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医学科研设计申报实例解析南京中医药大学附属医院高 坤国家自然科学基金青年项目尿液microRNA检测及其在肾脏纤维化诊断中的意义探讨（一）立项依据（一）立项依据与研究内容（一）立项依据与研究内容（4000-8000字）：1项目的立项依据项目的立项依据（研究意义、国内外研究现状及发展动态分析，需结合科学研究发展趋势来论述科学意义；或结合国民经济和社会发展中迫切需要解决的关键科技问题来论述其应用前景。附主要参考文献目录）；立项依据讲究的是研究的意义及科学意义，或者关键科技问题、应用前景，这是立项依据的主要部分。国内外研究现状以及发展动态分析，只是一部分。科学问题凝练过程科学问题的凝练问项答域提问的内容对求解范围的限定全域类域特域对于解答范围不给予任何限制的科学问题此类问题往往会作为“潜问题”而根植于研究者的脑中。此类问题对科学探索的指导作用较差。但对其解答一旦获得突破，通常会对人类的认知产生划时代的影响。若对某科学问题有了初步认识,希望能进一步深入,问题的解答范围即相应有了一定程度的限定。对此类问题的限定范围越具体，对科学的指导性就越强，相应的研究也越深入。此类问题往往代表了科学研究的最前沿，致力于解决此类稳定研究人员必须不断跟踪该领域的最新研究动态，不断丰富自己的相关知识。一旦科学问题的答域限定为某个具体答案，此时的答域称为特域。研究者根据科学推理给出尝试性解答或假说。通常是随着信息的逐渐积累，研究者根据科学推理给出的尝试性解答或假说。解答或假说提出的同时也就提出了判断其是非的可能陈越,温明章,杜生明.从自然科学基金项目申请看科学问题的凝练.科学通报,2006,51(7):870872（一）立项依据 1、慢性肾脏病的流行病学及发病机制 早期诊断CKD，及时预防和延缓其进展为ESRD已成为公共健康领域面临的重大课题。如何对RF过程实施无创、有效、动态的监测成为临床CKD防治中亟待解决的关键科学问题，也是肾脏病转化医学研究面临的重大挑战。关键科学问题（全域）：如何对RF过程实施无创、有效、动态的监测（一）立项依据 2、肾脏纤维化生物标志物研究现状 检测体液中肾脏纤维化相关细胞学事件发生过程中标志物的变化，将有可能为临床早期积极诊治RF提供新颖的技术手段。3、microRNA的发现及其在肾脏纤维化中的研究 众多miRNA参与了肾脏纤维化这一复杂的病理学过程,检测相关miRNA可能成为反应RF发生发展的重要标志物。关键科学问题（类域）：检测尿液标志物可能反应肾脏病的细胞学事件（一）立项依据 4、肾脏病尿液生物标志物研究及尿液miRNA的检测 大量研究表明，尿液中某些致病相关因子（蛋白、基因等）的有无、量的多少及变化趋势与肾脏疾病发生、发展和转归密切关联。从尿液中寻找反应RF生物标志物可能是无创性诊断及监测CKD 的重要突破口。尿液（上清/沉渣）miRNA 可以检测，且尿液miRNA 水平可反应肾脏病的进展。因此，筛查尿液miRNA 水平可作为肾脏病新型生物标志物研究的崭新技术平台。关键科学问题（特域）：检测尿液miRNA能否反映肾脏纤维化（一）立项依据 科研假设：CKD患者尿液中存在与RF发生及进展密切相关的miRNA，通过对CKD患者尿液miRNA检测，依循从筛查到验证的系统生物学研究方法，为肾脏纤维化寻找到新型、无创的生物标志物。（一）立项依据解析肾脏病早期诊断生物标志物microRNA肾纤维化（一）立项依据 2.项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键科学问题。研究内容由科学问题组成提炼出有关本选题的1-2个科学假说，完成申请书研究内容的写作35个方面的内容（一）立项依据2.1 研究内容2.1.1 临床标本收集CKD诊断和分期根据NKF-DOQI指南，以肾脏病理纤维化改变评分为标准，将CKD患者分为4级，以无高血压、肝肾疾病的健康体检者为正常对照组。对确诊CKD不同分组病人进行为期2年的前瞻性随访研究，同时收集尿液标本（上清/沉渣）。为了防止标本收集和处理的差异所带来的偏倚，所有标本收集遵循统一流程，建立标本库。同时收集不同分组病人及对照组的临床资料，包括年龄、性别、体重指数、血清肌酐、蛋白尿水平等，并对可能的混杂因素如年龄、性别、体重指数等进行匹配，以防止生物标志物分析时出现偏倚。所有临床数据采用电子化软件管理，建立专门用于尿液miRNA标志物筛查的标本库。2.1.2 应用miRNA 芯片对尿液miRNA 的筛查研究利用miRNA 芯片对不同分期CKD 患者（包括纤维化程度分期）及健康对照尿液标本miRNA 进行检测，寻找在不同分组表达差异的miRNA，从而初步筛选出在不同分组存在显著表达差异和与临床肾功能、病理纤维化程度有密切相关性的miRNA。此部分研究主要目标为寻找有可能成为肾脏肾脏纤维化诊断标志物的靶分子，选取有意义的miRNA 进入下一阶段的验证研究。关键科学问题：检测尿液miRNA反映肾脏纤维化（一）立项依据 2.1.3 尿液miRNA 的real-time PCR验证研究 收集另外一批不同分期CKD 病人标本和临床资料，对筛查阶段所获取的差异表达miRNA 进行real-time PCR验证,病理关联分析等验证研究，包括初期临床验证、回顾性临床验证和随访验证。1.描述了：尿液收集、miRNA检测2.未清晰描述纤维化内容及相关指标（一）立项依据 2.2 研究目标 研究目标应该明确、简洁，突出项目的科学性和学术性。科学基金的目标不是追求有研究过程，而是在这过程中以特定的思路去达到预期的科学目的。研究目标应该是从科学问题和研究内容出发，借助一定的手段，通过一定的途径，对拟探索的科学问题有了理解之后所能达到的位置 撰写时应避免研究目标和研究内容相混淆和相似。归纳、凝练好的研究目标应该是项目的科学指向。（一）立项依据 2.2 研究目标 在既往对肾脏纤维化发生机制和尿液基因检测研究基础上，依循生物标志物从发现到验证的研究途径，探讨尿液中肾脏纤维化相关miRNA的诊断价值，为临床肾脏纤维化诊断提供敏感、无创的检测指标。关键科学问题：检测尿液miRNA反映肾脏纤维化（一）立项依据 2.3 拟解决的关键问题 拟解决的关键问题关键问题指的是拟解决的关键科学问题而不是要攻克的技术难题技术难题。科学假说的提出才能真正回答“拟解决的关键问题”（一）立项依据2.3 拟解决的关键问题（1）应用miRNA 芯片对不同分期CKD 患者（包括纤维化程度分期）及健康对照尿液标本miRNA 进行检测，初步分析尿液中各miRNA水平与肾脏纤维化程度、肾功能、蛋白尿水平等临床指标的关系；探讨高通量生物标志物研究数据分析方法，发现可能的联合分子表达谱标志物。（2）通过对可能标志物的系统验证研究，评价生物标志物的早期诊断价值，并分析其敏感性、特异性、阴性预测值(negative predictive value,NPV),阳性预测值（positive predictive value,PPV)，初步完成生物标志物临床评价。关键科学问题：检测尿液miRNA反映肾脏纤维化关键科学问题与关键技术问题有些混淆1.尿液miRNA能否反映肾脏损伤？2.是否存在联合的分子表达谱标志物研究方案及可行性17 技术方案要详细，避免试验方法过于细致，避免过多的技术堆砌。避免明显的技术错误。尽可能使用经典、公认的研究方法。告诉你怎么做，但对具体技术无需解释。3.拟采取的研究方案3.1 拟采取的研究方案3.1.1 临床病例分组及标本收集3.1.1.1 临床病例分组3.1.1.2 尿液标本收集3.1.2 标本总RNA 提取3.1.3 肾脏纤维化相关miRNA 芯片检测（1）miRNA标记：使用丹麦Exiqon公司的miRCURYTM Array Power Labeling kit分别标记相关标本。（2）miRNA 芯片杂交:主要实验步骤如下：（3）miRNA 芯片扫描和分析3.1.4 Real-Time PCR 对芯片筛查差异表达miRNA 的验证（1）设计并合成目的miRNA 的茎环RT 引物，利用该引物对总RNA 进行逆转录合成cDNA。（2）设计靶miRNA 特异性PCR 扩增引物，进行real-time PCR 扩增3.1.5 肾脏纤维化组织病理改变与肾组织miRNA 检测3.1.6 肾脏纤维化生物标志物研究3.拟采取的研究方案3.1.6 肾脏纤维化生物标志物研究1、研究流程（1）生物标志物筛查研究（screening-stage）（2）生物标志物验证研究（validation-stage）1）初期临床验证研究2）生物标志物的回顾性纵向研究（retrospective longitudinal study）3）生物标志物的前瞻性研究（Prospective Screening Study）2、分析方法（1）数据初步统计分析（2）ROC 曲线、阴性预测值和阳性预测值评价（3）相关性分析（4）多因子联合诊断分析3.拟采取的研究方案3.1.3 肾脏纤维化相关miRNA 芯片检测操作步骤过于详细研究方案，其实就是实验设计的具体实施步骤。研究方案，本质上，是研究内容(目标)的具体描述。当然，这个描述，不是记流水账，一定要按照研究内容的几个方面，进行详述。不能写成记流水账。技术路线21简洁明了蕴含信息量大基本反应项目研究内容可以整个项目用一个，也可以分为几个。如果是分为几个，那就每个技术路线，都要说明一个小的故事。这几个部分，组成一个完整的大故事。完成技术路线图粗样=完成研究方案的一半技术路线3.2.1 临床病例收集与检测技术路线3.2.2 肾脏纤维化尿液miRNA 生物标志物研究流程可行性分析24 理论上是否可行 实验设计是否合理 重点放在研究方法和研究方案的可行性上：已掌握的研究方法、材料来源、实验条件 前期工作基础；项目组人员结构。可行性分析除了对本单位的研究实力进行恰当的分析外，关键技术不具备或者不强，可以找一家比自己单位强的合作伙伴或者协作单位，把他们的软硬件条件也加进去。（但是合作单位不宜太多）可行性分析 3.3 可行性分析（1）研究工作基础扎实：（2）研究条件具备：（3）课题组成员结构合理：（4）课题相关前期工作充足创新性与特色26 选题创新选题创新和学术创新学术创新。项目的特色和创新之处就是指有别于他人的学术思想或思。最好是一种思上的新解，以独特的角度看旧的问题，或者提出新问题和新的视角。创新的程度取决于自己的想象能否比别人走得远。项目特色或创新之处实际上是基金项目的点睛之笔，是申请者想象力、洞察力和逻辑思考的必然结果 是对科学问题和研究思路充分论证之后的自然结果。创新性要具体。避免运用*先进技术，在技术上有很好的创新性，运用某某材料，在材料上有所创新。创新性与特色4.本项目的特色与创新之处。（1）研究思路创新：肾脏纤维化目前缺乏无创、特异的监测方法，寻找病理诊断之外的动态监测方法，是目前CKD 领域转化医学的重要任务，对提高CKD 诊治水平具有十分重要的意义。本研究首次利用miRNA芯片探索尿液肾脏纤维化相关miRNA，并进一步使用系统的临床生物标志物研究策略，发现并验证肾脏纤维化诊断生物标志物，评价体系完整，研究设计严谨。（2）理论和实践意义重大：研究结果将为促进临床进一步完善肾脏纤维化诊断条件提供理论依据，同时对提高临床CKD 早期诊治水平、疗效监测、新型药物评价和降低ESRD发生率具有重大意义。首次采用了某技术早期诊断、疗效检测、药物评价等 年度研究计划应该尽量具体一些，主要体现项目的研究进度和工作安排。结合研究方案，再加上时间进度安排，就能产生很好的年度研究计划。“一年一句话”式的表述不应该称作研究计划，只能算作研究计划纲要。年度计划5.年度研究计划及预期研究结果5.1 年度研究计划（1）2013 年1 月2013 年12 月完成实验前期准备工作，定制miRNA检测芯片，收集临床病人标本和资料。（2）2014 年1 月2014 年12 月进行前期工作的小结，对筛查组标本提取RNA，并完成miRNA芯片的检测，利用real-time PCR技术验证差异表达的miRNA。撰写发表论文1-2 篇，参加国际、国内性学术会议2-3人次，交流学术论文2-3篇。（3）2015 年1 月2015 年12 月对验证组标本完成随访和尿液标本收集、RNA提取，对可能的基因标志物进一步验证和系统评价。参加国际、国内性学术会议2-3人次，总结论文发表，撰写论文2-3篇，进行课题结题汇报。预期结果 预期研究结果更多地应该体现在与学术有关的产出上，与项目的研究内容、研究目标、科学问题有密切的关系，应该与之有所呼应。重心最好放在研究工作的质量上，不是简单地发表多少论文，也不是发表多高影响因子的论文。完成的工作发表之后最好能够产生一定的影响，或者有助于解决一些实际问题。5.年度研究计划及预期研究结果 5.2 预期研究结果（1）通过临床病例标本的研究，遵循尿液miRNA芯片筛查至real-time PCR技术验证差异表达miRNA的过程，通过系统生物标志物研究方法，发现肾脏纤维化无创、敏感的基因诊断标志物。（2）研究成果主要以学术论文形式提供，预计在国内外核心期刊发表论文4-6 篇，其中SCI 收录论文2-3 篇(含影响因子3.0 以上论文1-2 篇)，国际会议交流论文3-4 篇，申请国家发明专利1 项研究基础 申报项目的相关前期基础展示一定要全面。用图表展示你前期的工作基础是很好的选择，要尽量详细。拿完成的工作来写标书，不可。体现自己的科研能力 论文撰写能力 平台协作能力 研究经历（二）研究基础与工作条件1、工作基础（与本项目相关的研究工作积累和已取得的研究工作成绩）Zheng M,et al PLoS One 2011,6:e20431;Zheng M,et al Clin Endocrinol(Oxf)（Zheng M,et al PLoS One，minor revise）前期有相关论文发表基础较好（二）研究基础与工作条件2、工作条件（包括已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径，包括利用国家实验室、国家重点实验室和部门开放实验室等研究基地的计划与落实情况）本研究将主要在南京中医药大学肾脏病研究所进行。南京中医药大学肾脏病研究所于2001年初被批准为国家中医药管理局重点学科建设单位，同时还是国家中医药管理局“十一五”重点专科强化建设单位、全国中医肾病医疗中心、国家中医药管理局三级实验室、江苏省“135工程”医学重点学科、国家临床药理基地肾病学科点、世界中医药学会联合会肾病专业委员会副主任委员单位、中华中医药学会肾病专业委员会副主任委员单位、中国中西医结合学会肾病专业委员会常委单位。本研究所研究设施齐全，先后承担多项国家及省部级课题，本研究所已基本具备本课题所需要的设备，主要设备如下：Real time PCR 仪（ABI 7300）1 台、普通PCR 仪（eppendorf mastercycle）1 台、ABI Gene Amp 2700 PCR 扩增仪（测序级）1 台、Eppendoff 5810R 冷冻离心机1 台、AF-10 制冰机1 台、MDF-382E 超低温冰箱2 台、Millipore 超纯水机3 台、SANTO 冷冻切片机1 台、-20C 及-80C 低温冰箱（3 个）、Zeiss Axiovert 40 荧光倒置生物显微镜1 台、Zeiss 倒置生物显微镜1 台、Leica 多头显微镜1 台 高级职称：是03个高级(一定要注意是否限项，有或者没有，理论和技术指导不宜过多)，中级职称：23个中级，单独申请中标的可能性较小。初级职称：1个初级，研究生：23个硕士生，02个博士生就可以。总共大约是610人。人员构成人员构成研究团队的常见问题 缺乏课题相关的专业研究人员。项目组成员中具体做课题的人太少。分工不明确，没有具体落实工作内容。临床医生申请的课题中没有研究生的参与。评审标准：7条11项38超过2项即为不合格国自然依靠绝对实力是科研水平和能力的体现40