免疫细胞的分离及检测技术.pptx

第十四章第十四章 免疫细胞的分离及免疫细胞的分离及其表面标志检测技术其表面标志检测技术第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 一、一、外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 二、二、淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 三、三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 四、四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 一、一、细胞表面标志及亚群细胞表面标志及亚群 二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测及应用 一、一、免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法 二、二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义思考题思考题小结小结 第一节第一节 免疫细胞的分离免疫细胞的分离 外周血单个核细胞分离外周血单个核细胞分离 淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离 T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离 T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离一、外周血单个核细胞分离一、外周血单个核细胞分离 外周血单个核细胞外周血单个核细胞（peripheralmononuclearcells,PMNC）包括淋巴细胞和单核细胞包括淋巴细胞和单核细胞（monocyte）。）。Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。细胞分离基本原理细胞分离基本原理不同细胞密度不同不同细胞密度不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面生物学特性不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞表面分化抗原不同不同细胞密度不同不同细胞密度不同人的红细胞密度为人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞密度不同不同细胞密度不同用用1.0770.0011.0770.001的分层液可将细胞分离的分层液可将细胞分离 密度梯度离心密度梯度离心(Ficoll)(Ficoll)离心离心二二、淋巴细胞分离、淋巴细胞分离贴壁粘附法贴壁粘附法 吸附柱过滤法吸附柱过滤法 磁铁吸引法磁铁吸引法 Percoll Percoll 分离液法分离液法 （连续密度梯度离心）（连续密度梯度离心）（去单核细胞）（去单核细胞）E E花环沉降法花环沉降法 尼龙毛柱分离法尼龙毛柱分离法 三、三、T T细胞和细胞和B B细胞的分离细胞的分离四、四、T T细胞亚群的分离细胞亚群的分离 亲和板结合分离法亲和板结合分离法 磁性微球分离法磁性微球分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 荧光激活细胞分离仪分离法荧光激活细胞分离仪分离法 磁珠大小可以选择磁珠大小可以选择大小免疫磁珠分离细胞的特点比较大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目比较项目大磁珠大磁珠小磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞的影响对对细细胞胞造造成成机机械械压压力力，影影响响其其生生物物学学活活性性，不不利利于于分分离离后培养。后培养。对对细细胞胞温温和和，不不影影响响分分离离细细胞的后续培养。胞的后续培养。对流式细胞仪的影响对流式细胞仪的影响阻阻塞塞流流式式细细胞胞仪仪的的喷喷嘴嘴，影影响散射光。响散射光。可可直直接接上上流流式式细细胞胞仪仪检检测测，不影响散射光。不影响散射光。分离条件要求分离条件要求技技术术简简单单，分分离离可可在在试试管管中中完成。完成。需要很强的磁场来分离细胞。需要很强的磁场来分离细胞。收率收率得率高。得率高。得率不高。得率不高。纯度纯度纯度低。纯度低。纯度高。纯度高。分离时间分离时间分离速度快。分离速度快。分离速度慢。分离速度慢。分离成本分离成本成本低。成本低。需需要要很很强强的的磁磁场场来来分分离离细细胞胞，需需要要一一次次性性的的分分离离柱柱，不不能能在普通试管进行。在普通试管进行。免疫磁珠法细胞分选过程免疫磁珠法细胞分选过程免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置全自动细胞分选系统全自动细胞分选系统流式细胞分析仪流式细胞分析仪第二节第二节 淋巴细胞标志及亚群分类淋巴细胞标志及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗原（是簇分化抗原（Cluster of Cluster of differentiationdifferentiation，CDCD）。）。细胞表面分化抗原（细胞表面分化抗原（CDCD抗原抗原）适用于适用于T T、B B细胞的分离细胞的分离已知已知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离未知未知CDCD抗原细胞亚群的分离抗原细胞亚群的分离（阴性分选）（阴性分选）一、一、T T细胞表面标志及其亚群细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性辅助性T细胞细胞（helpTcell,Th）CD3+CD4-CD8+细胞毒性细胞毒性T细胞细胞（cytotoxicTcell,TcorCTL）CD4+CD25+调节性调节性T细胞细胞（regulatoryTcell,TrorTreg）二、二、B B细胞表面标志细胞表面标志 SmIgSmIg、FcFc受体、补体受体、受体、补体受体、EBEB病毒受体，部分病毒受体，部分CDCD分子是分子是B B细胞的重要表面标志，其中以细胞的重要表面标志，其中以SmIgSmIg为为B B细胞所特有，是鉴定细胞所特有，是鉴定B B细胞可靠的指标。细胞可靠的指标。CD19/CD5CD19/CD5分子：可将分子：可将B B细胞区分为细胞区分为B1B1细胞和细胞和B2B2细胞，细胞，B1B1细胞为细胞为CD19CD19和和CD5CD5双阳性，而双阳性，而B2B2细胞细胞仅为仅为CD19CD19阳性，阳性，B2B2细胞为通常所指的细胞为通常所指的B B细胞细胞。三、三、NKNK细胞表面标志细胞表面标志 人类人类NK细胞表面标志主要以细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将来认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴细胞认定为淋巴细胞认定为NK细胞。细胞。T细胞及细胞及NK细胞细胞第三节第三节 其他的免疫细胞其他的免疫细胞抗原提呈类细胞表面标志抗原提呈类细胞表面标志第四节第四节 免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测及应用免疫细胞表面标志的检测方法免疫细胞表面标志的检测方法淋巴细胞表面标志检测的临床意义淋巴细胞表面标志检测的临床意义一、免疫细胞表面标志的检测一、免疫细胞表面标志的检测抗体致敏细胞花环法抗体致敏细胞花环法 免疫细胞化学法免疫细胞化学法 免疫荧光法免疫荧光法 流式细胞分析法流式细胞分析法 二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义二、淋巴细胞表面标志检测的临床意义 淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能淋巴细胞表面标志检测是评价免疫功能的重要指标。的重要指标。对对CD4+CD4+和和CD8+TCD8+T细胞的测定，有助于免细胞的测定，有助于免疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植疫缺陷疾病、自身免疫性疾病和移植排斥反应的监测。排斥反应的监测。临床常见疾病中的临床常见疾病中的T淋巴细胞的变化淋巴细胞的变化思考题思考题1.1.免免疫疫细细胞胞都都包包括括哪哪些些细细胞胞？为为什什么么要要将将其其分分离离纯化？纯化？2.2.淋淋巴巴细细胞胞有有哪哪几几类类细细胞胞？能能用用形形态态学学的的方方法法加加以区别吗？以区别吗？3.3.将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？将细胞分离的原理有哪些？各有什么特点？4.4.形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？形态学相同的一类细胞为什么还要分亚群？5.T5.T细胞和细胞和B B细胞进一步区分亚群的依据是什么？细胞进一步区分亚群的依据是什么？6.6.什么是细胞表面标志？其作用是什么？什么是细胞表面标志？其作用是什么？7.7.细胞表面标志的检测方法有哪些？细胞表面标志的检测方法有哪些？8.8.利利用用细细胞胞表表面面标标志志（CDCD抗抗原原）分分离离细细胞胞的的方方法法有哪几种？有哪几种？9.T9.T细细胞胞、B B细细胞胞、NKNK细细胞胞、单单核核细细胞胞的的主主要要生生物物标志是什么？标志是什么？10.10.淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？淋巴细胞表面标志检测的临床意义是什么？小小 结结淋淋巴巴细细胞胞并并不不是是功功能能单单一一的的群群体体，但但其其在在光光学学显显微微镜镜下下的的形形态态基基本本是是一一样样的的，因因此此要要对对其其进进行行进进一一步步的的分分类类和和观观察察就就不不能能采采用用形形态态学学的的方方法法，而而要要依依靠靠对对其其表表面面标标志志的的检检测测。常常用用于于鉴鉴定定和和检检测测计计数数淋淋巴巴细细胞胞的表面标志是的表面标志是CDCD抗原。抗原。进进一一步步区区分分淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群可可使使某某一一类类淋淋巴巴细细胞胞的的功功能能趋趋向向一一致致和和单单一一。但但目目前前看看来来，还还很很少少有有只只通通过过一一个个CDCD抗抗原原就就能能将将某某一一类类淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群指指示示出出来来的的CDCD抗抗原原，CDCD抗抗原原指指示示出出来来的的淋淋巴巴细细胞胞亚亚群群多多数都是相对特异。数都是相对特异。根根据据T T细细胞胞的的免免疫疫效效应应功功能能和和表表面面CDCD分分子子表表达达至至少少可可以以分分为为：辅辅助助性性T T细细胞胞、细细胞胞毒毒性性T T细细胞胞和和调调节节性性T T细细胞胞；SmIgSmIg为为B B细细胞胞所所特特有有，是是鉴鉴定定B B细细胞胞可可靠靠的的指指标标，以以CD5CD5和和CD19CD19为为标标志志可可将将B B细细胞胞分分为为B1B1和和B2B2两两 个个 亚亚 群群；目目 前前 多多 以以 CD3-CD3-、CD16+CD16+、CD56+CD56+作为作为NKNK细胞的典型标志。细胞的典型标志。