中药化学成分的一般研究方法四大谱.pptx

第第2 2章章 中药化学成分提取、分离和鉴定的一般研中药化学成分提取、分离和鉴定的一般研究方法究方法Rf（rate of flow）值值：溶剂从原点渗透到距离溶剂从原点渗透到距离a的时候，如果位于原的时候，如果位于原点的物质从原点向前移动到点的物质从原点向前移动到b，那么，那么b/a的值的值（0.01.0）就是这种物质的）就是这种物质的Rf值。值。例如把葡萄糖和果糖在例如把葡萄糖和果糖在20下于正丁醇下于正丁醇-醋酸醋酸-水（水（4 1 5）中展开，可分别得到）中展开，可分别得到0.18、0.23的的Rf值，在醋酸乙酯值，在醋酸乙酯-吡啶吡啶-水（水（2 1 1）中展开，则分）中展开，则分别得到别得到0.28、0.32的的Rf值。值。若滤纸、溶剂温度等保持恒定，则各种物质呈若滤纸、溶剂温度等保持恒定，则各种物质呈现特定的现特定的Rf值，成为鉴定物质的极重要的常数。值，成为鉴定物质的极重要的常数。ab平面色谱平面色谱柱色谱柱色谱从某植物中分得3个黄酮化合物（结构如下），根据其结构特点推测其在硅胶TLC和聚酰胺薄层上的Rf值大小。练习：练习：第6节 中药化学成分鉴定和结构研究简介l 化合物的纯度测定l 结构研究的主要程序l 结构研究的主要方法l 结构研究实例1.化合物的纯度测定l 物理常数物理常数 熔点熔点 明确、敏锐的熔点，熔距窄，在明确、敏锐的熔点，熔距窄，在1212左右左右 比比旋旋光光度度 比比旋旋光光度度仅仅决决定定于于物物质质的的结结构构，是是物物质质特特有有的的物物理常数。理常数。l 外观外观 晶形、色泽晶形、色泽l 色谱法色谱法 TLCTLC，三种展开系统中呈，三种展开系统中呈单一斑点单一斑点 利用利用HPLCHPLC、GCGC检测呈检测呈单一色谱峰单一色谱峰2.未知化合物结构研究的主要程序初步推断初步推断化合物类型化合物类型测定分子式，测定分子式，计算不饱和度计算不饱和度确定官能团、确定官能团、结构片断、骨架结构片断、骨架推断平面结构推断平面结构确定立体结构确定立体结构1.观察样品在提取、分离过程中的行为观察样品在提取、分离过程中的行为2.测定理化常数，如溶解度、色谱行为、定性反应等测定理化常数，如溶解度、色谱行为、定性反应等3.结合文献调研结合文献调研1.高分辨质谱（高分辨质谱（HR-MS）2.元素分析（元素分析（EA）+分子量测定分子量测定3.同位丰度比法同位丰度比法1.测定解析波谱数据测定解析波谱数据2.官能团定性定量分析官能团定性定量分析1.综合分析谱学数据及定性、定量分析结果综合分析谱学数据及定性、定量分析结果2.与已知化合物进行比较与已知化合物进行比较或化学沟通或化学沟通1.测定测定CD或或ORD2.测定测定NOE、NOESY或或2DNMR3.X射线衍射分析射线衍射分析4.人工合成人工合成元素分析元素分析从刺果甘草根中分得白色晶体，元素分析表明该白色晶体只含从刺果甘草根中分得白色晶体，元素分析表明该白色晶体只含C/H/O三种元素，元素定量分析结果如下：三种元素，元素定量分析结果如下：C:79.35；H：10.21。则：则：O元素的含量元素的含量=（100-79.35-10.21）=10.44三种元素在分子结构只含所占的比例：三种元素在分子结构只含所占的比例：C:79.35/12=6.61 H:10.21/1=10.21 O:10.44/16=0.65化合物分子结构中原子个数比为：化合物分子结构中原子个数比为：6.61:10.21:0.65=10.16:15.58:110:16:1该化合物实验式：该化合物实验式：C10H16O分子式（分子式（C10H16O）n n=1,2,3确定分子式确定分子式质谱法质谱法采用电子轰击质谱（采用电子轰击质谱（EI-MS）测得上述化合物的分子离子峰为）测得上述化合物的分子离子峰为456。则：则：MC10H16O=152n=456/152=3推出分子式（推出分子式（C10H16O）3 即即C30H48O3为刺果甘草皂苷元为刺果甘草皂苷元确定分子量确定分子量高分辨质谱（高分辨质谱（HR-MS）M=164u=-/2+/2+1:一价原子（如一价原子（如H、X）的数目）的数目:三价原子（如三价原子（如N、P）的数目）的数目:四价原子（如四价原子（如C、S）的数目）的数目O、S等二价原子与不饱和度无关，不予考虑。等二价原子与不饱和度无关，不予考虑。则则 C30H48O3的不饱和度为的不饱和度为u=30-48/2+1=7确定不饱和度确定不饱和度uUVIRMSH-NMRC-NMR2D-NMR确定官能团、结构片段和骨架确定官能团、结构片段和骨架结构研究的结构研究的主要方法主要方法紫外可见吸收光谱（紫外可见吸收光谱（UV-vis）l 定义定义分分子子中中的的电电子子因因一一定定波波长长的的光光线线照照射射从从低低能能级级跃跃迁迁至至高高能能级后产生了光谱。是一种电子光谱。级后产生了光谱。是一种电子光谱。其其中中由由吸吸收收紫紫外外光光或或可可见见光光引引起起的的-*-*、n-*n-*跃跃迁迁产产生的光谱为紫外可见光谱。生的光谱为紫外可见光谱。含含有有共共轭轭双双键键、，-不不饱饱和和羰羰基基结结构构的的化化合合物物以以及及芳芳香族化合物的分子有此特征光谱。香族化合物的分子有此特征光谱。3.结构研究的主要方法电子跃迁与电子跃迁与UV-vis光谱光谱藏茴香酮的藏茴香酮的UV光谱光谱具有相同骨架化合物的具有相同骨架化合物的UV光谱基本相同，光谱基本相同，但也会因取代的助色团，而产生差异。但也会因取代的助色团，而产生差异。l 相关的基本概念相关的基本概念吸收光谱（吸收曲线）吸收光谱（吸收曲线）：不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同。不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同。以波长对吸光强度作图。以波长对吸光强度作图。吸收光谱的特征吸收光谱的特征：定性依据定性依据吸收峰：吸收峰：1 1吸收谷：吸收谷：2 2肩峰：肩峰：3 3末端吸收：末端吸收：4 4饱和饱和n-n-跃迁产生跃迁产生 生色团：生色团：能吸收紫外能吸收紫外-可见光的基团可见光的基团有机化合物中：具有不饱和键和未成对电子的基团有机化合物中：具有不饱和键和未成对电子的基团例如：例如：C=C;C=O;C=N;-N=N-C=C;C=O;C=N;-N=N-中中:n n电子和电子和电子的基团产生电子的基团产生n-*n-*、-*-*跃迁，跃迁吸收的能量较小。跃迁，跃迁吸收的能量较小。当当出出现现几几个个生生色色团团共共轭轭，则则它它们们产产生生的的吸吸收收带带将将消消失失，并并出出现现新新的的共共轭轭吸收带，其波长将比单个生色团的吸收波长长，强度也增强。吸收带，其波长将比单个生色团的吸收波长长，强度也增强。助色团：助色团：本本身身无无紫紫外外吸吸收收，但但可可以以使使生生色色团团吸吸收收增增强强的的基基团团。同同时时，生色团波长长移。生色团波长长移。例如：连有杂原子的饱和基团例如：连有杂原子的饱和基团 -OH;-OR;-NH-;-NR2;-X-OH;-OR;-NH-;-NR2;-X 红移和蓝移：红移和蓝移：化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）化合物结构变化（共轭、引入助色团取代基）或采用不同溶剂后或采用不同溶剂后吸收峰位置向长波方向的移动为吸收峰位置向长波方向的移动为红移红移吸收峰位置向短波方向的移动为吸收峰位置向短波方向的移动为蓝移蓝移l 应用应用推断骨架，如含共轭体系（不饱和双键、芳香化合物）推断骨架，如含共轭体系（不饱和双键、芳香化合物）UV相同的化合物，不能确定为同一个化合物相同的化合物，不能确定为同一个化合物红外光谱（红外光谱（IRIR）l 定义分分子子的的振振动动-转转动动（即即分分子子中中价价键键的的伸伸缩缩及及弯弯曲曲振振动动）吸吸收收红红外外区区域域（4000-500cm4000-500cm-1-1）的的光光引引起起能能级级跃跃迁迁，测测得得的的图图谱谱为为红红外外光光谱。谱。红外光谱是分子光谱，反映功能团与波长的关系。红外光谱是分子光谱，反映功能团与波长的关系。如未知物与已知物如未知物与已知物IR完全一样，即可确定为此化合物。完全一样，即可确定为此化合物。3.结构研究的主要方法s-(-)-藏茴香酮的IR光谱C=O4000-1500cm4000-1500cm-1-1为特征区，为特征区，1500-500cm1500-500cm-1-1为指纹区。为指纹区。基团极性越大，红外光谱的吸收强度越大基团极性越大，红外光谱的吸收强度越大l应用应用 依据红外光谱，依据红外光谱，吸收峰的位置吸收峰的位置（即其振动频率）（即其振动频率）吸收峰位移吸收峰位移吸收峰的移动规律吸收峰的移动规律官能团（如苯环、羰基、羟基等）官能团（如苯环、羰基、羟基等）结构异构结构异构取代及构型、构象取代及构型、构象可由未知物各种官能团：可由未知物各种官能团：质谱（质谱（质谱（质谱（MSMS）3.结构研究的主要方法l 基本原理样样品品在在质质谱谱中中先先气气化化，然然后后被被离离子子源源电电离离失失去去电电子子，变变成成带带正正电荷的分子离子。电荷的分子离子。该该分分子子离离子子在在电电子子流流或或粒粒子子的的冲冲击击（轰轰击击或或撞撞击击）下下进进一一步步发发生键的断裂形成各种碎片离子。生键的断裂形成各种碎片离子。这这些些离离子子在在稳稳定定的的电电场场和和磁磁场场的的综综合合作作用用下下，按按照照质质荷荷比比（质质量和电荷之比量和电荷之比 m/z m/z）大小顺序被检测器记录下来。）大小顺序被检测器记录下来。所得图谱即为质谱。所得图谱即为质谱。EI-MS（电子轰击电离（电子轰击电离,electron impact ionization）测测定定时时先先加加热热气气化化，再再电电离离，易易热热分分解解或或难难气气化化的的化化合合物物，测测不不到到分分子子离子峰。离子峰。FD-MS（场解析电离（场解析电离,field desorption ionization）将将试试样样稀稀溶溶液液涂涂在在钨钨丝丝发发射射极极上上，通通过过真真空空密密封封系系统统进进入入离离化化室室作作为为阳阳极极，再再安安装装阴阴极极，加加10kV的的高高电电压压使使其其电电离离。适适用用于于热热不不稳稳定定、极极性性大大、难难挥挥发的化合物。但碎片信息少。发的化合物。但碎片信息少。FAB-MS（快原子轰击电离（快原子轰击电离,fast atom bombardment）从从离离子子枪枪射射出出的的一一次次离离子子经经加加速速后后在在碰碰撞撞室室通通过过交交换换电电荷荷，产产生生高高速速中中性性离离子子，该该中中性性离离子子撞撞击击试试样样即即可可使使之之电电离离，得得到到分分子子离离子子及及进进一一步步裂裂解解的的碎碎片。适用于糖苷类。弥补片。适用于糖苷类。弥补FD-MS的不足。的不足。桂皮酸乙酯EI-MS图Balanitin-1的FD-MS图在质谱中：在质谱中：横坐标横坐标为为m/z，纵坐标纵坐标为离子峰的相对强度。为离子峰的相对强度。质谱图谱中相对质谱图谱中相对强度最大的离子峰强度最大的离子峰称为基峰，其强度定为称为基峰，其强度定为100，其它其它 离子峰的强度分别以它们对基峰的相对强度百分比来表示。离子峰的强度分别以它们对基峰的相对强度百分比来表示。离子峰的强度与对应离子的数量成正比，离子峰的强度与对应离子的数量成正比，离子的数量越多，峰的强离子的数量越多，峰的强度越大。度越大。质谱中常见的几种离子峰质谱中常见的几种离子峰：分子离子峰分子离子峰 M+准分子离子准分子离子 M+H+、M-H+碎片离子峰碎片离子峰 同位素离子峰同位素离子峰，常出现在分子离子峰的右边，常出现在分子离子峰的右边1-2个质量单位，用个质量单位，用M+1、M+2表示。表示。l 应用应用 由碎片峰及裂解特征推定或复核分子的部分结构。由碎片峰及裂解特征推定或复核分子的部分结构。MS相同，可能为相同的化合物相同，可能为相同的化合物核磁共振氢谱（核磁共振氢谱（1 1H-NMRH-NMR）l 定义 化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的1H原子核吸收一定能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得。氢同位素中，1H丰度最大，信号灵敏，1H-NMR易测，应用广。l 应用 测定化学位移（0-20ppm）、积分面积（氢的数目）及偶合常数（氢与氢的关系），提供分子中氢的类型、数目及相邻原子或原子团的信息。3.结构研究的主要方法 化学位移（Chemical shift,）1H核因周围化学环境不同，其外围电子云密度以及绕核旋转时产生的磁的屏蔽效应也不同。不同类型的1H共振信号出现在不同区域，可识别。TMS：四甲基硅烷：四甲基硅烷 标准物质屏蔽效应强，共振信号在高场区（值规定为0）绝大多数吸收峰均出现在它的左边。结构对称，是一个单峰。容易回收（b.p.低），与样品不反应、不缔合。峰面积 由于1H谱上积分面积与分子中的总质子数相当，可知分子式，可据此算出每个信号所相当的1H数。偶合常数 磁不等同的两个或两组1H核在一定距离内会因相互自旋偶合干扰而使信号发生分裂，表现出不同的裂分，如singlet、doublet、triplet、quartet、multiple等。偶合通过化学键传递 相互偶合的H，其J值相同 一级图谱中的裂分遵循n+1规律不同类型氢核的化学位移3.结构研究的主要方法ORDORD（旋光谱，（旋光谱，（旋光谱，（旋光谱，Optical Rotatory Optical Rotatory DispersionDispersion）l 定义用不同波长的偏振光照射光学活性化合物，并用波长对比旋光度或摩尔旋光度作图所得的曲线。l 应用推断不对称分子的构型和构象。3.结构研究的主要方法CDCD（圆二色谱，（圆二色谱，（圆二色谱，（圆二色谱，Circular DichroismCircular Dichroism）l 定义 记录化合物在紫外光与可见光区所产生的椭圆偏振光的椭圆度与波长的关系。CD谱是透过介质后的光的吸收曲线，而ORD则是它的分散曲线。l 应用 测定手性化合物的构型、构象、确定某些官能团在手性分子中的位置等。3.结构研究的主要方法X X射线单晶衍射射线单晶衍射射线单晶衍射射线单晶衍射l 定义 通过测定化合物晶体对X射线的衍射谱，再通过计算机用数学方法解析衍射谱，再还原为分子中各原子的排列关系，最后获得每个原子在某一坐标系中的分布，给出化合物化学结构，获得分子的全貌，是一种很好的测定化合物分子结构的方法。同时还能测定出化合物结构中的键长、键角、构象、绝对构型等结构细节。l 应用 测定大分子物质结构。3.结构研究的主要方法小结：1.植物中存在的各类化学成分。2.各提取方法的原理及操作，重点溶剂法。3.各分离方法的原理及操作，重点萃取法、色谱法。4.结构研究的程序及四大光谱的原理及应用。思考题：1.选择题（1）中药成分最节省的提取方法是A.回流法B.渗漉法C.连续回流法D.浸渍法 E.煎煮法（2）常用溶剂中不能与水完全混溶的溶剂是 A.乙醇B.丙酮C.乙醚D.正丁醇E.氯仿2.问答题（1）常用提取方法有哪些？各有何优、缺点或适用情况？（2）试述各分离方法的原理及操作。