药学专业毕业论文-外文翻译(13).doc

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外文题目（原文）
Silver staining DNA in polyacrylamide gels

译文：
聚丙烯酰胺凝胶上DNA银染法
Silver staining DNA in polyacrylamide gels
Brant J Bassam1 & Peter M Gresshoff2
本文描述了一种简单但更优越的银染法，应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）之后的DNA片段以及其他有机分子显像。其灵敏度与同位素放射方法相当，能准确检测pg单位量范围内的DNA。该方法具有快速的优点（～1h），而且运用时主要是使用容易获得的化学物质和材料。为了达到预期的灵敏度和清晰度，高质量的试剂和洁净的操作显得尤为重要。虽然本文所描述的最新方法是基于Bassam et a方法的广泛使用，但是可提供更高对比度的图像，且可降低人为污染染色的风险。
介绍
用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离的复杂DNA样品和其他生物分子具有较高的分辨率，且该方法已被运用的非常广泛。然而，为了实现PAGE的潜在优点，我们还需要有一种能够提供更高清晰度和灵敏度的染色方法。基于这一点，本文描述的银染法符合这个要求。
作为一种染色方法，最初发展银染法的目的是为了检测PAGE分离后的蛋白质。之后，该方法被进一步优化，并应用于其他生物分子的检测，如核酸，脂多糖类，糖蛋白类和多糖类。但是这些早期方法的操作相对繁琐，且灵敏度有限。
Caetano-Anolle´s et al对于DNA指纹谱图放大技术（DAF）的发展要求一种更好的方法来充分地辨析和显像复杂的DNA图谱。这些要求直接导致聚酯—聚丙烯酰胺凝胶与DNA银染法相结合和发展。Bassam et al.单独地描述了为DAF而发展的银染法，该方法已经被广泛地接受，包括在商业领域（如GenePrint STR系统，美国的Promega公司的银后续产品）。
DNA（其他生物样品）银染法有如下优点：
第一，在正常环境光度下可进行图像的形成和显像。因此，该过程可以在实验室的工作台上进行操作，不用暗室或紫外照明设备。
第二，由凝胶板上银离子和生物分子直接结合所致的高灵敏度和高清晰度可使图像进行更容易的辨析。因此图形的显像主要是从该基色原而来，不会褪色和移位，这就能够用其他方法对凝胶进行二次处理，如荧光染色，放射自显影，激光，做成胶片或进行数码图像处理。
第三，银染法的灵敏度与放射自显影法相当，但可以避免辐射操作，减少图像成形时间和实验步骤。
第四，作为一种更好的选择，凝胶可放在半硬塑料薄膜衬垫上进行干燥，如GelBond PAG薄膜，这样可对最初的材料进行永久的记录（ref.10是一种修改后的方法）。空气干燥的凝胶具有弹性，能保存高染色度和高对比度的图像。这样的凝胶可长期保存不变形，进行图像处理和打印时无需添加额外费用。此外，保存的凝胶就如“分子档案”，因为染色的DNA条带是可以被提取出来，放大，克隆以及能进行后续操作的真正的DNA。
虽然本文所描述的方法是关于PAGE的DNA显像， 但是该方法也可以不做修改地用于其它生物分子的显像，如RNA，多糖类，脂多糖类 ，蛋白质和多肽类。就其所试用的范围来说该方法具有范围广的优点，因此该方法在应用时须给予足够的重视。凝胶板上杂散的污染指纹就如其它生物杂质掺合进入凝胶板一样。因此，使用高质量高纯度的试剂显得尤为重要，包括纯净的水。

1. 材料
1.1 试剂
冰醋酸，AR (ACS).关键：要获得高质量的结果，须用高纯度的试剂。
硝酸银晶体，AR（ACS）.关键：要获得高质量的结果，须用高纯度的试剂。
甲醛溶液，AR（ACS）.关键：要获得高质量的结果，须用高纯度的试剂。
硫代硫酸钠.关键：要获得高质量的结果，须用高纯度的试剂。
碳酸钠粉末，≥99.5%，ACS试剂.关键：要获得高质量的结果，须用高纯度的试剂。
乙醇
聚丙烯酰胺凝胶
定影液
显影液
显影终止剂
1.2设备
带龙头的塑料盛酸容器（普通实验室供给）
普通实验室手套，关键：无粉手套
摇床或轨迹震荡仪（普通实验室供给）
盛放银溶液容器（向沉淀的银中加入NaCl）（普通实验室供给）
垃圾清理工具，普通实验室供给
可选：为了把最初的凝胶完好地保存，我们用聚酯—聚丙烯酰胺凝胶进行，Bassam and Bentley描述的一种最新的方法。
循环水泵
第二代微型蛋白初产物仪
索尼DSC R1数码相机
1.3 试剂的制备
1.3.1 定影液：用去离子水将冰醋酸稀释至7.5%，室温保存(18－25 1C)。一个容积适合的带龙头塑料容器。定影液较稳定，可大量配制。注意：溶液有轻微的腐蚀性（家用食醋的浓度为5%），禁止吸入其蒸气。
1.3.2 甲醛溶液:向85ml的去离子水中加入15ml的甲醛。注意:该溶液的组成成分有毒性，应小心操作。参考当地职业健康与安全法规。关键：该溶液必须现配，确保甲醛在室温下保存，因为冷藏（如4℃）会失活。关键：在准备之前，须估量容器是否足够盛放要染色的凝胶的数量和大小。
1.3.3 银溶液：将0.1g的硝酸银溶入100ml的去离子水中。注意:该溶液的组成成分有毒性，应小心操作。参考当地职业健康与安全法规。关键：该溶液必须现配。关键：在准备之前，估计盛放准备染色的凝胶的容器的容积大小是否合适。
1.3.4 硫代硫酸钠存贮溶液：将0.2g的硫代硫酸钠溶入50ml的水中配制而成。关键：该溶液必须每周重配，所以每次尽量少量配制以免浪费。关键：在准备之前，须估量容器是否足够盛放要染色的凝胶的数量和大小。
1.3.5 显影液：将3g Na2CO3溶入100ml的去离子水中配制而成。为了加快溶解速度，避免凝集沉积，配置时缓缓加入Na2CO3并快速搅拌。关键：该溶液要用时须现配，并在～8℃条件下使用。因此，在使用前，监控好温度并将溶液倒入并外壁盛有冰块的烧杯里搅拌会使得使用更加方便。如果温度太低，将烧瓶放在热水龙头下冲洗回温。关键：在准备之前，须估量容器是否足够盛放要染色的凝胶的数量和大小。
1.3.6 显影终止剂：用去离子水将醋酸稀释至7.5%。用带有龙头的容器盛装，放在4℃的冰箱里保存。该溶液较稳定，可大量配制。注意：溶液有轻微的腐蚀性，禁止吸入其蒸气。关键：在准备之前，须估量容器是否足够盛放要染色的凝胶的数量和大小。
1.4 仪器配置
1.4.1 摇床:摇床是最常用最专业化的仪器。简单温和地摇动可使实验达到最优效果。这里并不推荐圆周运动，因为它不能将试剂均匀平整地分布到胶体表面。圆周运动会使试剂在凝胶周围旋转，导致中心区域相对停滞。
2. 步骤
2.1 固定
2.1.1选取一个干净，四周总面积比凝胶大～2cm的塑料染色盒。向染色盒中倒入足量纯净的固定液，至大约覆盖凝胶，并高出凝胶~5mm的高度。
2.1.2 小心地拆卸PAGE装置，把凝胶放入染色盒内。如果是聚酯底凝胶，凝胶面朝上。
2.1.3 在摇床上不断地摇动染色盒。对于～1mm的典型迷你胶来说，至少需要5分钟的固定时间，但固定10分钟可获得较好的对比度。如果使用更厚的凝胶，则可能需要更长的固定时间。这一步骤可能需要30分钟。关键步骤：固定对于染色灵敏度来说至关重要。它的主要功能是把DNA分子固定在丙烯酰胺凝胶板上，避免弥散和后续图像处理时的影像位移。它也能清除和中和化学杂质，如能干扰染色的尿素和缓冲液。
2.1.4 当凝胶在染色时，将凝胶装置和玻璃板清洗干净。然后，组装装置为下次制胶做准备。用96%的乙醇清洗组装好的装置来提高干燥度，再把装置放在无尘的环境中以备后用。
2.2 溶液配制
2.2.1 当凝胶在固定时，准备充足的显影液，至倒入染色盒时能覆盖并高出凝胶5mm高度的量。关键步骤：本方法中为下一步准备的该溶液和其他溶液应在此时配制，这样不仅能确保溶液的新鲜度，还能统筹俭省时间。（硫代硫酸钠溶液和显影终止剂可之前配制，且可在此时使用）
2.2.2 在显影液中以50μL/100ml的比例添加硫代硫酸钠溶液。
2.2.3 在4℃的冰箱中冷藏显影剂。
2.2.4 配制足够的甲醛溶液，至倒入染色盒时能覆盖并高出凝胶5mm高度的量。
2.2.5 配制足够的银溶液，至倒入染色盒时能覆盖并高出凝胶5mm高度的量。
2.3 清洗凝胶
2.3.1 固定之后，小心地将溶液倒出，不要碰到或损坏凝胶（或者用循环水泵将固定液抽出，使凝胶沉到底下）。
2.3.2 清洗凝胶，向染色盒中倒入去离子水，至覆盖并高出凝胶5mm的高度。
2.3.3 把染色盒放在摇床上不间断地摇晃2分钟。如果凝胶的厚度大于1mm，则需要更长的时间。如果清洗的时间过长（大于20分钟），则染色效果变差，条带清晰度不高。
2.3.4 清洗之后，如步骤10一样，小心地将溶液倒出。
2.3.5 用去离子水再清洗2遍。关键步骤：清洗步骤至关重要。该步骤能清除一些干扰染色的物质，如酸及其他一些微量物质，提供一个清晰，干净的背景。
2.4甲醛前处理
2.4.1 向染色盒中加入甲醛溶液，至覆盖并高出凝胶5mm的高度，然后放在摇床上振摇。1mm厚度的凝胶需要至少5分钟的甲醛前处理，但10分钟的处理能达到最佳对比度。如果使用更厚的凝胶，则需要更长时间的甲醛前处理。该步骤可能要花费30分钟。或者用Bassam et al.最初使用的方法，把甲醛前处理和银浸渍像结合起来来完成该步骤。可以在后面的预期结果中寻找例子。关键步骤：对于灵敏度和图像对比度来说，甲醛前处理至关重要。
2.4.2 甲醛前处理后，将溶液小心地倒出，不要碰到或损坏凝胶（或者用循环水泵将固定液抽出，使凝胶沉到底下）。
2.5银浸渍
2.5.1 向染色盒中加入银溶液，至覆盖并高出凝胶5mm的高度
2.5.2 放在摇床上振摇。～1mm厚度的凝胶一般20分钟可达到最佳效果。
关键步骤：在不影响灵敏度和对比度的情况下，银溶液浓度不应该低于本文所推荐的。多次银浸渍实验证明，一般在20分钟后到达最佳染色效果。然而，对灵敏度没有明显影响的高质量染色，一般振摇10分钟即可。浸渍次数的累计时间可达到60分钟，比会丢失一些图像的90分钟来说要好很多。
2.5.3 银浸渍后，将溶液小心地倒出，不要碰到或损坏凝胶。 注意：银溶液具有毒性，须小心操作。禁止溅出溶液，银溶液对于大部分物体表面都能长期不褪色。我们在Winchester玻璃容器中用NaCl将用过的银溶液中的银沉淀出来回收。（在容器中银沉淀为乳白色）
2.5.4 用100ml的去离子水清洗凝胶5～10秒。清洗时间不要超过15秒，因为该步骤会把银清洗掉。
2.6 图像显影
2.6.1 检查显影剂的温度是不是在4～10℃之间。向染色盒中加入显影剂溶液，至覆盖并高出凝胶5mm的高度。图像形成过程中要不断搅拌溶液，使溶液处于流动状态。一旦加入显影剂图像就开始形成。保持显影剂低温状态来控制图像形成的速度，温度高于10℃则反应速度就无法控制。根据凝胶的厚度，所用的试剂以及试剂的温度，图像形成一般需要3分钟。或者像最初的方法一样，向每100ml的显影液中加入600μL的甲醛溶液。这样能提高图像对比度，但是通常会增加背景和边缘的人为印记。可以在后面的预期结果中寻找例子。较薄的凝胶（～1mm）在室温下也可显像。可以在后面的预期结果中寻找使用室温试剂的例子。关键步骤：降低 Na2CO3的浓度会导致背景染色过深，对比度降低。低质量的试剂也会导致染色效果的下降。

2.7 终止反应
2.7.1 将显影液小心地倒出，不要碰到或损坏凝胶。
2.7.2 检查显影剂的温度是否在4℃左右。向染色盒中加入显影终止剂，至覆盖并高出凝胶5mm的高度。作为一种选择，室温下的显影终止剂一般可用于＜1mm的凝胶。然而，选择这种方法需要一定的练习，因为加入显影终止剂时图像还会持续形成几秒钟后才停止。可以在后面的预期结果中寻找例子。
2.7.3 凝胶要在显影终止剂中放置5-10分钟。关键步骤：显影终止剂含有7.5%的CH3COOH。禁止高浓度的CH3COOH，因高浓度的CH3COOH会引起图像褪色。如果显影速度过快，则马上终止反应，防止过度显影。根据这个原因，显影终止剂应在4℃下保存，这样能使它尽可能快的起作用——低温能降低显影的速度，能让酸有足够的时间起作用。掌握何时终止反应需要通过一定的练习，因为反应很容易过头。凝胶的背景呈淡橘黄色对实验无干扰，因为黑白照片或背光照明下该颜色基本消失。用平面观察灯检视凝胶，解读信息，用相片记录凝胶信息。
2.7.4 将显影终止剂倒出，用去离子水清洗凝胶。
2.7.5 如果有必要，可用照片记录凝胶。用夹子夹住聚丙烯酰胺凝胶的一角，凉一晚上。干燥的凝胶无毒性，能安全操作。染色染的好，图像将不会褪色或变暗，永久性记录实验（经作者的记录，15年的凝胶依旧完美）。但是，在一个极其干燥的环境中，凝胶会变得卷曲，易碎。因此，我们建议将凝胶保存在带有拉链的塑料袋里。
3. 问题与讨论
3.1 时间
步骤1～9，固定核酸，配制溶液：10～30分钟（同时操作）
步骤10～14，清洗凝胶：10～20分钟
步骤15和16，甲醛前处理：10～20分钟
步骤17～20，银溶液浸渍：20～90分钟
步骤21，图像形成，～3分钟
步骤22～26，终止反应：5～10分钟

3.2 问题与解决办法

问题
可能原因
解决方法
显影不清
低质量试剂
换成AR级试剂
显影不清
试剂过期
现配储备液
显影不清
低温储存，使甲醛液活性降低
适当储存，现配溶液
人为污染
粘印在凝胶上的指印，灰尘和其他生物材料或操作不当
戴手套，防其他物体触碰凝胶表面，直到图像形成
人为阴影
去污剂残留在电泳玻璃板上
用去离子水清洗电泳玻璃板，如必要，可用乙醇或盐酸清洗
人为表面污染
玻璃板上有污染物
用电泳玻璃板的同一面进行实验，用“F”标记该面
胶内污点
污点横穿胶体可能会阻止DNA条带的延伸。通常因为电泳缓冲溶液或溶液中有污染物
使用洁净的缓冲液或使用其他缓冲液
胶内污点
聚丙烯酰胺质量不高
检查丙烯酰胺和TEMED是否现配

表2 测试不同操作方法（a～f）。检查不同操作方法中的不同步骤。
其他方法
a*
b
c
d
e
f#
甲醛+银浸渍
√

单独进行甲醛前处理

50%，10分钟
100%，5分钟
100%，1分钟
100%，5分钟
100%，10分钟
单独进行银浸渍

√
√
√
√
√
显影液中加甲醛
√

4℃的显影终止剂
√
√

√
√
√
室温下图像的形成和终止

√

4. 结果
为了举例说明银染法的一些其他可能的选择，将聚酯—PAGE如描述中的那样进行操作。凝胶上有5条含有DNA标记物的泳道，4条泳道中含有从DAF实验得来的扩增产物。
将6组同样的DNA样品装填入2块凝胶中（每块胶上的3组样品用空白泳道隔开），在同一电泳仪中背对背同时电泳。
将聚酯—凝胶切成相同的片状，然后各用不同的方法进行处理。当图像达到最佳对比度时（用眼观察），终止显影反应。
所用的6种方法如表2 中所列，所得结果如数据1所示。
根据实验所用方法来分析新的数据，要求核酸的分离和显像。例如，就DNA映像来说，是根据具有不同的流动性或呈现性的无毒DNA条带来评价多态的DNA标记物，这些标记物可用来建立分离的分子标记物和表型之间的遗传连接。通过银染DNA条带的分离，再放大，克隆和DNA后续处理，实现了主导的标记方法向以PCR为基础的共同主导的标记方法的转变。DNA银染法也可运用到SSR标记法。或者使用大量分子标记的DNA指纹图谱可运用到一些需要鉴定种属的小生物样品的鉴定（是植物，动物，细菌还是真菌？）。可直接观看或处理后观看图像，然后依次进行定量关系的测定。
从干燥的银染PAGE凝胶中重新分离DNA，使得法医和证据档案的建立成为可能。作为电子档案或打印的图像与次级的图像进行对比。

数据1 聚丙烯酰胺凝胶电泳DNA银染分离任意的初始的DNA扩增产物：图像依次（a～f）展示了6种不同操作方法的结果，在表2中进行描述。5种不同的任意DNA样品被装载进入横穿2块凝胶的通道，同时在Mini-Protean II中电泳移动。为了使不同银染法能够直接进行比较成为现实，在染色和电泳之后将凝胶切成相同的部分。在同一时间段内，用相同设置的索尼数码相机对图像进行拍照。用Photoshop截取图像，调节色彩平衡和亮度，尽量与实物相近。保存的颜色信息显示染色所产生的不同色彩。不能进行其他图像处理。不能进行污染和损伤

有价值地运用该方法主要在于核实小分子核酸（20-30个核苷酸）。例如，我们已经按该方法用12.5%浓度的PAGE凝胶检测了商业供应的PCR引物。随着对其他小分子核酸的关注，如微小抑制剂和微型RNA，相信在未来的时间里该方法将会被运用的更加广泛。
本文所更新和优化的DNA银染法与之前的文章所述方法相比具有明显的优势。

参考文献
（略）

原文：