PCR操作规范.pptx

一、临床基因扩增检验实验室的一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求二、各阶段操作要求三、三、PCR污染与对策污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析四、因操作欠规范导致的问题分析一、临床基因扩增检验实验室的一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其各室的功能规范化设置及其各室的功能规范化设置：规范化设置：要求参照要求参照临床基因扩增检验实临床基因扩增检验实验室管理暂行办法验室管理暂行办法（卫医发（卫医发200210号文）附件号文）附件临床基因扩增检验实验临床基因扩增检验实验室基本设置标准室基本设置标准。1 1.四个隔开的工作区域中每一区域都须有四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用专用的仪器设备。的仪器设备。2.明确的明确的标记标记，如加样器或试剂等。，如加样器或试剂等。3.单一方向单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、顺序，从试剂贮存和准备区、标本标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简称扩增区）至产物分析区。称扩增区）至产物分析区。4.使用使用不同颜色不同颜色或有明显区别标志的工作服。或有明显区别标志的工作服。5.实验室的实验室的清洁清洁应按试剂贮存和准备区至扩增应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。产物分析区的方向进行。6.各自各自的清洁用具。的清洁用具。各室功能：各室功能：（一）试剂贮存和准备区（一）试剂贮存和准备区功能：功能：贮存试剂的制备、试剂的分装和主贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备反应混合液的制备。含含含含反反反反应应应应混混混混合合合合液液液液的的的的离离离离心心心心管管管管或或或或试试试试管管管管在在在在冰冰冰冰冻冻冻冻前前前前都都都都应快速离心数秒。应快速离心数秒。应快速离心数秒。应快速离心数秒。戴手套。戴手套。戴手套。戴手套。工作结束后必须立即对工作区进行工作结束后必须立即对工作区进行工作结束后必须立即对工作区进行工作结束后必须立即对工作区进行清洁清洁清洁清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（实验台表面，使用可移动紫外灯（实验台表面，使用可移动紫外灯（实验台表面，使用可移动紫外灯（254254nmnm波长）波长）波长）波长）照射，一般照射过夜。照射，一般照射过夜。照射，一般照射过夜。照射，一般照射过夜。实验室及其设备的使用必须有实验室及其设备的使用必须有实验室及其设备的使用必须有实验室及其设备的使用必须有日常记录日常记录日常记录日常记录。（二）标本制备区（二）标本制备区功能：功能：临床标本的保存，核酸（临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定管和测定RNA时时cDNA的合成。的合成。要要要要正确正确正确正确使用加样器。使用加样器。使用加样器。使用加样器。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须须须须盖好盖好盖好盖好含反应混合液的反应管。含反应混合液的反应管。含反应混合液的反应管。含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料，必须有对具有潜在传染危险性的材料，必须有对具有潜在传染危险性的材料，必须有对具有潜在传染危险性的材料，必须有明确明确明确明确的样的样的样的样本处理和灭活程序。本处理和灭活程序。本处理和灭活程序。本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。用于用于用于用于RNARNA扩增检测的样本制备好以后，应扩增检测的样本制备好以后，应扩增检测的样本制备好以后，应扩增检测的样本制备好以后，应立即立即立即立即进进进进行行行行cDNAcDNA合成。合成。合成。合成。（三）扩增区（三）扩增区功能：功能：DNA或或cDNA扩增扩增。已已制制备备的的DNA模模板板和和合合成成的的cDNA的的加加入入和和主主反反应应混混合合液液制制备备成成反反应应混混合合液等也可在本区内进行。液等也可在本区内进行。在在巢巢式式PCR测测定定中中，第第二二次次加加样样必必须在本区内进行。须在本区内进行。可可降降低低本本区区的的气气压压以以避避免免气气溶溶胶胶从从本区漏出。本区漏出。如有加样则应在超净台内进行。如有加样则应在超净台内进行。打开反应管前快速离心数秒。打开反应管前快速离心数秒。（四）扩增产物分析区（四）扩增产物分析区功能：功能：扩增片段的测定。扩增片段的测定。膜膜上上微微孔孔板板上上探探针针杂杂交交方方法法、Southern转转移移、琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳、聚聚丙丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。本本区区是是最最主主要要的的扩扩增增产产物物污污染染来来源源。溴溴化化乙乙锭锭、丙丙烯烯酰酰胺胺、甲甲醛醛或或同同位位素素等等有有毒毒或或致致癌癌物物质质，注注意意实实验验人人员员的的安安全全防护防护。负压条件。负压条件。二、各阶段操作要求二、各阶段操作要求测测定定分分析析前前的的标标本本采采集集处处理理、测测定定中中的的核核酸酸提提取取、扩扩增增和和产产物物分分析析以以及测定后的结果报告等。及测定后的结果报告等。（一）标本的采集（一）标本的采集 临临临临床床床床标标标标本本本本包包包包括括括括EDTAEDTA或或或或枸枸枸枸橼橼橼橼酸酸酸酸钠钠钠钠抗抗抗抗凝凝凝凝全全全全血血血血或或或或骨骨骨骨髓髓髓髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。EDTAEDTA和和和和枸枸枸枸橼橼橼橼酸酸酸酸盐盐盐盐是是是是首首首首选选选选的的的的抗抗抗抗凝凝凝凝剂剂剂剂。不不不不能能能能使使使使用用用用肝肝肝肝素素素素抗凝，因抗凝，因抗凝，因抗凝，因肝素是肝素是肝素是肝素是TaqTaq酶的强抑制剂酶的强抑制剂酶的强抑制剂酶的强抑制剂。玻玻玻玻璃璃璃璃器器器器皿皿皿皿在在在在使使使使用用用用前前前前应应应应高高高高压压压压处处处处理理理理，250250烘烘烘烘烤烤烤烤4 4小小小小时时时时以以以以上可使上可使上可使上可使RNARNA酶永久性失活。酶永久性失活。酶永久性失活。酶永久性失活。临临临临床床床床用用用用于于于于RNARNA（如如如如HCVHCVRNARNA）扩扩扩扩增增增增检检检检测测测测的的的的血血血血标标标标本本本本应尽快（应尽快（应尽快（应尽快（3 3小时以内小时以内小时以内小时以内）分离血浆，以避免）分离血浆，以避免）分离血浆，以避免）分离血浆，以避免RNARNA的降解。的降解。的降解。的降解。（二）标本的稳定化处理（二）标本的稳定化处理DNA：不需特殊稳定化处理。不需特殊稳定化处理。RNA：异硫氰酸胍盐（异硫氰酸胍盐（GITC）可使可使DNA酶和酶和RNA酶失活。酶失活。（三）标本的运送（三）标本的运送可在常温下通过邮寄运送，如用于可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的扩增检测的EDTA抗凝全血及用于抗凝全血及用于RNA扩增检测的扩增检测的GITC稳定化处理的标本。稳定化处理的标本。未经稳定化处理，则必须速冻后，放未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。在干冰中运送。（四）标本的贮存（四）标本的贮存1.血清血清/血浆等血浆等-702.用于用于DNA测定的已测定的已纯化核酸纯化核酸样本样本43.用于用于RNA测定的已纯化核酸样本测定的已纯化核酸样本-804.用乙醇沉淀的核酸样本用乙醇沉淀的核酸样本-205.GITC处理的处理的RNA标本在室温可保存标本在室温可保存7天天（五）标本的处理（核酸提取）（五）标本的处理（核酸提取）抑制物抑制物可能来源于：可能来源于：标本本身（如血红素及其前体或降标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。解产物）。核酸提取过程中残留的有机溶剂核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。（如酚、氯仿等）。痰须液化处理。痰须液化处理。操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：注意：注意：注意：离心管不能插得过低，以防进水；离心管不能插得过低，以防进水；离心管不能插得过低，以防进水；离心管不能插得过低，以防进水；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时间须准确，水浴时间须准确，水浴时间须准确，水浴时间须准确，101101minmin；水浴时不能走开；水浴时不能走开；水浴时不能走开；水浴时不能走开；左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。及操作仪器。及操作仪器。及操作仪器。（六）靶核酸的逆转录（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增和扩增有有多多种种因因素素可可引引起起核核酸酸扩扩增增检检测测假假阴阴性性结结果果，如如扩扩增增靶靶核核酸酸中中抑抑制制剂剂存存在在、Taq酶酶失失活活、退退火火温温度度不不对对、Mg+浓浓度度不不佳佳、患患者者标标本本或或试试剂剂受受污污染等。染等。扩增仪孔中热传导的扩增仪孔中热传导的均一性均一性极为极为重要。重要。RT-PCR操作注意：操作注意：标本必须新鲜；标本必须新鲜；标本必须新鲜；标本必须新鲜；做做做做RNARNA标本的枪头离心管必须无菌；标本的枪头离心管必须无菌；标本的枪头离心管必须无菌；标本的枪头离心管必须无菌；冰上操作；冰上操作；冰上操作；冰上操作；处理完后须立即上机，不能放置；处理完后须立即上机，不能放置；处理完后须立即上机，不能放置；处理完后须立即上机，不能放置；注意左右手分开。注意左右手分开。注意左右手分开。注意左右手分开。（七）扩增产物的分析（七）扩增产物的分析扩扩增增产产物物的的测测定定有有各各种种方方法法，如如电电泳泳、限限制制性性酶酶切切、斑斑点点印印迹迹、探探针针杂交、测序、分光光度法定量等。杂交、测序、分光光度法定量等。实时荧光定量PCR在荧光定量在荧光定量PCRPCR基础上实时监测基础上实时监测PCRPCR全过程，最后全过程，最后通过曲线进行定量分析。通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量与一般荧光定量PCRPCR使用荧光强度定量不同，实使用荧光强度定量不同，实时荧光时荧光PCRPCR一般使用一般使用CtCtCtCt（每个反应荧光信号达（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，到设定域值所经的循环数）定量，CtCtCtCt与模板初与模板初始拷贝数的对数成线性关系。始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光实时荧光PCRPCR的优点：的优点：精密度高，重复性能好。精密度高，重复性能好。TaqMan荧光定量荧光定量PCR原理原理探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，TaqDNA聚合酶的5-3外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；三、三、PCR污染与对策污染与对策PCR污污染染分分环环境境污污染染与与反反应应液液污污染染二二种种。常见常见PCR污染源有三个：污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第一、标本间的交叉污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第三、第三、PCR产物产物的污染（的污染（Carryover）。）。要防止要防止要防止要防止PCRPCR污染，必须做好以下污染，必须做好以下污染，必须做好以下污染，必须做好以下3 3个环节的工作：个环节的工作：个环节的工作：个环节的工作：（一）污染的预防（二）污染源的追踪（三）污染源的处理（一）污染的预防（一）污染的预防操操作作PCR时时，按按照照下下述述规规则则可可有有效效地地预预防防PCR的污染。的污染。1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔的前处理及后处理要在不同的隔离工作台上或房间内进行。离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标记批号、分装试剂，标记批号3 3、改进实验操作：、改进实验操作：(1)(1)带一次性手套；带一次性手套；带一次性手套；带一次性手套；(2)(2)避免反应液的飞溅；避免反应液的飞溅；避免反应液的飞溅；避免反应液的飞溅；(3)(3)用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于空气，以免产物气溶胶污染；空气，以免产物气溶胶污染；空气，以免产物气溶胶污染；空气，以免产物气溶胶污染；(4)(4)操作多份样品时，要先将可混匀的成分操作多份样品时，要先将可混匀的成分操作多份样品时，要先将可混匀的成分操作多份样品时，要先将可混匀的成分(dNTPsdNTPs，缓冲液，引物等缓冲液，引物等缓冲液，引物等缓冲液，引物等)一起制备标准一起制备标准一起制备标准一起制备标准混合液混合液混合液混合液(Mastermix)Mastermix)；(5)(5)制备反应混合液时，最后加入样品制备反应混合液时，最后加入样品制备反应混合液时，最后加入样品制备反应混合液时，最后加入样品DNADNA，加入加入加入加入DNADNA后，在进行下一步操作前要盖紧后，在进行下一步操作前要盖紧后，在进行下一步操作前要盖紧后，在进行下一步操作前要盖紧反应管。反应管。反应管。反应管。4 4、检查结果的可重复性。、检查结果的可重复性。（二）污染源的追踪（二）污染源的追踪1、阳、阴性对照、阳、阴性对照选择阳性对照时，应选择扩增选择阳性对照时，应选择扩增弱弱，且且重复性好重复性好的样品。的样品。阴性对照的选择一定要小心。阴性对照的选择一定要小心。不含模板不含模板DNA的的PCR试剂对照。试剂对照。2、常见的环境污染源有、常见的环境污染源有(1)(1)点杂交的点样器；点杂交的点样器；点杂交的点样器；点杂交的点样器；(2)(2)切片机；切片机；切片机；切片机；(3)(3)离心机；离心机；离心机；离心机；(4)(4)切胶用刀或微解剖刀；切胶用刀或微解剖刀；切胶用刀或微解剖刀；切胶用刀或微解剖刀；(5)(5)浓缩用具，真空瓶；浓缩用具，真空瓶；浓缩用具，真空瓶；浓缩用具，真空瓶；(6)(6)电泳装置和紫外灯箱；电泳装置和紫外灯箱；电泳装置和紫外灯箱；电泳装置和紫外灯箱；(7)(7)干冰干冰干冰干冰/乙醇或水溶锅；乙醇或水溶锅；乙醇或水溶锅；乙醇或水溶锅；(8)(8)冰箱门把手、冷冻架和门把手。冰箱门把手、冷冻架和门把手。冰箱门把手、冷冻架和门把手。冰箱门把手、冷冻架和门把手。追踪可疑的环境污染源追踪可疑的环境污染源用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分在在0.1ml去离子水中浸泡；去离子水中浸泡；取取5l作作PCR反应；反应；电泳检查结果。电泳检查结果。（三）污染源的处理（三）污染源的处理1.环境污染处理法环境污染处理法（1 1）稀酸处理法稀酸处理法稀酸处理法稀酸处理法。对对对对擦擦擦擦试试试试实实实实验验验验阳阳阳阳性性性性部部部部位位位位或或或或器器器器件件件件可可可可用用用用1 1mol/LHClmol/LHCl擦洗或浸泡残留擦洗或浸泡残留擦洗或浸泡残留擦洗或浸泡残留DNADNA。（2 2）紫外法紫外法紫外法紫外法：UVUV照射波长一般选择照射波长一般选择照射波长一般选择照射波长一般选择254/300254/300nmnm，需考虑需考虑需考虑需考虑PCRPCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。产物的长度与产物序列中碱基的分布。产物的长度与产物序列中碱基的分布。产物的长度与产物序列中碱基的分布。UVUV对长片段（对长片段（对长片段（对长片段（500500bpbp以上）有效，而对短片段以上）有效，而对短片段以上）有效，而对短片段以上）有效，而对短片段效果不大。效果不大。效果不大。效果不大。2.反应液的污染处理法反应液的污染处理法(1)DNaseI法法：PCR混混合合液液（不不加加模模板板和和Taq酶酶）中中加加入入0.5UDNaseI，室室温温下下作作用用30min后后，加加热热灭灭活活，加加入入模模板板和和Taq酶酶后后即即可可进行正常进行正常PCR。优点：便宜，不需知道扩增优点：便宜，不需知道扩增DNA序列。序列。(2)内切酶法内切酶法：选选择择识识别别四四个个碱碱基基的的内内切切酶酶（如如MspI等等），最最好好几几种种合合用用，可可克克服服其其识识别别序序列列特特异异的的缺缺陷陷。方方法法同同上上，只只是是DnaseI由由内内切切酶酶（MspI10U）代代替替，作作用时间延长到用时间延长到1.01.5h。(3)紫外照射法紫外照射法：反应中不加模板与反应中不加模板与Taq酶。酶。(4)尿嘧啶尿嘧啶DNA糖基化酶（糖基化酶（UNG）法法：dUTP代替反应中的代替反应中的dTTP，使产物使产物中含大量中含大量dU，UNG可去除可去除dU，使失去使失去dU的位置，阻止的位置，阻止Taq酶的延伸。酶的延伸。PCR正正常循环前，用常循环前，用UNG处理处理PCR反应混合液反应混合液可消除可消除PCR产物的污染，而产物的污染，而UNG在正常在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对循环变性一步就会失活，所以，对含含dU的新合成的新合成PCR产物没有影响产物没有影响。TATATATATAPCRAUAUAUUNGAAA加热加热AAAPCR该法该法该法该法优点优点优点优点：去除任河来源（包括引物在内）的去除任河来源（包括引物在内）的去除任河来源（包括引物在内）的去除任河来源（包括引物在内）的污染；污染；污染；污染；由于污染的产物有大量由于污染的产物有大量由于污染的产物有大量由于污染的产物有大量dUdU存在，存在，存在，存在，因此，因此，因此，因此，UNGUNG处理会彻底消除污染。处理会彻底消除污染。处理会彻底消除污染。处理会彻底消除污染。UNGUNG处理与处理与处理与处理与PCRPCR扩增可在同一试管扩增可在同一试管扩增可在同一试管扩增可在同一试管内进行。内进行。内进行。内进行。四、因操作欠规范导致的问题分析四、因操作欠规范导致的问题分析（一）实验室仪器设备（一）实验室仪器设备1、设设备备不不齐齐全全、不不配配套套，使使得得实实验验结结果果不稳定，引起假性结果。不稳定，引起假性结果。旋涡混合器旋涡混合器旋涡混合器旋涡混合器，微量加样器，正规的紫外透射仪。，微量加样器，正规的紫外透射仪。，微量加样器，正规的紫外透射仪。，微量加样器，正规的紫外透射仪。RNAPCRRNAPCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强样品处理时，血清（或血浆）中加入强样品处理时，血清（或血浆）中加入强样品处理时，血清（或血浆）中加入强烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。吸头与微量加样器不配套。吸头与微量加样器不配套。吸头与微量加样器不配套。吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪的差异或质量问题。热循环仪的差异或质量问题。移液器：移液器：严禁大力来回拧动；严禁大力来回拧动；严禁大力来回拧动；严禁大力来回拧动；严禁调至容量之外使用；严禁调至容量之外使用；严禁调至容量之外使用；严禁调至容量之外使用；第二档为排空档，不得作吸取之用；第二档为排空档，不得作吸取之用；第二档为排空档，不得作吸取之用；第二档为排空档，不得作吸取之用；吸头应浸入液面吸头应浸入液面吸头应浸入液面吸头应浸入液面2323mmmm处吸取；处吸取；处吸取；处吸取；严禁将有液体的移液器平放或倒置；严禁将有液体的移液器平放或倒置；严禁将有液体的移液器平放或倒置；严禁将有液体的移液器平放或倒置；混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；液体，将沉淀反复混匀，溶解；液体，将沉淀反复混匀，溶解；液体，将沉淀反复混匀，溶解；每周用每周用每周用每周用75%75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。离心机：离心机：离心前，离心管须配平；离心前，离心管须配平；将调速档打至将调速档打至0档位，才能打开电源档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；开关，逐渐升高转速，直至即定转速；定时旋钮不能强行归零；定时旋钮不能强行归零；转头未停止时，严禁打开盖板。转头未停止时，严禁打开盖板。（二）实验室布局不合理引起的污染问题（二）实验室布局不合理引起的污染问题1 1、样品处理不进行隔离，、样品处理不进行隔离，、样品处理不进行隔离，、样品处理不进行隔离，样品中各种核酸片样品中各种核酸片样品中各种核酸片样品中各种核酸片段均会通过空气进行传播段均会通过空气进行传播段均会通过空气进行传播段均会通过空气进行传播。2 2、PCRPCR结果检测实验室和其它实验室在一结果检测实验室和其它实验室在一结果检测实验室和其它实验室在一结果检测实验室和其它实验室在一起，起，起，起，会出现严重的扩增子污染会出现严重的扩增子污染会出现严重的扩增子污染会出现严重的扩增子污染。3 3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公用，用，用，用，也会造成严重污染。也会造成严重污染。也会造成严重污染。也会造成严重污染。4 4、实验室操作垃圾（、实验室操作垃圾（、实验室操作垃圾（、实验室操作垃圾（吸头、离心管、样品杯吸头、离心管、样品杯吸头、离心管、样品杯吸头、离心管、样品杯 等等等等）乱）乱）乱）乱 放，放，放，放，飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室污染。污染。污染。污染。（三）（三）PCR操作中存在问题分析操作中存在问题分析1.阳性变阴性阳性变阴性2.阴性变阳性阴性变阳性3.PCR结果不稳定结果不稳定1.阳性变阴性阳性变阴性(1)有有些些阳阳性性病病人人，经经过过PCR检检测测后后为为阴阴性，可能有两种情况：性，可能有两种情况：一是采集标本方法或部位不正确，一是采集标本方法或部位不正确，二二是是如如果果病病人人取取样样部部位位病病原原体体消消失失，需需根据病人的病理情况采样。根据病人的病理情况采样。(2)(2)标本保存不当，可引起标本保存不当，可引起标本保存不当，可引起标本保存不当，可引起PCRPCR失败。失败。失败。失败。收收收收集集集集的的的的标标标标本本本本乱乱乱乱放放放放（未未未未放放放放冰冰冰冰箱箱箱箱），病病病病原原原原体体体体的的的的破破破破裂裂裂裂，检检检检测测测测的的的的核核核核酸酸酸酸降降降降解解解解，失失失失去去去去了了了了PCRPCR检检检检测测测测的的的的模模模模板或造成标本污染。板或造成标本污染。板或造成标本污染。板或造成标本污染。2.阴性变阳性阴性变阳性常见的原常见的原因有以下因有以下6点：点：加入试剂或样品时引起的交叉污染加入试剂或样品时引起的交叉污染（最好在加完所有其他反应成分，包（最好在加完所有其他反应成分，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板模板DNA，将模板加入微量离心管后，盖好将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心10秒秒，使水相和有机相分开）。，使水相和有机相分开）。加样器通道易形成气溶胶，造成加样器加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染免污染（将模板（将模板DNA加入加入PCR系统时，注系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。反应，所有并非即用管都应盖严）。打开标本管盖引起样品飞溅打开标本管盖引起样品飞溅（打开前须瞬间离心）（打开前须瞬间离心）操作时手套引起的交叉污染操作时手套引起的交叉污染（拿过模板（拿过模板DNA管后应更换手套）管后应更换手套）不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染 （必必必必须须须须设设设设置置置置一一一一个个个个不不不不含含含含模模模模板板板板DNADNA但但但但含含含含PCRPCR系系系系统统统统中中中中所所所所有有有有其其其其他他他他成成成成分分分分的的的的对对对对照照照照反反反反应应应应。这这这这一一一一对对对对照照照照管管管管须须须须在在在在准准准准备备备备好好好好所所所所有有有有其其其其他他他他PCRPCR以以以以后后后后才才才才进进进进行行行行吸吸吸吸加加加加）。实验室污染实验室污染实验室污染实验室污染3.PCR检测结果不稳定检测结果不稳定（1 1）样品处理方法不当，标本中杂质很多，）样品处理方法不当，标本中杂质很多，）样品处理方法不当，标本中杂质很多，）样品处理方法不当，标本中杂质很多，血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质DNADNA电泳带拖尾电泳带拖尾电泳带拖尾电泳带拖尾血红素中的卟啉化合物血红素中的卟啉化合物血红素中的卟啉化合物血红素中的卟啉化合物抑制抑制抑制抑制TaqTaq酶活性酶活性酶活性酶活性代谢产物代谢产物代谢产物代谢产物干扰引物配对干扰引物配对干扰引物配对干扰引物配对（2）操作不当带来的后果）操作不当带来的后果主要指不能严格按照说明进行操作主要指不能严格按照说明进行操作造成造成PCR检测失败。检测失败。如如HCVRNAPCR样品处理试剂样品处理试剂A、B、C和和75%乙醇的操作过程。乙醇的操作过程。50l血清标本血清标本(标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂，标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂，标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂，标本可用血清或血浆，尽量避免使用肝素做抗凝剂，避免反复冻融避免反复冻融避免反复冻融避免反复冻融)加加200l试剂试剂A后立即混匀后立即混匀(试剂试剂试剂试剂A A是强烈的是强烈的是强烈的是强烈的变性剂变性剂变性剂变性剂，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放，不仅要将病毒外壳变性裂解，释放核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括核酸，而且要将样品中包含的其它蛋白（包括RNaseRNase）变性，变性，变性，变性，以避免蛋白进入以避免蛋白进入以避免蛋白进入以避免蛋白进入PCRPCR反应体系（反应体系（反应体系（反应体系（RNaseRNase降解降解降解降解RNARNA模板），干模板），干模板），干模板），干扰扰扰扰PCRPCR扩增；扩增；扩增；扩增；混匀混匀混匀混匀这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才这一步至关重要，一定要振荡混合均匀才能达到充分变性的结果。能达到充分变性的结果。能达到充分变性的结果。能达到充分变性的结果。)加入试剂加入试剂B（氯仿、异戊醇）氯仿、异戊醇）50l混匀混匀（抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分（抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分（抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分（抽取变性剂及变性的蛋白，分离出核酸，同样必须充分混匀混匀混匀混匀，否则也会引起，否则也会引起，否则也会引起，否则也会引起PCRPCR检测失败检测失败检测失败检测失败)14000r/min离心离心5min取上清取上清80100l(取上清一定要取上清一定要取上清一定要取上清一定要小心小心小心小心，不能抽取中间蛋白沉淀层，否则，不能抽取中间蛋白沉淀层，否则，不能抽取中间蛋白沉淀层，否则，不能抽取中间蛋白沉淀层，否则因核酸沉淀中含有变性蛋白，引起因核酸沉淀中含有变性蛋白，引起因核酸沉淀中含有变性蛋白，引起因核酸沉淀中含有变性蛋白，引起PCRPCR检测失败检测失败检测失败检测失败)加等体积试剂加等体积试剂加等体积试剂加等体积试剂C14000r/minC14000r/min离心离心离心离心1010minmin，弃上清弃上清弃上清弃上清(将核酸从水溶液中沉淀浓缩将核酸从水溶液中沉淀浓缩将核酸从水溶液中沉淀浓缩将核酸从水溶液中沉淀浓缩)用用75%乙醇洗一次乙醇洗一次(除去与核酸共沉淀的盐及杂质除去与核酸共沉淀的盐及杂质除去与核酸共沉淀的盐及杂质除去与核酸共沉淀的盐及杂质)干燥备用干燥备用 (干干干干燥燥燥燥后后后后，切切切切勿勿勿勿将将将将管管管管子子子子倒倒倒倒置置置置或或或或掉掉掉掉落落落落，防防防防止止止止沉沉沉沉淀淀淀淀飞飞飞飞出出出出管管管管底底底底)在在痰痰标标本本处处理理时时液液化化是是十十分分重重要要的的，痰痰没没有有彻彻底底液液化化，病病原原体体不不能能完完全全释释放放出出来来；反反之之液液化化过过度度会会使使病病原原体体裂裂解解，导致导致PCR检测失败。检测失败。总之，总之，样品处理样品处理对对PCR检测是至关检测是至关重要的，是导致重要的，是导致PCR检测失败的最常见检测失败的最常见原因之一。原因之一。