:还有报道标准样品的保存温度和保还有报道标准样品的保存温度和保持时间也会对测定结果准确性产生持时间也会对测定结果准确性产生影响，因此在使用标准样品是应严影响，因此在使用标准样品是应严格遵照同样染色方法和固定方法格遵照同样染色方法和固定方法肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准 近年来，近年来，FCM应用最广泛，最应用最广泛，最多的领域是肿瘤细胞多的领域是肿瘤细胞DNA含量的定含量的定量研究，使肿瘤研究从定性研究提量研究，使肿瘤研究从定性研究提高到定量研究的分子学水平，并发高到定量研究的分子学水平，并发现现DNA含量这一参量与肿瘤的恶性含量这一参量与肿瘤的恶性分级，预后，治疗等有一定的关系分级，预后，治疗等有一定的关系肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准 因此，恶性肿瘤因此，恶性肿瘤DNA倍体的研倍体的研究成为近年肿瘤研究的最新进展之究成为近年肿瘤研究的最新进展之一，为准确地定量细胞一，为准确地定量细胞DNA含量，含量，人们发展使用一系列定量人们发展使用一系列定量DNA含量含量的标准样品的标准样品肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 FCM DNA定量研究早期，多以定量研究早期，多以新鲜组织细胞为定量分析的样品，使新鲜组织细胞为定量分析的样品，使用的用的DNA定量标准最多的是鸡红细胞定量标准最多的是鸡红细胞DNA含量作为内参考标准（含量作为内参考标准（35%)，后又使用了虹鳟鱼红细胞后又使用了虹鳟鱼红细胞DNA(80%)。我国学者宋平根等发展是用了鳖红细我国学者宋平根等发展是用了鳖红细胞胞DNA含量作为内参考标（含量作为内参考标（70%）肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 以上几种参考标准细胞既可作为以上几种参考标准细胞既可作为仪器的准直样品，又可作为仪器的准直样品，又可作为DNA定量定量的标准样品。但经过大量的研究实践的标准样品。但经过大量的研究实践后，人们发现使用上述标准样品定量后，人们发现使用上述标准样品定量DNA含量存在较大误差，在不同的正含量存在较大误差，在不同的正常组织的二倍体细胞常组织的二倍体细胞DNA含量之间，含量之间，在不同的实验室之间，都存在在不同的实验室之间，都存在DNA含含量分析结果的较大差异量分析结果的较大差异 肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 因此，为了使因此，为了使FCM DNA定量具定量具有更精确的可靠性和重复性，有必要有更精确的可靠性和重复性，有必要建立起建立起FCM DNA定量分析的质量检定量分析的质量检测标准测标准肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 1984年，在洛杉矶召开国际细年，在洛杉矶召开国际细胞分析学会胞分析学会,就就DNA含量分析的二倍含量分析的二倍体细胞标准作出了规定：在体细胞标准作出了规定：在DNA定定量分析时，一般应用同种同一个体量分析时，一般应用同种同一个体的正常细胞的正常细胞DNA含量作为二倍体细含量作为二倍体细胞的标准，禽、鱼类红细胞或荧光胞的标准，禽、鱼类红细胞或荧光微球只能作为仪器准直的标准样品微球只能作为仪器准直的标准样品 肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 因此，人的末梢血淋巴细胞被广因此，人的末梢血淋巴细胞被广泛用于泛用于DNA二倍体标准样品细胞，二倍体标准样品细胞，在很多肿瘤细胞在很多肿瘤细胞DNA倍体倍体FCM研究研究种，也使用了人的淋巴细胞、白细种，也使用了人的淋巴细胞、白细胞和单核细胞等胞和单核细胞等肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 随着随着FCM DNA定量研究工作的定量研究工作的深入，深入，FCM工作者发现人的淋巴细工作者发现人的淋巴细胞作为所有肿瘤细胞胞作为所有肿瘤细胞DNA倍体的标倍体的标准也存在较大误差，这给进一步深准也存在较大误差，这给进一步深入研究和学术交流造成很大困难入研究和学术交流造成很大困难肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准 1992年，由美国国立癌症研究中年，由美国国立癌症研究中心心,在亚特兰大组织召开了在亚特兰大组织召开了FCM DNA定量分析的统一标准的国际会议，制定量分析的统一标准的国际会议，制定了定了FCM DNA倍体的标准，严格使倍体的标准，严格使用用DNA二倍体标准样品二倍体标准样品DNA倍体标准的选择原则：倍体标准的选择原则：同种属，同个体，同样的正常细胞同种属，同个体，同样的正常细胞同样的样品处理方法，同样的固定同样的样品处理方法，同样的固定 方法，同样的染色方法，和样品细方法，同样的染色方法，和样品细 胞与胞与DNA标准细胞同步染色，即采标准细胞同步染色，即采 用内参考标准用内参考标准肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准DNA倍体标准的选择原则：倍体标准的选择原则：采用双内参标准即仪器准直标准细采用双内参标准即仪器准直标准细 胞和胞和DNA二倍体细胞同时按一定细二倍体细胞同时按一定细 胞比例加入实验细胞样品中去胞比例加入实验细胞样品中去肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准新鲜组织细胞新鲜组织细胞DNA倍体定量标准倍体定量标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 1983年，澳大利亚学者年，澳大利亚学者Hedley等首等首先报道了石蜡包埋组织单分散细胞悬先报道了石蜡包埋组织单分散细胞悬液的制备方法。该方法的建立，结束液的制备方法。该方法的建立，结束了了FCM DNA定量研究只能对新鲜肿瘤定量研究只能对新鲜肿瘤组织定量分析的时代，使大量存档的组织定量分析的时代，使大量存档的肿瘤标本得以进行肿瘤标本得以进行FCM DNA定量研究，定量研究，且在短期内可以收集到大量的标本且在短期内可以收集到大量的标本肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 并能结合恶性肿瘤病人的预后进行并能结合恶性肿瘤病人的预后进行回顾性的研究，使回顾性的研究，使FCM这一先进技术在这一先进技术在肿瘤临床中得到广泛应用，使传统的形肿瘤临床中得到广泛应用，使传统的形态病理学提高到分子病理学水平，将肿态病理学提高到分子病理学水平，将肿瘤的定性诊断推进到定量诊断阶段瘤的定性诊断推进到定量诊断阶段肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 大量的实验研究发现，石蜡包埋大量的实验研究发现，石蜡包埋肿瘤组织的肿瘤组织的DNA定量分析中，其定量分析中，其DNA二倍体标准使用存在的差异比二倍体标准使用存在的差异比新鲜组织更大新鲜组织更大 肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 Schutte等研究发现，用新鲜组等研究发现，用新鲜组织二倍体细胞或用末梢血淋巴细胞织二倍体细胞或用末梢血淋巴细胞以及用仪器准直标准作为石蜡包埋以及用仪器准直标准作为石蜡包埋肿瘤组织细胞肿瘤组织细胞DNA倍体标准更不合倍体标准更不合适，主要原因在于石蜡包埋组织的适，主要原因在于石蜡包埋组织的固定剂为固定剂为10%甲醛，如用甲醛，如用EB、PI等等荧光染色，甲醛固定剂对细胞荧光荧光染色，甲醛固定剂对细胞荧光染色有很强的干扰作用染色有很强的干扰作用 此外，正常组织细胞之间也存在此外，正常组织细胞之间也存在较大差异。较大差异。我们对各种石蜡包埋的我们对各种石蜡包埋的正常组织二倍体细胞正常组织二倍体细胞DNA含量进行含量进行了研究了研究肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 将人的淋巴细胞将人的淋巴细胞DNA含量作为计含量作为计算标准，将人的淋巴细胞分离出来后，算标准，将人的淋巴细胞分离出来后，进行石蜡包埋，以进行石蜡包埋，以70%乙醇固定的鸡乙醇固定的鸡血红细胞作为血红细胞作为DNA内参标准，采用内参标准，采用PI同步染色，结果发现，各种正常组同步染色，结果发现，各种正常组织细胞之间织细胞之间DNA含量存在较大的差含量存在较大的差异异肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准表表4 人类石蜡包埋正常组织二倍体细胞人类石蜡包埋正常组织二倍体细胞DNA含量分析含量分析正常组织类别正常组织类别 例数例数 DNA比值比值人淋巴细胞人淋巴细胞 5 2.930.13淋巴结细胞淋巴结细胞 30 2.910.16脾细胞脾细胞 10 2.870.13肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准表表4 人类石蜡包埋正常组织二倍体细胞人类石蜡包埋正常组织二倍体细胞DNA含量分析含量分析正常组织类别正常组织类别 例数例数 DNA比值比值扁桃体扁桃体 15 2.900.17口腔粘膜口腔粘膜 22 2.650.21食管粘膜食管粘膜 53 2.650.18胃粘膜胃粘膜 40 3.012.03 肠粘膜肠粘膜 25 3.010.16肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准正常组织类别正常组织类别 例数例数 DNA比值比值气管粘膜气管粘膜 17 2.880.14肺组织肺组织 22 2.770.13肾组织肾组织 10 2.810.15肾上腺肾上腺 5 3.110.27膀胱粘膜膀胱粘膜 25 2.790.14肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准正常组织类别正常组织类别 例数例数 DNA比值比值甲状腺甲状腺 8 3.060.19胰腺组织胰腺组织 6 3.030.21胸腺组织胸腺组织 8 2.960.11鼻咽粘膜鼻咽粘膜 13 2.820.17宫颈粘膜宫颈粘膜 38 2.760.12肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准正常组织类别正常组织类别 例数例数 DNA比值比值宫内膜宫内膜 20 2.810.16脑组织脑组织 18 2.840.18皮肤组织皮肤组织 23 2.560.13乳腺组织乳腺组织 25 2.740.15肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 各种正常组织细胞之间各种正常组织细胞之间DNA含量含量存在差异，推断可能由于各组织细胞存在差异，推断可能由于各组织细胞之间与荧光染料结合多少有密切关系，之间与荧光染料结合多少有密切关系，荧光染料与荧光染料与DNA结合取决于染色质的结合取决于染色质的结构和染色质的凝聚程度结构和染色质的凝聚程度 肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 例如例如7AAD(Aminoactionmycin，7氨基放线菌素氨基放线菌素)与不同的正常与不同的正常组织组织DNA二倍体细胞结合，测定的二倍体细胞结合，测定的DNA含量结果亦不同。例如精子细胞含量结果亦不同。例如精子细胞其染色质高度凝聚，象其染色质高度凝聚，象PI、EB、AO一些荧光染料不能与其一些荧光染料不能与其DNA结合，需结合，需经过酸或热变性处理后才能被染色经过酸或热变性处理后才能被染色肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准 鉴于石蜡包埋组织的二倍体标准鉴于石蜡包埋组织的二倍体标准细胞细胞DNA含量的定量结果差异较大含量的定量结果差异较大的特点，对的特点，对DNA二倍体标准的使用二倍体标准的使用更应强调更应强调同种、同个体、同源组织，同种、同个体、同源组织，最好在同一个石蜡包埋组织块中既有最好在同一个石蜡包埋组织块中既有正常组织又有肿瘤组织正常组织又有肿瘤组织肿瘤肿瘤DNA倍体标准倍体标准石蜡包埋肿瘤组织石蜡包埋肿瘤组织DNA倍体分析的标准倍体分析的标准30例不同时间石蜡包埋淋巴结细胞例不同时间石蜡包埋淋巴结细胞DNA含量含量分析分析