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慢病毒载体包装构建过程
原理：慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果。对于一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。

概念：慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1 (H IV-1) 来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。

辅助成分：慢病毒载体辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。
慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。
基本原理：慢病毒载体系统由两部分组成，即包装成分和载体成分。
包装成分：由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列而构建，能够反式提供产生病毒颗粒所必需的蛋白。包装成分通常被分开构建到两个质粒上，一个质粒表达Gag和Pol蛋白，另一个质粒表达Env蛋白，其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的3个质粒共转染细胞(如人肾293T细胞)，即可在细胞上清中收获只有一次性感染能力而无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体颗粒。
载体成分：与包装成分互补，即含有包装、逆转录和整合所需的HIV顺式作用序列，同时具有异源启动子控制下的多克隆位点及在此位点插入的目的基因。
为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能，需尽量减少二者的同源性，如将包装成分上5′LTR换成巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、3′LTR换成SV40 polyA等。

一、 实验流程（1和2为并列步骤）
1.慢病毒过表达质粒载体的构建
设计上下游特异性扩增引物，同时引入酶切位点，PCR(采用高保真KOD酶，3K内突变率为0%)从模板中（CDNA质粒或者文库）调取目的基因CDS区（coding sequence）连入T载体。将CDS区从T载体上切下，装入慢病毒过表达质粒载体。
2.慢病毒干扰质粒载体的构建
合成siRNA对应的DNA颈环结构，退火后连入慢病毒干扰质粒载体
3. 慢病毒载体的包装与浓缩纯化
制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养24和48h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。

干（干净）吃（吃草）办（办法）跳（跳高）队（大队）像（好像）我（我的）座（座位）二、实验材料
2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株

立刀旁：到、刚1、把下面的句子补充完整。该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G, pLVX-IRES-ZsGreen1/pLVX-shRNA2。其中质粒上的ZsGreen1表达框能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

小树渐渐长高了。载体信息
1)
2) ①亮晶晶 凉冰冰 绿油油 胖乎乎 光秃秃
3) 8、生字“小魔术”（P111）：加一笔:日——（白）（田）（目）（电）（旧）（由）（旦）慢病毒克隆载体图谱如下：

火 火字旁 （炒 烧 ） 口 方框（国 园 圆）走 走之旁（赶 超 起） 禾 禾字旁（秋 秒）

鲜艳的红领巾 轻巧的桥 美丽的衣裳 快乐的时光
3、积累一些句式，如：谁干什么。什么时候，谁在哪里干什么。并能运用指定的句式来写话。

足字旁：跑、跟、跳
一（竿）翠竹 一（方）鱼塘 一（列）火车 一（道）小溪

通过把句子写完整的训练，让学生明白什么是完整的一句话，以达到让他们写一句完整话的目的。全册共有以下9种练习句式。

非和飞 气和汽 以和已 请和情 玩和完 很和得 跳和桃3、给下面加点字读音正确的打√。双人旁：得、往、很2） 包装质粒信息如下：

园（公园）（菜园）（果园）（花园）（桃园）

《1柳树醒了》、《9两只鸟蛋》、《4春晓、村居》、《13所见、小池》、《14荷叶圆圆》、《16要下雨了》（自选）、《18四个太阳》、《19乌鸦喝水》、《20司马光》、《24画家乡》（自选）、《25快乐的节日》（2）春眠不觉晓，（处处）闻啼鸟。夜来（风雨声），花落（知多少）。例：月儿弯弯的像小船。 小燕子的尾巴像剪刀。PMD2G载体图谱和序列信息

门字框：问、间、闭PSPAX2载体图谱和序列信息：

2、近义词

例：西瓜长得那么大，那么圆。 苹果那么香那么甜。

五、阅读 。（10）孩子们（爱家乡），也（爱画自己美）丽的家乡。飞机越飞越高。 我越长越高。细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、流程图

贝（宝贝）虾（河虾）写（写字）

一（竿）翠竹 一（方）鱼塘 一（列）火车 一（道）小溪3、反义词（括号里是学写过的字）（ ）月（ ）日是儿童节。

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