任务121谷氨酸生产菌模板.pptx

任务任务1-2谷氨酸生产菌谷氨酸生产菌1 12 23 34 4 谷氨酸生产菌谷氨酸生产菌国内谷氨酸生产菌特性比较国内谷氨酸生产菌特性比较谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化谷氨酸发酵的代谢控制育种策略谷氨酸发酵的代谢控制育种策略5 5 6 6 菌种的扩大培养及种子的质量要求菌种的扩大培养及种子的质量要求 菌种的保藏与复壮菌种的保藏与复壮一、谷氨酸生产菌种类与特征一、谷氨酸生产菌种类与特征一）现有谷氨酸生产菌的分类一）现有谷氨酸生产菌的分类 现有谷氨酸生产菌主要是棒现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌小杆菌属及节杆菌属中的细菌。属中的细菌。1.1.棒状杆菌属棒状杆菌属(CorynebacteriumCorynebacterium)直直到到微微弯弯的的杆杆菌菌，一一端端膨膨大大呈呈棒棒状状，折折断断分分裂裂形形成成“八八”字字形形或或栅栅状状排排列列。葡葡萄萄糖糖发酵产酸，发酵产酸，G G+2 2 短杆菌属短杆菌属(BrevibacteriumBrevibacterium)短的不分枝直杆菌。短的不分枝直杆菌。多数从葡萄糖发酵产酸，多数从葡萄糖发酵产酸，不发酵乳糖。不发酵乳糖。G G+3 3 小杆菌属小杆菌属(MicrobacteriumMicrobacterium)形态与棒状杆菌相似。形态与棒状杆菌相似。发酵葡萄糖产酸弱，主发酵葡萄糖产酸弱，主要产乳酸。要产乳酸。G G+4 4 节杆菌属节杆菌属(ArthrobacteriumArthrobacterium)培养过程中，细胞形态变化较大培养过程中，细胞形态变化较大球球菌菌 杆杆菌菌，杆杆菌菌 球菌。球菌。G G+G G-,G G-G G+能液化明胶，能液化明胶，从碳水化合物从碳水化合物产酸极少或不产酸极少或不产酸。产酸。二）谷氨酸生成菌的主要特征二）谷氨酸生成菌的主要特征（1 1）细胞形态球形、棒状以及短杆状。）细胞形态球形、棒状以及短杆状。（2 2）G G+，无芽孢、无鞭毛，不能运动。，无芽孢、无鞭毛，不能运动。（3 3）需氧型、生物素缺陷型微生物。）需氧型、生物素缺陷型微生物。（4 4）脲酶强阳性脲酶强阳性（5 5）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白）不分解淀粉、纤维素、油脂、酪蛋白以及明胶。以及明胶。（6 6）发酵中菌体发生明显的形态变化，同）发酵中菌体发生明显的形态变化，同时发生细胞膜渗透性的变化。时发生细胞膜渗透性的变化。（7 7）COCO2 2固定反应酶系活力强。固定反应酶系活力强。（8 8）异柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环）异柠檬酸裂解酶活力弱，乙醛酸循环弱。弱。（9 9）-酮戊二酸氧化能力微弱。酮戊二酸氧化能力微弱。（1010）NADPH2NADPH2进入呼吸链能力弱。进入呼吸链能力弱。（1111）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬）柠檬酸合成酶、乌头酸梅、异柠檬酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。酸脱氢酶以及谷氨酸脱氢酶活力强。（1212）能利用醋酸，不能利用石蜡。）能利用醋酸，不能利用石蜡。（1313）具有向环境中泄露谷氨酸的能力。）具有向环境中泄露谷氨酸的能力。（1414）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度）不分解利用谷氨酸，并能耐高浓度的谷氨酸，产谷氨酸的谷氨酸，产谷氨酸5%5%以上。以上。二、国内谷氨酸生产菌特性比较二、国内谷氨酸生产菌特性比较 1 1、形态特征、形态特征 短短杆杆至至小小棒棒状状，有有时时微微弯弯曲曲，两两端端钝钝圆圆，不不分枝，呈多种形态。分枝，呈多种形态。单个、成对及单个、成对及“V V”字形排列。字形排列。G+G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。胞内有横隔。不运动。无芽孢。一）北京棒杆菌一）北京棒杆菌(AS1299)(AS1299)的形态和生理特征的形态和生理特征2 2、培养特征、培养特征普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，24h24h白白色，色，48h48h淡黄色，中央隆起，表面湿润、淡黄色，中央隆起，表面湿润、光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，光滑，有光泽，边缘整齐且呈半透明状，无黏性，不产生水溶性色素。无黏性，不产生水溶性色素。3 3、生理特征、生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，不耐高温，41 生长较弱。pH的影响：Ph510均能生长，最适 pH67.5。还原硝酸盐：反映强烈。石蕊牛奶培养：7d后微产碱。不水解淀粉，不分解纤维素。对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖迅速产酸。生长因素试验：生物素是必需生长因素。硫胺素明显促生长。二）钝齿棒杆菌二）钝齿棒杆菌(AS1542)(AS1542)的形态和生理特征的形态和生理特征1 1、形态特征形态特征 短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝短杆至棒状，有时微弯曲，两端钝圆，不分枝。单个、成对及圆，不分枝。单个、成对及“V V”字形排字形排列。列。折断分裂。折断分裂。G G+。胞内有横隔。不运动。无芽孢。胞内有横隔。不运动。无芽孢。2 2、培养特征培养特征普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，近草黄色，表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较表面湿润、光滑，无光泽，边缘顿齿状，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。对氧的要求：兼性厌氧。与温度的关系：菌株2037 培养生长良好，不耐高温，42 不生长。pH的影响：pH69生长良好，pH10生长微弱，pH45已不能生长。还原硝酸盐：反映强烈。石蕊牛奶培养：7d后微产碱。水解淀粉，不分解纤维素。对尿素的耐力，2.6%以上生长受抑制。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵等迅速产酸。生长因素试验：生物素是必需生长因子。3 3、生理特征、生理特征三）天津短杆菌三）天津短杆菌(T613)(T613)的形态和生理特征的形态和生理特征典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍典型的短杆状，有时微弯曲，两端稍钝圆，不分枝。单个、成对及钝圆，不分枝。单个、成对及“V V”字形排列。折断分裂。字形排列。折断分裂。G G+。不运动。无芽孢。不运动。无芽孢。1 1、形态特征、形态特征2 2、培养特征、培养特征 普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅普通肉汁琼脂平板：菌落圆形，浅黄色，黄色，表面湿润、光滑，隆起，边缘表面湿润、光滑，隆起，边缘整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生整齐，较薄，半透明，无黏性，不产生水溶性色素。水溶性色素。3 3、生理特征、生理特征 对氧的要求：好氧及兼性厌氧。与温度的关系：菌株2637 培养生长良好，75 处理10min不再生长。pH的影响：pH610生长良好，pH5生长微弱，pH4和pH11已不能生长。还原硝酸盐：反映强烈。不水解淀粉，不分解纤维素。对尿素的耐力，5%以上生长受抑制。脲酶试验：强阳性反应。产酸物质的测定：G、果糖、甘露糖、蔗糖、麦芽糖、水杨苷、七叶灵 生长因素试验：生物素是必需生长因子。硫胺素是促生长作用。四）北京棒杆菌四）北京棒杆菌(7338)(7338)与钝齿棒杆与钝齿棒杆菌菌(B9)(B9)的比较的比较后提取容后提取容易，收率易，收率较高，质较高，质量较好量较好分泌色分泌色素较多素较多2.5 2.5 天津短杆菌天津短杆菌(T613)(T613)与钝齿杆与钝齿杆菌菌(B9)(B9)的比较的比较 T613T613感染感染噬菌体时，噬菌体时，不能换用不能换用B9B9，调换，调换7338.7338.三、谷氨酸生产菌的筛选三、谷氨酸生产菌的筛选什么是筛选？什么是筛选？如何筛选？如何筛选？1.1.采样采样在哪采？如何采？2.2.分离分离分离什么？3.3.初筛初筛鉴别！4.4.复筛复筛产量！5.5.发酵实验发酵实验黄色短杆菌黄色短杆菌北京棒杆菌北京棒杆菌杆状细菌四、菌种选育四、菌种选育谷氨酸菌体的选育方法主要有五谷氨酸菌体的选育方法主要有五种，种，自然选育、诱变选育、杂交自然选育、诱变选育、杂交选育、代谢控制选育和基因工程选育、代谢控制选育和基因工程选育。选育。一）自然选育一）自然选育以以基因自发突变基因自发突变为基础。为基础。有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种有利于谷氨酸产生菌保持纯系良种，使谷氨酸生产，使谷氨酸生产具有相对稳定性，提高发酵水平。具有相对稳定性，提高发酵水平。缺点：缺点：菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作菌体自身存在着修复机制和某些酶的校正作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作用，使得自发突变率极低，导致选育耗时长、工作量大、效率低。量大、效率低。也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工也称自然分离，是指对微生物细胞群体不经过人工处理而直接进行筛选的育种方法。处理而直接进行筛选的育种方法。二）诱变选育二）诱变选育 物理因素物理因素：紫外线、：紫外线、60Co、X射线、射线、-射线、快中射线、快中子、子、-射线、射线、-射线、超声波、射线、超声波、He-Ne激光辐照、激光辐照、离子束等。离子束等。化学因素：化学因素：氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺氮芥、亚硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、酸乙酯、亚硝基甲基脲、亚硝酸、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶等。溴尿嘧啶等。其它因素其它因素：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变：生物诱导因子，如噬菌体诱发抗性突变等。等。例：例：王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌王岁楼；张一震；李志。谷氨酸高产菌TZ-310TZ-310的诱变的诱变选育及其发酵的研究选育及其发酵的研究。中国调味品中国调味品，19971997年年 0909期期。摘要：以天津短杆菌摘要：以天津短杆菌-为出发菌株，经为出发菌株，经射线射线、紫外线紫外线和和硫酸二乙酯硫酸二乙酯复合诱变并经高温复合诱变并经高温驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。驯化，获得一株琥珀酸和生物素双营养缺陷型突变株。该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利该菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利用及耐高温（用及耐高温（）的优点。）的优点。原生质体融合原生质体融合就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作就是将两个亲株的细胞壁分别通过酶解作用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下用加以剥除，制得原生质体或原生质球，在高渗条件下混合，由聚乙二醇混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生质体凝集、融助融，促使原生质体凝集、融合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组，在再生细合，两个基因组之间接触、交换、遗传重组，在再生细胞中获得重组体。胞中获得重组体。三）杂交育种三）杂交育种杂交育种杂交育种常规杂交常规杂交原生质体融合原生质体融合谷氨酸产生菌的前处理谷氨酸产生菌的前处理因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不因为其有着特殊的细胞壁结构，对溶菌酶一般不敏感。敏感。方法：加入方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素）、甘氨酸、青霉素和和D-环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得疏环丝氨酸等，这些物质可以使细胞壁变得疏松，便于溶菌酶处理。松，便于溶菌酶处理。如，李蒲兴等将如，李蒲兴等将6株谷氨酸产生菌以株谷氨酸产生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同组合不同组合处理处理，对其原生质体形成进行比较，对其原生质体形成进行比较，在最佳条件下，原生质体在最佳条件下，原生质体形成率形成率可达可达95100。张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌张蓓等以谷氨酸产生菌天津短杆菌T6-13为出发菌株，获得了具有目的遗传为出发菌株，获得了具有目的遗传标记寡霉素抗性标记寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性和氟乙酸抗性(FEAr)的突变株的突变株TN63和和TN115。然后，。然后，分别以分别以TN63和和TN115为亲株，通过原为亲株，通过原生质体融合，获得了具有生质体融合，获得了具有Orm+FEAr标标记的融合子记的融合子FTN9108，其原生质体融，其原生质体融合频率为合频率为2.610-3。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr四）代谢控制选育四）代谢控制选育 以诱变育种为基础，获得以诱变育种为基础，获得各种解除或绕过微生物正各种解除或绕过微生物正常代谢途径的突变株，从常代谢途径的突变株，从而人为地使有用产物选择而人为地使有用产物选择性地大量生成积累。性地大量生成积累。Glu产生菌产生菌诱变育种诱变育种突变株突变株代谢控制发酵代谢控制发酵大量积累大量积累Glu1.选育耐高糖、高谷氨酸的菌株选育耐高糖、高谷氨酸的菌株 如选育在含如选育在含2030葡萄糖的平板上生长良好的葡萄糖的平板上生长良好的耐高糖突变株；耐高糖突变株；在含在含15 20味精的平板上生长良好的耐高谷氨味精的平板上生长良好的耐高谷氨酸突变株；酸突变株；在在20的葡萄糖加的葡萄糖加15味精的平板上生长良好的耐味精的平板上生长良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。高糖、耐高谷氨酸的菌株。2.选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断选育能强化谷氨酸合成代谢、削弱或阻断支路代谢的菌株支路代谢的菌株（1）选育不分解利）选育不分解利用谷氨酸的突变株用谷氨酸的突变株 选育在以选育在以谷氨酸为谷氨酸为唯一碳源唯一碳源培养基上培养基上不长或生长微弱的不长或生长微弱的突变株突变株。谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺鸟氨酸瓜氨酸精氨酸（2）选育强化）选育强化CO2固定反应的突变株固定反应的突变株 a.选育选育以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好以琥珀酸或苹果酸为唯一碳源，生长良好的的菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧菌株。因为细胞内碳代谢必须走四碳二羧酸的脱羧反应，该反应与反应，该反应与C02固定反应是相同酶所催化，固定反应是相同酶所催化，C02固定反应相应地加强。固定反应相应地加强。b.选育选育氟丙酮酸敏感氟丙酮酸敏感突变株。突变株。因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制因为氟丙酮酸是丙酮酸脱氢酶的抑制剂，即抑制丙酮酸向乙酰丙酮酸向乙酰CoA转化，相应地转化，相应地CO2固定反应加强。固定反应加强。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。突变株对氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.选育选育减弱乙醛酸循环减弱乙醛酸循环的突变株。的突变株。乙醛酸循环减弱不仅能使乙醛酸循环减弱不仅能使C02固定反应比例增大，固定反应比例增大，而且异柠檬酸也能高效率地转化为而且异柠檬酸也能高效率地转化为-酮戊二酸，再酮戊二酸，再生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突生成谷氨酸。常见的该突变株有琥珀酸敏感型突变株和不分解利用乙酸的突变株。变株和不分解利用乙酸的突变株。（3）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的）选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株突变株 有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性有酮基丙二酸抗性突变株、谷氨酸结构类似物抗性突变株和谷氨酰胺抗性突变株。突变株和谷氨酰胺抗性突变株。草酰乙酸草酰乙酸谷氨酸转氨酶谷氨酸转氨酶天冬氨酸天冬氨酸+-酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸-酮戊二酸酮戊二酸NH3谷氨酸脱氢酶谷氨酸脱氢酶（4）选育强化能量代谢的突变株）选育强化能量代谢的突变株 原因：使原因：使TCA循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速循环前一段代谢加强，谷氨酸合成速率加快。率加快。a.选育呼吸链抑制剂抗性突变株选育呼吸链抑制剂抗性突变株 如可选育丙二如可选育丙二酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来酸、氧化丙二酸、氰化钾、氰化钠抗性突变株来实现。实现。b.选育选育ADP磷酸化抑制剂抗性突变株磷酸化抑制剂抗性突变株 如可选育如可选育2,4-二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实二硝基酚、羟胺、砷、胍等抗性突变株来实现。现。c.选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株选育抑制能量代谢的抗生素的抗性突变株 如如可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。可选育缬氨霉素、寡霉素等抗性突变株来实现。（5）其它遗传标记）其它遗传标记 选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸选育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶类似物、抗核苷酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸类抗生素、异亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、缺陷、AEC抗性、抗性、AHV抗性、棕榈酰谷氨酸等突抗性、棕榈酰谷氨酸等突变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。变株，都可以不同程度地提高谷氨酸产量。3.选育能提高谷氨酸通透性的菌株选育能提高谷氨酸通透性的菌株（1）选育）选育生物素缺陷型生物素缺陷型菌株。菌株。（2）选育）选育油酸缺陷型油酸缺陷型菌株。菌株。（3）选育）选育甘油缺陷型甘油缺陷型菌株。菌株。（4）选育）选育温度敏感型温度敏感型突变株突变株 突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的突变位置发生在决定与谷氨酸分泌有密切关系的细胞膜细胞膜结构的基因结构的基因上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一上，发生碱基的转换或颠换，一个碱基为另一个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导个碱基所置换，这样为基因所控制的酶在高温下失活，导致细胞膜某些结构的改变。致细胞膜某些结构的改变。另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨另一个特点是在生物素丰富的培养基上也能分泌出谷氨酸。酸。(5)其它突变型菌株其它突变型菌株抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙抗药性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能酸缺陷型、棕榈酰谷氨酸敏感型突变株等，都能增增强谷氨酸的通透性强谷氨酸的通透性。五）基因工程选育五）基因工程选育 基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进基因工程育种是指利用基因工程方法对产生菌株进行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的行改造而获得高产工程菌，或者是通过微生物间的转基因而获得新菌种的育种方法。转基因而获得新菌种的育种方法。载体系统载体系统：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为：一般以质粒、噬菌体或转座子作为载体，尤以质粒为多。多。受体系统受体系统：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。：受体菌选用短杆菌属和棒杆菌属的野生菌或变异株。供体菌株供体菌株：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异：供体菌株选择短杆菌属及棒杆菌属的野生菌或变异株。株。工具酶：工具酶：切割供体切割供体DNA和载体和载体DNA的工具酶的工具酶限制性内切限制性内切核酸酶有许多种，核酸酶有许多种，Hind、Bcl I、Xba I和和Xam I效果最好。效果最好。载体系统载体系统 受体系统受体系统 供体菌株供体菌株 工具酶工具酶 谷氨酸产生菌的许多谷氨酸产生菌的许多关键酶的基因关键酶的基因已被已被克隆克隆，Ozaki等克等克隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，隆了谷氨酸棒杆菌的分枝酸变位酶和预苯酸脱水酶基因，通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了通过质粒载体导回谷氨酸棒杆菌，产量提高了50。周盛等从大肠杆菌周盛等从大肠杆菌E.coli k-12中通过中通过PCR克隆出克隆出磷酸果糖磷酸果糖激酶编码基因激酶编码基因(pfkA)，将其连到表达，将其连到表达载体载体，连接构建成重，连接构建成重组质粒组质粒pKu-1，转化转化谷氨酸棒杆菌谷氨酸棒杆菌B4，并得到表达；酶活，并得到表达；酶活性测定表明性测定表明pf-kA基因表达活力为基因表达活力为128.6o.86ug的蛋白。的蛋白。同时，转化子菌株对同时，转化子菌株对糖转化率糖转化率比比B4高高10.64，产酸率产酸率比比B4高高17.1。五、菌种保藏与复壮五、菌种保藏与复壮保藏原理：挑选优良品种，抑制微生物的代谢活性，创造休眠环境。保藏要求：保持菌种优良特性，经济方便。保藏后使用前需再次检测和确定保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)。一）保藏方法(1)低温冷冻保藏；(2)转接培养或斜面传代保藏；(3)矿物油保藏；(4)土壤或陶瓷珠等载体干燥保藏。(1)低温冷冻保藏-20以下冷冻，使微生物代谢活动停止以下冷冻，使微生物代谢活动停止分类：普通冷冻保藏分类：普通冷冻保藏(-20)超低温冷冻保藏超低温冷冻保藏(-60一一-80)冻干保藏冻干保藏 液氮冷冻保藏液氮冷冻保藏特点：简单有效特点：简单有效 培养物运输较困难培养物运输较困难超低温冷冻保藏超低温冷冻保藏(-60-80)超低温冰箱的冷冻速度一般控制在超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2min。一些细菌和真菌菌种可保藏一些细菌和真菌菌种可保藏5年而活力不受影响。年而活力不受影响。冻干保藏冻干保藏 是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此是通过在减压条件下使冻结的细胞悬液中的水分升华，使培养物干燥。此法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。法是微生物菌种长期保藏的最为有效的方法之一。特点：特点：冻干状态下一般可保藏冻干状态下一般可保藏10年不丧失活力。冻干后的菌株可常温保存，便于运年不丧失活力。冻干后的菌株可常温保存，便于运输。输。必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等。必须使用冷冻保护剂，常用脱脂乳、蔗糖等。液氮冷冻保藏液氮冷冻保藏此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体及动物细胞均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是缺点是需要特殊设备（2）传代保藏）传代保藏斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用。斜面培养基，平行传代，普通冰箱，三个月以下保存，供试验用。（3）矿物油保藏）矿物油保藏将琼脂斜面培养物直立浸入矿物油中于将琼脂斜面培养物直立浸入矿物油中于46下保藏，简便有效，下保藏，简便有效，可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别用于难以冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌。干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌。保存时间保存时间12年。年。（4）载体保藏）载体保藏麦壳，砂土灭菌后可用作载体,培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液,注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于46或室温进行保存的一种菌种保藏方法。多用于产抗生素菌种。保藏时间210年。二）菌种衰退二）菌种衰退二）菌种衰退二）菌种衰退衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在，出现某 些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。衰退的表现：生长，代谢（产品）衰退的原因：保藏不妥，连续传代，回复突变等防止衰退的方法：合理培养条件，减少传代次数复壮：使衰退的菌种回复原来的性状。纯种分离：平板划线、稀释平板法、涂布法通过寄主体内生长进行复壮：对寄生性菌株淘汰已衰退个体：不良理化条件，淘汰弱菌株狭义的复壮狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和生产性能测定等方法，从衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复壮广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常进行纯种的分离和生产性能测定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变（正变）不断地从生产中选种。三）菌种的复壮纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等）。取法等）。通过寄主体内生长进行复壮（通过寄主体内生长进行复壮（如如杀螟杆菌的杀螟杆菌的复壮）；复壮）；淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）。以杀死生命力较差的已衰退个体）。联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍联合复壮，用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍联合处理联合处理菌种的复壮措施菌种的复壮措施菌种的复壮措施菌种的复壮措施