高效液相色谱法测定莠去津.doc

成都高等纺织专科学校2016届论文（设计）

毕业论文

题 目： 　高效液相色谱法测定莠去津
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学 号：
指 导 教 师：
完 成 时 间： 　

目录
摘要 1
谢辞 3
1．　前言 4
1.1研究背景 4
1.2　莠去津残留分析的样品前处理技术 5
1.2.1　液液萃取(LLE) 5
1.2.2 固相萃取（SPE） 5
1.2.3 其他萃取方法 5
1.3　莠去津残留分析的检测技术 6
1.3.1 气相色谱法（GC） 6
1.3.2　高效液相色谱法（HPLC） 7
1.3.3　液相色谱-质谱法（LC/MS） 7
1.3.4　其他方法 8
1.4 本文研究内容 8
2．　高效液相色谱法（HPLC）测定水中莠去津 9
2.1　实验部分 9
2.1.1　主要仪器 9
2.1.2　主要试剂 9
2.1.3　标准溶液的配制 9
2.1.4　高效液相色谱（HPLC）测定条件 10
2.1.5　样品预处理 10
3．　实验结果和分析 11
3.1　高效液相色谱的基本原理 11
3.1.1　原理 11
3.1.2　高效液相色谱法的特点 11
3.2　HPLC方法的建立 12
3.2.1 液相色谱条件的优化 12
3.3　方法的准确度 17
3.4　方法的精密度 18
3.5　标准曲线和检出限 18
3.6　固相萃取条件的优化 19
3.6.1　固相萃取洗脱剂的优化 19
3.6.2　固相萃取洗脱剂用量的优化 20
3.6.3　固相萃取水样的流速优化 21
3.7　样品的分析 22
3.8　加标回收实验 23
结论 26
讨论和展望 27
参考文献 28

高效液相色谱法测定莠去津
学生： 　　　指导教师：
摘要
本文首先概述了农药残留的现状，重点是除草剂在水中的残留，总结了在农药残留分析中样品前处理技术和有关分析检测技术的特点和应用。重点介绍了固相萃取技术的基本原理、操作步骤及其在环境水样分析中的应用，本文主要针对水中莠去津残留的分析研究，建立了液液萃取和固相萃取两种方法对比同时测定水中莠去津。首先对高效液相色谱(HPLC)分离条件进行优化，同时对固相萃取的洗脱溶剂，洗脱速率进行优化。
通过大量实验，对C18固相萃取小柱的萃取条件如洗脱溶剂、上样速率等进行了优化，得出对目标组分的最佳的固相萃取实验条件。最后结合高效液相色谱（HPLC）方法对实际水样样进行了分析。
关键词：莠去津 固相萃取 高效液相色谱

High performance liquid chromatography determination of atrazine in water
Student： Tutor：
Abstract
This article mainly aims at the analysis and research of atrazine in water residue， liquid-liquid extraction and solid-phase extraction was established two methods contrast atrazine determination in water at the same time . First of all， high performance liquid chromatography (HPLC) separation conditions were optimized， the elution of solid phase extraction solvent， elution rate optimization.
By a large number of experiments， the extraction conditions of C18 solid phase extraction small column， such as on the elution solvent， sample rate， the optimization， it is concluded that the best components of the target of solid-phase extraction experimental conditions. Finally combined with high performance liquid chromatography (HPLC) method for the actual water everything is analyzed.
Key words：Atrazine; Solid-phase extraction; High performance liquid chromatography (HPLC).

谢辞　
毕业设计期间， 老师对我们一直悉心教导，给予了很多的帮助。除了导师外，还要感谢我的工作合作伙伴们，一起做实验，一起提出问题解决问题，对所有帮助着我们的以及学校说：谢谢！
大学马上就要毕业了，心里无比的不舍，但我应该感到高兴，正是由于母校对我这四年的辛苦栽培让我学到了太多知识，我必须踏上社会把自己所学的知识得到发挥，回报父母，回报母校，回报社会。

1．　前言
1.1研究背景
莠去津,又叫名阿特拉津，是一种稍溶于有机溶剂，相对分子量215.69的白色晶体，是瑞士汽巴-嘉基公司开发生产的一种均三氮苯类除草剂(Triazine herbicides)[1]，其化学名称为2-氯-4-乙胺基-6-异丙胺基-l，3 ，5-三嗪，一些干旱的地方经常用这种除草剂。从 60年代就有了莠去津的出现，近年来莠去津被广泛应用在玉米产区，使用量也由 80 年代的100t(有效成分 )增加到 90 年代的 690t[2]。莠去津具有应用范围广，易生产，除草效果好，同时价格便宜等优势。但是莠去津也有突出的劣势，具有较长的残留期(一年到几年) 、较高的水溶性 (30mg／L ，20℃)及应用量的增加和施用范围的扩大导致其对环境的影响日益突出[3]。莠去津有一定的移动性，所以很容易渗透进土地从而污染地下水。Huang 等人利用同位素稀释气质法发现莠去津可以通过土壤剖面进入到地下水中[4]。
传闻，美国研究人员发现过"阿特拉津"具有能使动物变性的功能。后来就有相关的研究人员以蛙作为实验对象，把那些蛙放入浓度为十亿分之二点五的水中生活，发现大多数的蛙已雌性化，甚至少部分的蛙已经变为雌性。将变性后的雌蛙与雄性蛙交配，出现产卵现象。说明“阿特拉津”确实能够雄性蛙变性。
如此，不禁会令人联想到：除草剂“阿特拉津”是否对人性也有相同的效应呢？
在该问题上，也曾对人类的血清作了相关研究，相关资料显示，“阿拉特津”和天然性激素（即睾酮、雌二醇）一样都能够与体内的血清相结合，因此二者之间具有竞争关系，从而使生物体内的性激素水平产生变化。
残留莠去津的分析主要是采用气相色谱法，其余方法也有，比如气相色谱一质谱联用技术、反相高效液相色谱 (HPLC)方法，还有离子对反相高效液相色谱法也被用来测定土壤中残留的莠去津[5]。但是很多处理方法步骤繁琐费时，因为不适用于大量的样品进行分析。本实验采用对比实验的方法，应用液液萃取和固相萃取两种方法从水和土壤中快速提取、处理和检测莠去津残留，最终采用高效液相色谱仪对前处理后的样品进行上机分析。
1.2　莠去津残留分析的样品前处理技术
目前样品的的分析方法一般来讲包括样品的前处理和样品的检测两环节。然而对于莠去津来讲，分离、提取和净化是莠去津前处理中最繁琐而关键的一步。对于分析的水样来说，由于稀释和降解作用导致莠去津的残留浓度很低，甚至都低于有些方法的检出限。所以，我们在对样品的前处理时每一步都要做到细致，避免样品的损失。
1.2.1　液液萃取(LLE)
目前农药残留的传统处理方法是液液萃取(Liquid-liquid extraetion，LLE)，液液萃取通常采用二氯甲烷，乙酸乙醋等这类萃取剂。但这种方法的弊端是需要大量的有机试剂，并且对人体、环境都会有危害。
1.2.2 固相萃取（SPE）
固相萃取(Solid-phase extractioll，SPE)是近些年研究出来的新的处理方法之一，对样品的分离和净化有很好效果。相比其它方法来说，它的回收率较高、分离度也高，同时缩短样品预处理过程，操作简单，省时[6-7]。
1.2.3 其他萃取方法
随着研究的不断进步，固相微萃取(Solid-Phase Micro extraction，SPME)也逐渐浮出水面。该方法的基本原理是将不同极性的吸附材料涂在极细的纤维上面，形成探针。把探针插入到被检测的样品中，目标组分在一定时间内附着在上面。气相色谱仪检测时，由于色谱柱的高温作用使得北侧组分被解吸，从而检测。该方法简便、快速。但是纤维管很细容易破碎而且种类较少，所以在很大程度上就限制了该技术的应用范围[8-9]。
超临界流体萃取(Supereritieal fuild extraetion，SFE)也是一种曾用于萃取的技术。这种萃取技术是以超临界流体作为萃取溶剂。超临界流体具有液体密度高和气体粘低度的特点，这些特点是在临界温度和压力以上存在的。处于临界状态下的流体会因为压力和温度的改变而发生变化，这样一来可以改变一下相关的条件使得溶解在流体中的组分被析出来，从而实现特定溶质的萃取。其中常见的超临界流体是很环保的二氧化碳。由于超临界的条件要求比较高，使得目前广泛应用受到限制[10]。
微波辅助萃取(Mierowave assisted extraetion，MAE)是指利用微波能量使浸没在溶剂中的固体中的有机萃取目标物被萃取的过程。这种方法一般只适用于固体物质的萃取，对于水中莠去津等农药残留的萃取不适用。
1.3　莠去津残留分析的检测技术
农药残留分析主要的分析技术有气相色谱和液相色谱。最先应用的是气相色谱，所使用的检测器都是高灵敏度的，从而也推动了农药残留分析技术的发展。
随后，高效液相色谱也开始发展起来啦。两者相比而言，高效液相色谱更适用于受热易分解和极性大的组分检测。
色谱法是一种分离和分析方法，具有高效、高速等特点。利用不同物质在固定相和流动相中具有不同的分配系数，液体流过色谱柱时，液体中的不同组分沿着固定相移动，由于不同的分配比，在柱内的停滞时间不同，导致流出顺序也不同，从而就可以达到分离效果，这种分离技术称为色谱法。
1.3.1气相色谱法（GC）
气相色谱(GC)法，流动相为液体。气相色谱法，操作简便快捷、速度快、选择性高。气相色谱法检测对象主要针对的就是那些容易气化而且气化后不发生分解反应的化合物。气相色谱法主要采用填充柱和毛细管柱这两种色谱柱。在农药残留分析检测中，最开始采用的是填充柱，后来过渡到了毛细管柱。进样时，当被检测的物质在载气的带动下通过色谱柱，目标组分被吸附，由于不同组分有不同的通过速率，流出时间也有先后顺序，因此达到分离效果，从而达到气相分析的目的。
利用气相色谱法对除草剂的检测不管是单一组分还是多组分都有普遍的应用。例如，张素娣利用带氢火焰离子化检测器(FID)的气相色谱仪，采用内标法对敌草隆进行分离和测定[11]，胡先文等人对水样中的甲磺隆进行测定，采用液一液分配法提取后进行气相色谱分析，进入电子捕获检测器(ECD)进行检测[12]等.但是，在同柱同温下条件下分离和检测混合样品的研究并不多。秦冬梅等曾用气相色谱法对河水中莠去津和乙草胺进行同柱分离，然后将样品分别通过氮磷检测器(NPD)和电子捕获检测器(ECD)进行检测[13]。C. Aguilar等用气相色谱分离环境水中的莠去津、西玛津等多种物质，然后比较了电子捕获检测器(ECD)和质谱(MS)检测结果[14]。
但是，使用气象色谱法具有一定的局限性。首先样品进入仪器后要被气化，因此，被测样品应该满足一下两个条件：一方面是样品必须在仪器工作的温度下能够气化，另外一方面是样品在气化后不能发生分解。因而对于不挥发性和受热易分解化合物的测定，必须先进行衍生化处理，操作步骤比较繁琐。
1.3.2　高效液相色谱法（HPLC）
液相色谱法(Liquid chromatography，LC)是采用液体作为流动相的一种色谱法。20世纪70年代,高效液相色谱开始发展起来，具有高效、快速、高压等特点。相比气相色谱而言，液相色谱不受试剂挥发性的限制，因此也可以检测稳定性差、相对分子质量大和沸点高的物质.高效液相色谱主要由色谱柱、高压泵和检测器和自动进样器组成，具有高压、高速、高效、高灵敏度、流出组分容易收集几个突出的特点[15]，这些特点在分析结果上都起着很大的作用。
目前利用高效液相色谱仪对农药残留进行检测的检测器是紫外检测器（UV）。紫外检测器具有灵敏度较高、噪音低、流量和温度的变化影响小等特点，是梯度淋洗的一种比较理想的检测器[16]，但是溶质能对紫外光进行吸收是必要条件，否则无法进行检测。还有另一种检测器—荧光检测器，是一种灵敏度高、选择性强的检测器，比紫外检测器的灵敏度要高l—2个数量级。随着社会的不断发展，也有许多新型的检测器开始应用，如光化学诱导荧光检测器(PIF)，二极管矩阵检测器(DAD)和质谱(MS)等，其中DAD的应用越来越广泛。
1.3.3　液相色谱-质谱法（LC/MS）
质谱(Masss Pectrometry，MS)法是目前应用的比较广泛的检测技术之一，其基本原理是利用带电粒子在磁场或电场中通过受力的作用，由于物质的电离产生不同的质荷比(m/z)，从而实现分离分析，该方法的专属性较强、灵敏度相对比较高、检测速度比较快等优点。并且质谱法很早就开始应用，液相色谱一质谱(LC/MS)的结合，提高了检测范围和精确度，成为一种重要的现代分离分析检测技术，在学术研究和样品检测等许多领域应用极广。自70年代以来，经过约30年的发展己趋向成熟[15]。
1.3.4　其他方法
20世纪50年代，农药残留分析检测技术开始出现，其中就包含有莠去津。那时的农药残留分析技术方法以简便分光光度法为主。分光光度法这种检测技术对于检测农药残留来说，灵敏度比较低。所以这种技术如今已不作为常用的分析方法了。
近年发展起来的一种分离、分析技术毛细管电泳(CE)，是药品行业分离分析的重要工具之一[17]。其工作原理是不同带电粒子在毛细管柱内，通过高压作用在缓冲液中定向的移动进行分离。这种技术的主要局限是系统的负荷能力低，检测光程短，检测灵敏度较低，在痕量分析的应用上就达不到标准。
另外，还有免疫分析(IA)这种分离技术存在，原理是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础实现的。免疫分析具有很强的特异性、且分析成本较低，已成为现代科学研究和检验检测的重要研究手段。由于免疫分析方法独特的优点，使得研究人员对莠去津的研究和检测有了很大的进步，同时也引起了农药研究领域的关注[18]。
1.4 本文研究内容
随着现代化农业的发展和从事农业生产人口的减少，同时为保证粮食的高产，除草剂使用范围越来越广。除草剂的广泛使用在保证粮食增产的同时对环境及人类健康也带来了危害。本实验选除草剂中典型成分之一莠去津作为研究对象，建立水中除草剂残留的检测方法。

2．　高效液相色谱法（HPLC）测定水中莠去津
2.1　实验部分
2.1.1　主要仪器
高效液相色谱仪（LC-20AT，日本岛津）包括：DGU-20A5脱气机，LC-20AT液相泵，CBM-20A控制器，SIL-20A自动进样器，CTO-10AS vp柱温箱，SPD-M20A二极管陈列检测器。Sepax HP-C18色谱柱（5um，4.6×250mm），24位负压SPE固相萃取装置（天津博纳艾杰尔科技有限公司），旋转蒸发器，自动液液萃取装置（Q-10001CQ-2000，吉林欧伊尔环保科技发展有限公司），涡旋振荡器（XW-80A，上海青浦泸西仪器厂），分液漏斗（蜀牛250mL），Milli-Q Integral超纯水仪（密理博公司），移液枪，振荡器（XW-80A 上海青浦泸仪器厂），超声波清洗器（KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司）。
2.1.2　主要试剂
二氯甲烷（500mL色谱纯，成都市科龙化工试剂厂），甲醇（500mLHPLC级，成都市科龙化工试剂厂），甲醇（4LHPLC级，成都市科隆化学品有限公司），氯化钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂），无水硫酸钠（分析纯，成都市科龙化工试剂厂）。莠去津标准溶液（GBW（E）081100b，99mg/L，地质科学院物化探研究所）。
2.1.3　标准溶液的配制
标准储备液：用200uL移液枪准确移取101uL浓度为99mg/L的莠去津标准母液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到浓度为1mg/L的莠去津标准储备液。
标准溶液的配制：要配制的标线浓度梯度依次为30ug/L、50ug/L、100ug/L、200ug/L、500ug/L、1000ug/L，准备好6个1.5mL的离心管，依次按标线浓度梯度由低到高编号1、2、3、4、5、6，然后分别向6个离心管中依次先加入溶剂甲醇970uL、950uL、900uL、800uL、500uL、0uL，然后分别依次加入莠去津标准储备液30uL、50uL、100uL、200uL、500uL、1000uL然后用涡旋器混匀，最后转移到进样瓶中。
2.1.4　高效液相色谱（HPLC）测定条件
流动相B：甲醇 流动相D：超纯水
洗脱方式：等度洗脱（70%甲醇+30%超纯水）
流速：0.8mL/min 柱温：25℃
进样量：10uL 检测波长：225nm
2.1.5　样品预处理
本次设计主要以固相萃取为主要实验方法，液液萃取方法作为对比方法。
方法一，固相萃取方法：取污染的稻田水样200mL，经孔径为0.45um，直径50mm的水系滤膜后再用SPE固相萃取装置净化。SPE具体步骤为：用5mL丙酮以6mL/min的流速清洗填料为C18的富集小柱，再依次用10mL甲醇和10mL超纯水以同样的流速通过萃取小柱，在柱子被抽空前加100mL刚刚过膜的水样，使样品连续的通过萃取柱，控制其流速为10mL/min待水样全部抽完后，用10mL超纯水清洗样品瓶，保持真空抽滤泵压力-0.03MPa抽吸10min，使待测组分富集在C18柱上，最后用2mL色谱级甲醇洗脱被分析的莠去津，取洗脱液10uL供高效液相色谱仪上机分析。
方法二，液液萃取方法：先将氯化钠在400℃灼烧4小时，冷却后密闭保存在玻璃瓶中。无水硫酸钠在400℃灼烧4小时，冷却后密闭保存在玻璃瓶中。取污染的稻田水样200mL，经孔径为0.45um，直径50mm的水系滤膜，用容量瓶量取100ml样品于250ml分液漏斗中，加入5g氯化钠摇匀。用20ml二氯甲烷分两次萃取，每次10 ml，于振荡器上充分振摇5min。注意手动振摇放气。静置分层后，将有机相通过装有无水硫酸钠的漏斗，接至浓缩瓶中，注意无水硫酸钠充分淋洗。合并两次二氯甲烷萃取液。旋转蒸发器浓缩至近干，用甲醇定容至1.00ml，供分析。试样保存在4℃冰箱中。
注：样品在浓缩过程中，萃取液浓缩至近干时，应立即定容，否则阿特拉津会有较大损失。

3．　实验结果和分析
3.1　高效液相色谱的基本原理
3.1.1　原理
高效液相色谱中液-液分配原理：
液-液分配色谱法 (Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相色谱(Chemically Bonded Phase Chromatography) 流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶(极性不同，避免固定液流失)，有一个明显的分界面。当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。HLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大;但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，HLPC流动相对K影响较大。 a. 正相液 - 液分配色谱法(Normal Phase liquid Chromatography)： 流动相的极性小于固定液的极性。 b. 反相液 - 液分配色谱法(Reverse Phase liquid Chromatography)： 流动相的极性大于固定液的极性。 c. 液 - 液分配色谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解;流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相(见后)，可克服上述缺点。现在应用很广泛(70-80%)。 液-固色谱法 流动相为液体，固定相为吸附剂(如硅胶、氧化铝等)。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。下图3是高效液相色谱仪的基本原理图。

图3高效液相色谱仪的基本原理图
3.1.2　高效液相色谱法的特点
高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：
①高压：流动相为液体，液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载液加高压。
②高效：分离效能比气相色谱还高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，一些新型的固定相，如化学键合固定相，使分离效率大大提高。
③高灵敏度：采用高灵敏度的紫外检测器，该检测器可达0.01ng，进样量在uL数量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、热稳定性差化合物的分离分析。
⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
除了上述的特点外，高效液相色谱还具有色谱柱可以反复使用的特点。但其也存在缺点，那就是在色谱柱等连接处有连接管可能产生死体积。
3.2　HPLC方法的建立
3.2.1 液相色谱条件的优化
3.2.1.1 流动相的选择
高效液相色谱中一般使用的色谱柱都是非极性的C18色谱柱，一般水中莠去津残留的分离等使用的流动相一般为甲醇/水或乙睛/水体系。我们对常用的流动相甲醇/水对比乙睛/水进行了解，图3-4和图3-5是进样量10uL时，流动相分别为甲醇/水(体积比为70：30)和乙睛/水(体积比为70：30)的色谱图。同时图3-1为莠去津的色谱图，图3-2为莠去津的光谱视图（提取图），图3-3为莠去津的的纯度视图。

图3-1　　莠去津的液相色谱图
Figure 3-1 atrazine liquid chromatogram

图3-2　莠去津的光谱视图（提取图）
View 3-2 spectra of atrazine (extracted)

图3-3　莠去津的的纯度视图
Figure 3-3 to view the purity of Tianjin atrazine

图3-4　以甲醇/水为流动相的色谱
Figure 3-4 in a methanol/water as mobile phase chromatogram

图3-5　以乙腈/水为流动相的色谱图
Figure 3-5 with acetonitrile/water as mobile phase chromatograph chart
实验结果表明：从分离度角度考虑，则乙睛/水体系和溶剂峰分离度不好，会产生干扰，而甲醇/水体系莠去津的峰和其他溶剂峰都分离的比较好，因此采用甲醇睛/水作为流动相。

3.2.1.2 溶剂流速的影响
溶剂的流速会影响组分的出峰时间，选择三种不同的流速进行分析。得到溶剂甲醇/水（70/30）如图3-6，图3-7和图3-8的不同溶剂流速色谱图。

图3-6　流速为1.0mL/min的色谱图
Figure 3-6 chromatograms of flow rate is 1.0 mL/min

图3-7　流速为0.8mL/min的色谱图
Figure 3-7 chromatograms of flow rate is 0.8 mL/min

图3-8　流速为0.5mL/min的色谱图
Figure 3-8 chromatograms of flow rate is 0.5 mL/min
通过对比色谱图3-6，图3-7，图3-8可以清楚的看到流速对组分的峰形和分离度基本没有影响，只是会影响组分的出峰时间。但是流速为1.0mL/min时压力达到18.5MPa，压力偏高对色谱柱填料有影响从而会降低柱效，所以不可取。0.8mL/min的流速时压力14.5MPa，峰形和分离度都很好。然而流速0.5ml/min时，压力为9.2MPa，虽然压力较低但出峰时间有点靠后，所以综合上诉原因我们选择流速为0.8mL/min。
3.2.1.3　色谱柱的选择
对于高效液相色谱柱来讲，色谱柱的长度是影响组分分离度的重要因素，所以我们在对莠去津的定性和定量过程中必须对色谱柱长度进行优化，图3-9和图3-10是在柱温30℃，流速0.8mL/min进样量10uL，流动相为甲醇/水(70/30)时，分别采用SepaxHP-C18色谱柱（5um，4.6×250mm）和Sepax HP-C18色谱柱（5um，4.6×150mm）的色谱图。

图3-9　用250mm长度色谱柱的色谱图
Figure 3-9 with 250 mm length of chromatographic column chromatogram

图3-10　用150mm长度色谱柱的色谱图
Figure 3-10 with 150 mm length of chromatographic column chromatogram
通过比较图3-9和图3-10发现，采用长度250mm的色谱柱与溶剂峰都分离的比较好，而长度为150mm的色谱柱莠去津的峰和溶剂峰没有完全分离。所以应该选择SepaxHP-C18色谱柱（5um，4.6×250mm）比较好。分析原因应该是在一定的流速范围之内，柱子越长其理论塔板数就越多，分离效果就越好，所以250mm长的柱子分离效果更好。
3.3　方法的准确度
分别对100ug/L，300ug/L，800ug/L的标准溶液平行测定6次，计算莠去津浓度的相对误差差(RE%)浓度，结果见表3-1。
表3-1　方法的准确度
table 3-1 the accuracy of the method
测量次数
浓度（ug/L）
浓度（ug/L）
浓度（ug/L）
1
98.79
292.70
804.84
2
99.01
296.72
804.74
3
97.68
295.10
806.30
4
98.44
297.03
803.48
5
97.69
296.03
807.37
6
97.95
293.83
806.86
平均值
98.26
295.24
805.60
实际浓度
100.00
300.00
800.00
相对误差RE（%）
1.74
1.59
0.70
3.4　方法的精密度
分别对30ug/L，300ug/L，700ug/L的标准溶液平行测定6次，计算莠去津峰面积的相对标准偏差差(RSD%)，结果见表3-2。
表3-2　方法的精密度
Table 3-2 the precision of the method
测量次数
峰面积
峰面积
峰面积
1
3215
34376
81938
2
3232
34872
81907
3
3287
34567
81609
4
3383
34477
82073
5
3213
34627
81809
6
3241
34548
82069
平均值
3262
34578
81901
标准偏差S
65.14
167.85
174.89
相对标准偏差RSD（%）
2.00
0.49
0.21
3.5　标准曲线和检出限
对己经配制好的浓度为30ug/L，50ug/L.100ug/L，500ug/L，1000ug/L的莠去津标准溶液，分别进样10uL，通过二极管陈列检测器检测进行定量分析。以下的X值为莠去津峰面积，Y值为莠去津的浓度（ug/L），得到莠去津的标准曲线如图3-11。莠去津的标准曲线，相关系数，线性范围及检出限(S/N=3)列于表3-3。结果表明，莠去津的线形关系良好。
表3-3　莠去津的标准曲线、线性范围和检出限
Table 3-3 standard curve of atrazine， linear range and detection limit

工作曲线
相关系数（r）
检出限（ug/L)
莠去津
Y= 8.327161e-3X+4.653009
0.9999461
3.549

Y = aX + b
a = 8.327161e-003
b = 4.653009
R^2 =0.9998922
R = 0.9999461

图3-11　莠去津的标准曲线
Figure 3-11 standard curve of atrazine
3.6　固相萃取条件的优化
3.6.1　固相萃取洗脱剂的优化
我们在对莠去津的分离净化过程中，当莠去津被固相萃取柱吸附后，要选用合适的洗脱剂将莠去津洗脱下来，不同的洗脱剂洗脱效果不同，从而会影响回收率，所以对洗脱剂的选择十分重要。洗脱剂的种类有很多，目前实验室常用的有水、甲醇、异丙醇、乙睛、丙酮、乙酸乙醋、二氯甲烷、四氯化碳、正己烷等。本论文参考了大量相关文献后，选择了甲醇、乙睛、二氯甲烷，正己烷这几种不同极性的洗脱剂为研究对象，考查它们对莠去津的洗脱效果，见表3-4.

表3-4　不同洗脱溶剂对回收率(%)的影响
Table 3-4 different elution solvent effect on the recovery (%)
平行测量
甲醇（ug/L)
二氯甲烷
乙腈
正己烷
A
98.07
57.51
48.06
0
B
98.15
58.34
48.17
0
平均值
98.11
57.92
48.11
0
实际浓度
100
100
100
100
回收率（%）
98.11
57.92
48.11
0
由回收率结果可以看出，甲醇的洗脱效果较好，二氯甲烷和乙腈的洗脱效果不理想，正己烷的洗脱效果最差。分析原因可能因为甲醇的极性与莠去津的极性相似，具有较大的溶解度，因此可获得较高的回收率.
3.6.2　固相萃取洗脱剂用量的优化
萃取小柱上的有效组分是否有效的被洗脱下来，这需要对洗脱剂的用量进行探讨和研究，所以我们以不同体积的甲醇洗脱同一样品，洗脱剂用量从0.5mL-3.0mL，每增加0.5mL甲醇测定一次回收率，试验结果如图3-12所示。
图3-12洗脱剂体积对回收率的影响
Figure 3-12 eluent volume effect on recovery
图3-12的结果表明，洗脱溶剂甲醇的体积小于2.0mL时，样品回收率随洗脱溶剂体积的增加而提高。当洗脱溶剂的体积大于2.0mL时，随着洗脱溶剂体积的增加回收率基本保持不变。所以，我们在样品的净化洗脱时选择洗脱溶剂体积为2.0mL。
3.6.3　固相萃取水样的流速优化
样品水样的流速也是固相萃取的一个重要指标。流速过慢，则需要较长的样品处理时间；流速过快，则样品不能充分的被吸附，富集效果变差，造成回收率降低。本文选取了八种不同的流速，分别是负压真空泵压力为-0.2，-0.6，-1.2，-1.6，-2.0，-3.2，-4.0，-5.0MPa，研究了不同负压(流速)下莠去津的固相萃取回收率，结果如图3-13。

图3-13水样流速对回收率的影响
Figure 3-13 water velocity influence on recovery
从图3-13中可以很清楚的看到：当负压为-0.2，-0.6，-1.2，-1.6，-2.0MPa时莠去津的回收率变化不大，而当负压增加到-3.2MPa时，随着负压（流速）的增加，固相萃取的回收率出现了比较明显的下降，表明此时组分没有充分被固相柱吸附和保留。综合考虑，本试验选择负压（流速）-2.0MPa， 此时固相萃取的回收率较高，而水样过柱时间相对较短。
通过以上一系列实验对色谱条件以及固相萃取方法条件的优化得到最后主要优化条件的汇总表如3-5。

表3-5色谱主要条件及固相萃取主要条件优化汇总表
Table 3-5 main conditions of chromatography and solid phase extraction optimization of the main conditions of the summary table

色谱条件的优化
流动相的优化
甲醇：水=70:30
溶剂流速的优化
0.8 mL/min
色谱柱的优化
SepaxHP-C18（5um，4.6×250mm）

固相萃取的优化
洗脱剂的选择
甲醇（HPLC）
洗脱剂用量的优化
2.0mL
样品流速的优化
负压-2.0MPa
3.7　样品的分析
取3份农作物附近的灌溉水样按照2.1.5固相萃取的方法进行样品的处理，然后上机分析测定。得到如图3-14，图3-15，图3-16莠去津的样品图。

图3-14样品1的莠去津色谱检测图
Figure 3-14 samples of atrazine chromatographic detection figure

图3-15 样品3的莠去津色谱检测图
Figure 3-15 samples 2 atrazine chromatographic detection figure

图3-16 　样品3的莠去津色谱检测图
Figure 3-16 samples of 3 atrazine chromatographic detection figure
根据样品1，样品2，样品3的色谱图可以看出都有莠去津的检出。3个样品检测浓度分别为52.69ug/L，54.65ug/L，65.45ug/L，3个样品的实际浓度分别为 1.05ug/L，1.09ug/L，1.31ug/L，参考国家相关水中农药最大残留得知三个样品的浓度都没有超出国家限量标准。
3.8　加标回收实验
对液液萃取和固相萃取两种预处理方法都进行加标处理。对两种方法的3个水样分别平行取6份，样品1加标浓度是30ug/L，样品2加标浓度是50ug/L，样品3加标浓度是100ug/L。分别安2.1.5的两种处理方法处理，得到样品的加标回收率见表3-6和表3-7。
表3-6　液液萃取测定的加标回收率
Table 3-6 standard addition recovery rate for the determination of liqu