凝胶电泳.pptx

一、凝胶电泳一、凝胶电泳它是一种分析鉴定重组它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。也是分子生物学研究方法的技术基础。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳脉冲电场凝胶电泳1、基本原理、基本原理带有负电荷的带有负电荷的DNA或或RNA核苷酸链，依靠无反核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负在电场中以一定的迁移率从负极移向正极极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。将其混合物中的不同成分彼此分开。DNA的迁移速率决定因素的迁移速率决定因素1DNA分子的大小分子的大小双链双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成反比；反比；2琼脂糖浓度琼脂糖浓度浓度越低，相同核酸分子迁移越快；浓度越低，相同核酸分子迁移越快；3DNA的构象的构象一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。一般同一分子：超螺旋环状线状切口环状。4凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭凝胶和电泳缓冲液中的溴化乙锭溴化乙锭（溴化乙锭（EB）插入双链）插入双链DNA造成其负电荷减少、刚性和造成其负电荷减少、刚性和长度增加。长度增加。5所用的电压所用的电压低电压时低电压时DNA片段迁移率与所用的电压成正比。片段迁移率与所用的电压成正比。6琼脂糖种类琼脂糖种类常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；常见的有两种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖；凝胶电泳的分辨力：凝胶电泳的分辨力：与凝胶的类型和密度相关与凝胶的类型和密度相关琼脂糖凝胶的分辨力在琼脂糖凝胶的分辨力在0.250Kb之间之间;聚丙烯酰胺的分辨力在聚丙烯酰胺的分辨力在11000bp之间之间Separation Range Vs.%AgaroseLowGelingAgarose4-60.02-0.4 不同类型琼脂糖的性质不同类型琼脂糖的性质琼脂糖类型琼脂糖类型凝结温度凝结温度/熔化温度熔化温度/标准琼脂糖标准琼脂糖35389095不同厂家不同厂家生产的不生产的不同商品其同商品其凝结温度凝结温度和熔化温和熔化温度有一定度有一定差异差异40428590高强度琼脂糖高强度琼脂糖34438595修饰的低熔点修饰的低熔点/凝点琼脂糖凝点琼脂糖253563653565超低熔点超低熔点8154045低黏性低熔点琼低黏性低熔点琼脂糖脂糖25307038853075AgaroseGelElectrophoresis琼脂糖（琼脂糖（agarose）是一种从红色海藻中提）是一种从红色海藻中提取出的线性多糖聚合物。取出的线性多糖聚合物。半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷2、琼脂糖凝胶电泳、琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作琼脂糖链依分子内和分子间氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。凝胶。凝胶。凝胶。D-D-半乳糖半乳糖3 3，6-6-脱水脱水-L-L-半乳糖半乳糖 琼脂糖凝胶的特点琼脂糖凝胶的特点（一）优点（一）优点（一）优点（一）优点1.1.因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗因不含硫酸根和羧基，几乎消除了琼脂的电渗2.2.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。3.3.凝凝凝凝胶胶胶胶结结结结构构构构均均均均匀匀匀匀，孔孔孔孔径径径径较较较较大大大大，可可可可用用用用来来来来分分分分离离离离酶酶酶酶的的的的复复复复合合合合物、核酸、病毒等大分子物质。物、核酸、病毒等大分子物质。物、核酸、病毒等大分子物质。物、核酸、病毒等大分子物质。4.4.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。5.5.不不不不吸吸吸吸收收收收紫紫紫紫外外外外光光光光，可可可可直直直直接接接接利利利利用用用用紫紫紫紫外外外外光光光光吸吸吸吸收收收收法法法法作作作作定定定定量量量量测定测定测定测定6.6.有热可逆性有热可逆性有热可逆性有热可逆性（二）缺点（二）缺点（二）缺点（二）缺点1.1.机械强度差，易破碎，浓度不能太低。机械强度差，易破碎，浓度不能太低。机械强度差，易破碎，浓度不能太低。机械强度差，易破碎，浓度不能太低。2.2.易被细菌污染，不易保存，临用前配制。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。易被细菌污染，不易保存，临用前配制。3.3.琼琼琼琼脂脂脂脂糖糖糖糖支支支支持持持持层层层层上上上上的的的的区区区区带带带带易易易易于于于于扩扩扩扩散散散散，电电电电泳泳泳泳后后后后必必必必须须须须立立立立即固定染色。即固定染色。即固定染色。即固定染色。4.4.与与与与PAGEPAGE相比，分子筛作用小，区带少。相比，分子筛作用小，区带少。相比，分子筛作用小，区带少。相比，分子筛作用小，区带少。分为常熔点的琼脂糖和低熔点（分为常熔点的琼脂糖和低熔点（LMP）琼脂糖。）琼脂糖。（1）LMP琼脂糖琼脂糖熔点：熔点：6265熔解后，在熔解后，在37可保持液态数小时；在可保持液态数小时；在25可可保持液态约保持液态约10min回收回收DNA操作：将凝胶在操作：将凝胶在65下加热数分钟，再下加热数分钟，再向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提向液态琼脂糖中加入过量酚液抽提DNA，经离心，经离心获得含获得含DNA分子的上清液，酶切分子的上清液，酶切DNA片段后电泳。片段后电泳。（2）琼脂糖凝胶电泳的参数：）琼脂糖凝胶电泳的参数：缓冲液：缓冲液：1TAE（TBETPE）凝胶的含量：根据检测的凝胶的含量：根据检测的DNA大小大小加加DNA样品：样品：1g，指示剂，指示剂溴酚蓝电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间短时间(5V/cm)（2）琼脂糖凝胶电泳的参数：）琼脂糖凝胶电泳的参数：染色和观察：溴化乙锭（染色和观察：溴化乙锭（ethidiumbromide，EB）染色，在）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成波长的紫外下观察（凝胶成像仪），像仪），能看到能看到0.05g的微量的微量DNADNA的片断大小与荧光强度成正比的片断大小与荧光强度成正比操作预染色的标本预染色的标本预染色的标本预染色的标本 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 Sample Well 25 ng 1 kb ladder0.8%Agarose124681012kbAgarose Gel ElectrophoresisEtBr Detection Limit:5-10 ng DNAAgarose gel electrophoresisAgarose gel electrophoresis【注意事项】1.琼脂糖融化时，档位不宜太高。琼脂糖融化时，档位不宜太高。2.制胶和加样过程中要防止气泡的产生。制胶和加样过程中要防止气泡的产生。3.EB具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格具有强诱变性，可致癌。必须戴手套操作，严格注意防护。注意防护。4.加样时，加样时，Tip头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶头不宜插入样品孔太深，也不要穿破胶孔壁，否则样品渗漏或孔壁，否则样品渗漏或DNA带型不整齐。带型不整齐。5.电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。电源接通时，应核实凝胶的方向是否正确。6.电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，电泳仪有电压显示，并不一定标志电泳槽已接通，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，应观察电极气泡出现情况。负极的气泡比正极多一倍，表示电泳已开始。表示电泳已开始。7.溴化乙锭可插入到溴化乙锭可插入到DNA分子的双链中，在紫外光的分子的双链中，在紫外光的照射下，插入溴化乙锭的照射下，插入溴化乙锭的DNA呈橙红色荧光，所以溴呈橙红色荧光，所以溴化乙锭可以作为荧光指示剂指示化乙锭可以作为荧光指示剂指示DNA含量和位置。含量和位置。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳PolyacrylamideGelElectrophoresis，PAGE-原理原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简，简称称Acr)和交联剂和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称，简称Bis)在加速剂在加速剂N，N，N，N 四甲基乙二胺四甲基乙二胺(N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，简称，简称TEMED)和催和催化剂过硫酸铵化剂过硫酸铵(ammoniumpersulfate(NH4)2S2O8，简称简称AP)或核黄素或核黄素(ribofavin即即vitaminB2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis，简称，简称PAGE)。丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺原理聚丙烯酰胺凝胶三维结构聚丙烯酰胺凝胶三维结构聚丙烯酰胺凝胶电泳种类聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1变性聚丙烯酰胺凝胶变性聚丙烯酰胺凝胶用于单链用于单链DNA片段的分离或纯化。片段的分离或纯化。变性的变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱在这些凝胶中的迁移率几乎与其碱基组成及序列完全无关。基组成及序列完全无关。用途：放射性用途：放射性DNA探针的分离、探针的分离、DNA测序反应等。测序反应等。2非变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶用于双链用于双链DNA片段的分离和纯化。片段的分离和纯化。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。注：迁移率受其碱基组成和序列的影响。用途：制备高纯度的用途：制备高纯度的DNA片段。片段。（三）（三）DNADNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围丙烯酰胺浓度丙烯酰胺浓度（%）有效分离范围有效分离范围（bp）二甲苯氰二甲苯氰FF溴酚蓝溴酚蓝3.5100020004601005.080500260658.0604001604512.040200702015.025150601520.061004512注注:N,N-:N,N-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/301/30;Home图图.1 .1 夹心垂直板电泳槽示意图夹心垂直板电泳槽示意图 1.1.导线接头导线接头 2.2.下贮槽下贮槽 3.3.凹形橡胶框凹形橡胶框 4.4.样品槽模板样品槽模板 5.5.固定螺丝固定螺丝 6.6.上贮槽上贮槽7.7.冷凝系统冷凝系统图图.2 .2 凝胶模示意图凝胶模示意图1.1.样品槽模板样品槽模板 2.2.长玻璃板长玻璃板3.3.短玻璃板短玻璃板 4.4.凹形橡胶框凹形橡胶框 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）的原理）的原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠钠(sodiumdodecylsulfate,简称简称SDS)，则蛋白质分子，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。因此可和形状无关。因此可以利用以利用SDS-PAGE测定蛋白质分测定蛋白质分子量子量。3、聚丙烯酰胺凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳Polyacrylamide Gel Electrophoresis，PAGE缓冲液：缓冲液：TBE凝胶聚丙烯酰胺电泳：凝胶聚丙烯酰胺电泳：丙稀酰胺丙稀酰胺/亚甲双丙稀酰胺（亚甲双丙稀酰胺（29：1）；）；TEMED（四甲基乙二胺，加速剂）（四甲基乙二胺，加速剂）过硫酸铵（过硫酸铵（10，催化剂，催化剂）。）。垂直板垂直板电泳装置电泳装置加样加样样品迁样品迁移方向移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带孔胶带孔胶按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向电泳电泳小分子小分子大分子大分子夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶电泳电泳缓冲液缓冲液电泳电泳缓冲液缓冲液加在槽中的经加在槽中的经SDS处理的样品处理的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片水平式电泳装置水平式电泳装置电泳缓冲液电泳缓冲液凝胶凝胶 PAGE PAGE 的的 特特 点点1.1.具有分子筛效应，分辨率高具有分子筛效应，分辨率高2.2.样品不易扩散，用量少，灵敏度可达样品不易扩散，用量少，灵敏度可达1010-6-6g g3.3.化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具化学性质稳定，分子结构中富含酰胺基具有稳定的亲水基团有稳定的亲水基团4.4.凝胶不带电荷，消除了电渗现象凝胶不带电荷，消除了电渗现象5.5.机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内机械强度好，有弹性，在一定浓度范围内无色透明无色透明6.6.网孔可调节网孔可调节 4、脉冲电场凝胶电泳（、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）1984年，年，D.R.Cantor发明的。发明的。分离超大分子量的分离超大分子量的DNA分子分子。在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成脉冲电场方向与核酸的移动方向成45度角，下一度角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45度角。度角。B+A-+A-B脉冲电场电泳示意图脉冲电场电泳示意图脉冲场凝胶电泳原理图脉冲场凝胶电泳原理图 北北 南南 脉冲场电泳脉冲场电泳常规电泳常规电泳两组电极，排列不均匀两组电极，排列不均匀;一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，一组电极，电场方向不变，电极排列均匀，定时改变电场方向，定时改变电场方向，DNA分子的净分子的净DNA移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与电场方向相同。整个电泳移动方向与两电场呈移动方向与两电场呈45o，在电泳过，在电泳过过程保持电压稳定。常规方法制备过程保持电压稳定。常规方法制备DNA程中，电压有时可随时间的增加而样程中，电压有时可随时间的增加而样品增加，品增加，制备制备DNA样品与常规方法样品与常规方法不同不同4、脉冲电场凝胶电泳（、脉冲电场凝胶电泳（PFGE）由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。胶孔隙的无规则变化。与分子量小的与分子量小的DNA分子相比，分子量大的分子相比，分子量大的DNA分分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量了分离大分子量DNA分子的目的。分子的目的。PFGE can resolve large DNA fragments类型类型垂直脉冲场电泳系统垂直脉冲场电泳系统(verticalpulsedfield)场翻转系统场翻转系统(fieldinversion)旋转胶系统旋转胶系统(rotatinggel)箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统(contour-clampedhomogeneouselectricfield)动态调控闭合均一电场动态调控闭合均一电场电泳电泳A-+AB-+B垂直交变电场系统垂直交变电场系统场翻转系统场翻转系统箝位匀强电场系统箝位匀强电场系统旋转胶系统旋转胶系统A-+AB-+BA-+AB-+B-+影响分辨率的因素影响分辨率的因素1 1 脉冲时间脉冲时间（0.1s-1000s)0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较增加脉冲时间分离较大分子，减少脉冲时间分离较小分子。大分子，减少脉冲时间分离较小分子。2 2 电压：电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了若固定脉冲时间，增加电场强度就增大了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度会导致较小片段泳动的紊乱。致较小片段泳动的紊乱。3电场夹角：电场夹角：电场方向的夹角常为电场方向的夹角常为1100-1200，研究证实研究证实900夹角也非常有效的。夹角也非常有效的。4温度：温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE一般应在一般应在4进行。较高的温度进行。较高的温度DNA泳动较快；但是较高的温度也引起较小片泳动较快；但是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显的条带变宽。段的泳动截留和明显的条带变宽。种类种类1)按凝胶材料分按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼普通琼脂糖和低熔点琼脂糖脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分按电泳装置分:水平式水平式/琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶;竖式竖式/聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶3)两种方法比较：分离效果和分离范围两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易操作难易2.用途用途琼脂糖凝胶用于琼脂糖凝胶用于DNA和和RNA的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶的常规分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序制胶制胶点样点样电泳电泳染色染色观察观察DNA电泳电泳1.DNA分子种类分子种类1)线线状状DNA单单链链与与双双链链，ss-DNA电电泳泳时时要要注注意意局局部部区区域域形形成成ds-DNA，造成迁移距离不确定，造成迁移距离不确定2)环状环状DNA单链（如单链（如M13mp）和双链（质粒）和双链（质粒DNA）3)线状线状ds-DNA电泳电泳使用频率最高的一种电泳使用频率最高的一种电泳这类这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素的影响：素的影响：i.分子量分子量的大小的大小:迁移距离与分子量的迁移距离与分子量的常用对数常用对数成反比成反比ii.凝胶浓度凝胶浓度:浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNAiii.电压电压:低电压时，迁移率与低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，电压成正比；电压增高时，不同大小不同大小DNA片段迁移率片段迁移率增大是不同的。增大是不同的。iv.碱基组成与温度碱基组成与温度:不受影响不受影响,温度高可导致温度高可导致DNA带变形带变形或解链。或解链。4)环状环状ds-DNA电泳电泳:常用于质粒常用于质粒DNA的初步鉴定的初步鉴定5)线状线状ss-DNA电泳电泳链分离凝胶链分离凝胶：化学定序时，用于单链分离。：化学定序时，用于单链分离。DNA双链互补，双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。变性双链，两条单链。核酸定序凝胶核酸定序凝胶(染料指染料指示剂示剂)：为避免局部区域产：为避免局部区域产生二级结构，可采用各种生二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）甲胺等）RNA凝胶电泳凝胶电泳 方法：不同的方法：不同的RNA电泳方法是依据使电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程中也保持一级结构。而且在整个电泳过程中也保持一级结构。1.乙二醛乙二醛/二甲基亚砜法二甲基亚砜法原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作碱基的互补作用发生用发生步骤：步骤：RNA+10mM羟甲基醛和羟甲基醛和50%DMSO混合混合50、1h变性变性点样点样电泳电泳染色染色观察观察2.羟甲基汞法羟甲基汞法原理：羟甲基汞可与原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤：步骤：RNA+10mM羟甲基醛羟甲基醛点样在含点样在含4mM羟甲基醛的羟甲基醛的琼脂糖凝胶上琼脂糖凝胶上电泳电泳染色观察染色观察3.甲醛法甲醛法步骤：步骤：RNA+2.2M甲醛甲醛+50%甲胺甲胺点样在含点样在含2.2M甲醛琼脂甲醛琼脂糖凝胶上糖凝胶上MOPS缓冲液电泳缓冲液电泳染色观察染色观察其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳电泳.4.三种方法的比较三种方法的比较第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样样品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收品用于体外翻译效果不好。第二、三种方法的反应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。有毒。蛋白质电泳蛋白质电泳方方法法：变变性性与与非非变变性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳，前前者者常常称称之之为为SDS-PAGE。差别：有无变性剂。差别：有无变性剂用用途途：非非变变性性凝凝胶胶可可用用于于蛋蛋白白质质的的分分离离纯纯化化过过程程中中，可可直直接接用用于酶促反应（颜色变化）于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可可用用于于蛋蛋白白质质分分子子量量、亚亚基基组组成成的的测测定定。mRNA翻翻译产物，基因表达产物测定等。译产物，基因表达产物测定等。核酸片段的分离与回收核酸片段的分离与回收1.方法方法用于用于DNA、RNA以及蛋白质的回收以及蛋白质的回收1)电洗脱法电洗脱法:利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它利用电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；介质中；2)滤纸法滤纸法核酸凝胶染色核酸凝胶染色长波紫外光确定位置长波紫外光确定位置在在分离带前方切一口子并插入滤纸条分离带前方切一口子并插入滤纸条(其背面覆盖透析袋膜其背面覆盖透析袋膜)电泳至电泳至DNA带全部进入滤纸条带全部进入滤纸条洗脱洗脱DNA纯化、沉纯化、沉淀淀3)透析袋法透析袋法切下含切下含DNA带琼脂块带琼脂块放入透析袋，封口放入透析袋，封口放入电泳槽放入电泳槽电泳电泳23小时至全部小时至全部DNA离开凝胶块离开凝胶块反向电泳反向电泳1分钟分钟取出取出DNA液液纯化、沉淀纯化、沉淀4)冻融法冻融法5)酶解法酶解法待回收待回收DNA切口切口DNA切口切口凝胶块凝胶块 滤纸法滤纸法透析袋透析袋 凝胶块凝胶块 待回收待回收DNA DNA 透析袋法透析袋法 待回收待回收DNA 凝胶块凝胶块 V-型槽型槽电洗脱槽法电洗脱槽法 回收回收DNA方法方法 影响回收率的因素影响回收率的因素1）DNA分子大小分子大小回收率与分子量大小呈负相关；回收率与分子量大小呈负相关；2）乙醇沉淀）乙醇沉淀其中温度、时间和其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）浓度（回收时体积）均与回收率有关；均与回收率有关；3）离心时间）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其尤其明显。明显。回收回收DNA片段质量片段质量凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、盐、核苷酸、盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。聚丙烯酰胺及蛋白质等。二、二、基因扩增基因扩增（geneamplification）主要内容：主要内容：1.体外扩增体外扩增2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增增3.在环境作用下，生物体内相关保卫基因的扩增。在环境作用下，生物体内相关保卫基因的扩增。4.程序基因扩增程序基因扩增5.进化过程中的基因扩增进化过程中的基因扩增三、分子杂交三、分子杂交分子杂交：指具有一定分子杂交：指具有一定同源序列同源序列的两条核酸单链的两条核酸单链（DNA或或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原），在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成则经过退火处理，形成异质双链异质双链的过程。由于操作方的过程。由于操作方式相似，通常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是式相似，通常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是分子杂交。分子杂交。作用：用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质作用：用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质是是否存在否存在，以及其，以及其相对分子质量的大小相对分子质量的大小。分类：根据检测对象的不同可分为分类：根据检测对象的不同可分为Southern杂交、杂交、Northern杂交、杂交、Western杂交。杂交。Southern杂交：杂交：即即DNA-DNA杂杂交交分分析析，检检测测样样品品中中特特定定的的DNA及其含量及其含量。Northern杂交：杂交：即即RNA-DNA杂杂交交分分析析。检检测测样样品品中中是是否否含含有有特特定定基因的转录产物（基因的转录产物（mRNA）及其含量）及其含量。Western杂交：杂交：即利用抗原即利用抗原-抗体反应，检测转移到硝酸纤维素抗体反应，检测转移到硝酸纤维素膜上的特异性蛋白质。膜上的特异性蛋白质。核酸分子杂交（核酸分子杂交（DNA/DNAorDNA/RNA）技术）技术核酸分子杂交技术，是在核酸分子杂交技术，是在1968年由华盛顿卡内基年由华盛顿卡内基学院（学院（CavnegieInstituteofWashington）的）的RoyBritten及其同事发明的。所依据的原理是，具有互及其同事发明的。所依据的原理是，具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。原则形成双链的过程。探针探针Hybridization of Nucleic AcidsRNADNA1DNA2DNASouthernhybridizationNorthernhybridizationJuang RH(2004)BCbasics探针探针DNA变性与复性变性与复性1.DNA变性变性定义：氢键断裂，单链定义：氢键断裂，单链方法方法:热变性热变性:90100 熔解温度熔解温度(Tm)酸碱变性酸碱变性:常采用碱变性常采用碱变性 化学试剂变性化学试剂变性;尿素、甲醛等尿素、甲醛等 2.DNA复性复性(退火退火)DNA/DNA，DNA/RNA，RNA/RNA 分子杂交的基本方法分子杂交的基本方法Southern 印迹法印迹法Northern 印迹法印迹法斑点印迹杂交斑点印迹杂交原位杂交原位杂交Western 印迹法印迹法液相杂交液相杂交固相杂交固相杂交杂种核酸分子：杂种核酸分子：彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形彼此退火的核酸来自不同的生物有机体，而形成的双链分子。成的双链分子。DNA/DNA的杂交作用的杂交作用检测特定生物有机体之检测特定生物有机体之间的亲源关系间的亲源关系DND/DNA或或RNA/DNA的能力，揭示核酸片断的能力，揭示核酸片断中某种特定基因的位置。中某种特定基因的位置。核酸杂交常用几种膜的核酸杂交常用几种膜的性能比较性能比较硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜不能滞留小于不能滞留小于150bp的的DNA片断，不能同片断，不能同RNA结结合。合。应用应用1mol/L醋酸铵和醋酸铵和0.2mol/L的的NaOH缓冲液缓冲液代替代替SSC缓冲液可改善对小片断缓冲液可改善对小片断DNA的滞留能力。的滞留能力。RNA变性后也能十分容易的结合到膜上。变性后也能十分容易的结合到膜上。尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：尼龙膜或硝酸纤维素膜杂交的步骤：1.核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜核酸印迹转移：将核酸样品转移到固体支持膜上。利用的是上。利用的是(毛细管虹吸印迹法、电转印法、真毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法空转移法)2.印迹杂交：印迹杂交：将具有核酸印迹的滤膜同带有标将具有核酸印迹的滤膜同带有标记的记的DNA/RNA进行杂交。进行杂交。1、萨瑟恩、萨瑟恩DNA印迹杂交印迹杂交根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的根据毛细管作用的原理，使在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同片段转移并结合在适当的滤膜上，然后通过同标记的单链标记的单链DNA或或RNA探针的杂交作用检测这些探针的杂交作用检测这些被转移的被转移的DNA片段，这种实验方法叫做片段，这种实验方法叫做DNA印迹印迹杂交技术。由于它是由杂交技术。由于它是由E.Southern于于1975年首先设年首先设计出来的，故又叫计出来的，故又叫SouthernDNA印迹转移技术。印迹转移技术。（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片Southern Southern 凝凝胶转移杂交胶转移杂交技术技术杂交步骤：1.酶切2.电泳3.转膜4.杂交5.显影电转印法电转印法 Southern DNA Southern DNA Southern DNA Southern DNA 印迹杂交之印迹杂交之印迹杂交之印迹杂交之X X X X光显像图片光显像图片光显像图片光显像图片 水稻（水稻（水稻（水稻（Oryza sativa LOryza sativa L.).)的叶绿体的叶绿体的叶绿体的叶绿体DNADNA分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶分别用核酸内切限制酶BglBgl(A-C)(A-C)(A-C)(A-C)、BamHBamHBamHBamH（D-FD-FD-FD-F）、）、）、）、EcoREcoREcoREcoR（G-IG-IG-IG-I）、和）、和）、和）、和HindHindHindHind（J-LJ-LJ-LJ-L）消化，加样在含有）消化，加样在含有）消化，加样在含有）消化，加样在含有EtBrEtBrEtBrEtBr染料的染料的染料的染料的1%1%1%1%的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同的琼脂糖凝胶电泳中作电泳分离，然后同32323232P P P P标记的玉米标记的玉米标记的玉米标记的玉米psbApsbApsbApsbA探针作探针作探针作探针作SouthernSouthernSouthernSouthern杂交。杂交。杂交。杂交。X X X X光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带光底片中显现的阳性条带 ，表明含有水稻，表明含有水稻，表明含有水稻，表明含有水稻的的的的psbApsbApsbApsbA基因序列。基因序列。基因序列。基因序列。在进行核酸印迹转移的时，在进行核酸印迹转移的时，1.要将以转好的硝酸纤维素膜在要将以转好的硝酸纤维素膜在80度下烘烤度下烘烤12小时；小时；2.紫外线交联法，将紫外线交联法，将DNA分子上的部分胸腺嘧啶分子上的部分胸腺嘧啶残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进残基同尼龙膜表面的带正电荷的氨基基团之间进行交联。行交联。2、诺赛恩、诺赛恩RNA印迹技术（印迹技术（Northernblotting）1979年，年，J.C.Alwine等人发展而来，是将等人发展而来，是将RNA分子从分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。由于这种方法与萨瑟恩方法与萨瑟恩DNA印迹杂交技术十分类似，所以叫做印迹杂交技术十分类似，所以叫做诺赛恩诺赛恩RNA印迹技术（印迹技术（Northernblotting）。）。而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，而将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜上，然后同放射性同位素然后同放射性同位素125I标记的特定蛋白质之抗体进标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术行反应，这种技术叫做韦斯顿蛋白质杂交技术（Westernblotting）。）。1)转移的对象不同，转移的对象不同，Northern印迹转移的印迹转移的是是RNA，Southern印迹转移的是印迹转移的是DNA。2)电泳前的处理不同，电泳前的处理不同，RNA在电泳前需要在电泳前需要甲醛变性处理，甲醛变性处理，DNA在电泳前不必变性处在电泳前不必变性处理。理。3)电泳后的处理不同，电泳后的处理不同，RNA在电泳后可直在电泳后可直接转移到固相支持物上，接转移到固相支持物上，DNA在电泳后需在电泳后需要经过碱变性处理及相应的中和处理。要经过碱变性处理及相应的中和处理。NorthernNorthern印迹杂交法和印迹杂交法和SouthernSouthern印迹杂交法有何不同印迹杂交法有何不同 Western杂交 Western blotting是用是用SDS聚丙烯酰聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支电泳凝胶中转移到硝酸纤维素膜或其它支持物上持物上，然后同放射性同位素标记的特定然后同放射性同位素标记的特定蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用蛋白质之抗体进行反应，这种技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。于基因在蛋白质水平上的表达研究。3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交）和狭线印迹杂交（slotblotting）是在）是在Southern印迹杂交的基础印迹杂交的基础上发展的量种类式的快速检测特定核酸（上发展的量种类式的快速检测特定核酸（DNA和和RNA）分子的核酸杂交技术。由于在实验的）分子的核酸杂交技术。由于在实验的加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众加样过程中使用了特殊设计的加样装置，使众多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，多待测样品能够一次同步转移到杂交滤膜上，并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更并有规律地排列成点阵或线阵。这两项技术更适应与核酸样品的定量检测。适应与核酸样品的定量检测。通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核通过抽真空的方式将加在多孔过滤进样器上的核酸