广靶代谢方案模板-20181123.docx

代谢组研究方案XX代谢组方案背景简介根据老师对代谢物的关注情况，推测老师可能是研究脱落酸与XX黄化过程的关系，基于此设计实验方案如下。实验设计l 设计1正常生长状态下的XX，生长一定天数后，会出现黄化。X日龄后，取黄化和未黄化的部位组织分别命名为Untreat-yellow，Untreat-green。另一组XX使用适宜浓度的脱落酸处理，X日龄后，取黄化和未黄化的部位组织分别命名为Treat-yellow，Treat-green。每组样品需要3个生物学重复。通过横向和纵向比较，筛选黄化与未黄化部位的差异代谢物、ABA处理对各个部位代谢物的影响；并对差异代谢物进行注释富集分析，拟找到与黄化、ABA相关的重要代谢物。未黄化部位黄化部位ABA处理Treat-greenTreat-yellowABA不处理Untreat-greenUntreat-yellowl 设计2正常生长状态下的XX，生长一定天数后，会出现黄化。根据前期表型，确定初黄化时间点（A），大面积黄化时间点（B），全部黄化时间点（C），分别取未发生黄化的组织和A,B,C三个时间点的组织，每组样品3个生物学重复。通过两两分析，找到在发育过程中重要的差异代谢物质；整合4个时间点的代谢物数据，追踪内源ABA及其相关代谢物的含量变化，绘制动态变化曲线图。l 设计3正常生长状态下的XX，生长一定天数后，会出现黄化。以黄化的部位为中心，依次取黄化中心（1），黄化中心附近（2），黄化边缘（3），未黄化区域的组织（4），每组样品3个生物学重复。两两比较，找到在发育过程中重要的差异代谢物质；整合4个部位的代谢物数据，追踪内源ABA及其相关代谢物的含量变化，绘制动态变化曲线图。以上3种方案设计仅供参考，老师可以根据自己研究方向对方案进行整合或调整。如果代谢组样品和转录组样品一致，建议做代谢组和转录组的联合分析，能够做差异基因和差异代谢物的的关联，找到核心调控网络，深入阐释ABA与黄化的关系。样本采集预实验确定合适的ABA浓度，处理时间，选择适当的点取样，不同的个体尽量发育状态一致，采用3-5株取样混合为 1 次重复，每处理重复 3 次。取样后，液氮速冻，-80冰箱保存，干冰寄样。研究方式1. 表型统计统计各组样品随着黄化程度加深的表型变化，比如开始黄化的时间，完全黄化的时间，黄化区域的比例等。2. 生化指标用间接酶联免疫吸附法测定各组样品内源ABA的含量，绘制含量变化曲线。3. 代谢组技术平台：LC-MS代谢组分析内容1.1 代谢物定性定量分析质谱分析后的下机 wiff 格式原始数据，可通过软件 Analyst 1.6.2 打开浏览，并用于定性定量分析。图 1 所示为混样 QC 样本的总离子流图（Total ionscurrent，TIC，即每个时间点质谱图中所有离子的强度加和后连续描绘得到的图谱）及MRM代谢物检测多峰图（多物质的提取的离子流谱图， XIC），横坐标为代谢物检测的保留时间（Retention time， Rt），纵坐标为离子检测的离子流强度（强度，cps）。图 1. 混样样品质谱分析总离子流图（上） 及 MRM 代谢物检测多峰图（下）基于本地代谢数据库，对样本的代谢物进行了质谱定性定量分析。图1中MRM 代谢物检测多峰图展示了样本中能够检测到的物质，每个不同颜色的质谱峰代表检测到的一个代谢物。为了比较每个代谢物在不同样本中的物质含量差异，根据代谢物保留时间与峰型的信息，我们对每个代谢物在不同样本中检测到的质谱峰进行校正，以确保定性定量的准确。图 2展示了代谢物mr1267在不同样本中的定量分析积分校正结果，横坐标为代谢物检测的保留时间，纵坐标为某代谢物离子检测的离子流强度（cps）。图 2. 样品代谢物定量分析积分校正2.2 样本质控分析通过对不同 QC 样本质谱检测分析的 TIC 图进行重叠展示分析，可以判断代谢物提取检测的重复性。如图 3显示了第一与最后一个 QC 样本质谱检测 TIC图重叠结果，可以发现质谱检测较为稳定，重复性较好。图 3. QC 样本质谱检测 TIC 重叠图图 4. 样本及 QC 样本 PCA 得分图。三角形、方框分别表示品种 1（P1）与品种 2（P2）；黑色圆点表示质控样本（QC）； 不同颜色分别表示七个时期组织样本； X 轴表示 PC1，Y 轴表示 PC2。对 QC 样本及组织样本进行代谢主成分分析， PCA 得分图（Score plot）如图 4所示，X 轴表示第一个主成分，Y 轴表示第二个主成分，QC 样本（黑色圆点）聚集在一起，其它样本且能够显著区别，结果表明样品质谱检测分析较为稳定，采集的数据质量较好。2.3 差异代谢物的比较2.3.1 差异代谢物的筛选为了得到两个品种之间差异的代谢物，我们分别使用 OPLS-DA 和双因素方差分析两种方法来进行筛选。在使用 SIMCA 14 的 OPLS-DA 时，我们分析同一个处理中两品种间差异代谢物。如重点关注黄酮类物质。 图5A为两种方法得到的差异代谢物的韦恩图 。图5B 为已知的差异代谢物的分类扇形图。A .OPLS-DA 和双因素方差分析筛选的差异代谢物的韦恩图B.不同品种之间差异代谢物的分类情况图 5.两品种间差异代谢物的筛选及其分类情况图 6. 不同品种之间差异代谢物的分类情况部分品种间差异的代谢物在各个样品中的积累量如图 6所示，该热图横轴为样品的编号， 并且在横轴的上方分别用颜色条标出该样品所属品种以及时期： 左边的浅红色表示品种 I，右边深红色表示品种 II， 各个品种内各个时期用黄棕色由浅到深依次表示； 纵轴为每个代谢物，蓝色到红色依次表示代谢物含量从低到高。3.3.2 差异代谢物的通路分析对两品种或不同处理之间差异代谢物进行 KEGG 通路富集分析，如重点关注黄酮类生物合成途径。结果如图7 所示。图 7. 差异代谢物 KEGG pathway 富集分析图 8. KEGG 富集到各通路的各代谢物在各时期各样本中的积累量热图 在各品种中各时期的代谢物积累量如图 8热图所示。一、 转录组和代谢组联合分析3.1 mRNA与代谢物表达相关性分析我们将所有的差异表达代谢物的酶基因对应mRNA表达量被计算出来，比较两者之间的相关性。我们将基因和代谢物能够完全对应，表达趋势完全一致的列出：图33.差异代谢物与差异基因表达相关性分析3.2 差异基因与差异代谢物pathway分析我们将差异基因与差异代谢物同时使用GenMAPP v2.1向KEGG pathway数据库映射，获得他们的共同的pathway信息，重点关注老师关注的黄酮类物质。图34.差异基因与差异代谢物pathway图，圆点是代谢物，长方形是酶基因 3.3 差异基因与差异代谢物互作网络构建我们整合构建mRNA与代谢物互作网络如下：图35.差异基因与差异代谢物整合调控网络构建代谢物用红色标出，它们之间的相关性用直线表示3.4 CCA分析典型相关分析（canonical correlation analysis, CCA），是利用综合变量对之间的相关关系来反映两组指标之间的整体相关性的多元统计分析方法。对相关性网络图中的差异基因及差异代谢物进行CCA分析，结果如下：图36. CCA分析图图中以十字区分出四个区域，在同一个区域内，距原点越远关联性越高。代谢物用蓝色表示，基因用红色表示。只有当通路中的差异基因和代谢物均不低于2个的时候，才能进行此分析。