固相萃取-气相色谱-质谱分析肉样中盐酸克伦特罗的残留量.pdf

固相萃取2气相色谱2质谱分析肉样中盐酸克伦特罗的残留量谢孟峡3 刘 媛 蒋 敏(北京师范大学分析测试中心,北京100875)摘 要 建立了固相萃取2气相色谱2质谱联机分析肉样中盐酸克伦特罗残留量的方法。对盐酸克伦特罗在C18和离子交换固相萃取柱上的保留行为进行了研究,发现不同浓度盐酸克伦特罗的固相萃取回收率在75%95%之间;肉样中的加标回收率在70%83%;相对标准偏差在4.95%13.4%;最低检出限为1gkg。盐酸克伦特罗的硅烷化产物,采用选择离子的模式进行检测(86、243、262、277),衍生物的峰面积与样品浓度在0.002522.02 mgL范围内呈良好的线性关系,线性回归系数大于0.9999。关键词 盐酸克伦特罗,气相色谱2质谱,固相萃取,肉样2001211219收稿;2002205221接受1 引 言盐酸克伦特罗,又名瘦肉精,是强效选择性2受体激动剂。人体过量的摄入这种药物会发生中毒,为此很多国家严禁使用含有此类药物的动物饲料,并制定了其在肉食品中的最高检出限1。对动物肉食品、体液及毛发中盐酸克伦特罗的检测,一般是先用免疫检测25,再用气相色谱2质谱进行定量测定。固相萃取2气质联用分析尿样、毛发以及饲料中盐酸克伦特罗含量方法国外已开展了一些工作612,但对肉食品中盐酸克伦特罗残留量的检测方法未见报道。本文用C18和离子交换两种固相萃取柱对猪肉等样品中盐酸克伦特罗的测定方法进行了系统地研究。考察了盐酸克伦特罗在C18柱和离子交换柱上的保留行为。对不同浓度的盐酸克伦特罗在固相萃取柱上的回收率进行了测定,建立了用固相萃取2气质联用分析肉样中盐酸克伦特罗的方法。2 实验部分2.1 仪器和试剂气2质联用仪TRACE MS(美国Thermo Quest Finnigan公司),EI源,电离电压70 eV;色谱柱:DB25MS毛细管柱,30 m0.22 mm 0.25m;进样口温度:280;源温:200;传输线温度:280;载气流量:高纯He,1 mLmin。温度梯度:70(1 min)25 min200(1 min)25 min300(5 min)。无分流进样,进样量1.0L。固相萃取柱:C18小柱,supelclean LC218 Supelco Park 500 mg,3 mL。SCX小柱,supelclean,LC2SCXSupelco Park 500 mg,3 mL。所用溶剂和试剂均为分析纯或色谱纯,盐酸克伦特罗标准品和 2盐酸葡萄糖醛甙酶 芳基硫酸酯酶(中国药品生物制品检定所),双三甲基硅基三氟乙酰氨BSTFA(美国Supelco Park公司)。2.2 样品处理2.2.1 样品中克伦特罗的提取 准确称取10 g绞碎的动物组织于50 mL离心试管中,加入20 mL 20mmolL的乙酸胺缓冲溶液(称取一定量的乙酸胺溶解在水中,用乙酸调pH值至5.2),均质5 min;加入50L-盐酸葡萄糖醛甙酶 芳基硫酸酯酶溶液。密封震荡、超声15 min后,在37 恒温箱中培养18 h。离心5 min(转速3000 rmin),过滤上清液以备净化。2.2.2 固相萃取净化样品 将C18和SCX固相萃取柱按从上到下的顺序安装。依次用5mL甲醇、5 mL水和5 mL 30 mmolL盐酸活化;取5 mL样品溶液上样至C18柱中;依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗柱子。在溶剂流过固相萃取柱后,保持抽气5 min使柱中液体逐渐枯竭。取下C18柱,用5 mL 4%氨化甲醇溶液第30卷2002年11月 分析化学(FENXI HUAXUE)研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第11期13081311淋洗SCX柱并收集流出液。2.2.3 衍生化步骤 用氮气吹干上述固相萃取流出液,用100L甲苯溶解残渣,加入100L BSTFA在触摸式震荡器上震荡,80 衍生1 h。蒸去多余溶剂至近干,加入0.5 mL甲苯,待气相色谱2质谱分析。2.3 标准溶液的配置及标准曲线称取25.2 mg盐酸克伦特罗标准品定容于100 mL甲醇中,得标准溶液母液。用甲醇将母液稀释成10.1、5.05、1.26、0.126和0.0126 mgL的标准溶液系列。分别取100L标准溶液,加入100L衍生化试剂BSTFA,按上述衍生化步骤衍生和气质分析,每个浓度点衍生3次,每次衍生进样3次。以标准溶液进样前的浓度(分别为2.02、1.01、0.252、0.0252和0.00252 mgL;若换算成肉样中盐酸克伦特罗的含量,其线性范围在5040.63 ngg之间)和组分色谱峰面积做标准曲线。线性回归方程为Y=1.8107+6.29107X,回归系数r=0.99998。3 结果与讨论3.1 气相色谱2质谱分析盐酸克伦特罗用BSTFA衍生生成三甲基硅烷化衍生物,其质谱图见图1。图1 盐酸克伦特罗衍生物的质谱图Fig.1The mass spectra of clenbuterol derivative从质谱图中看出,质荷比为86的碎片峰为基峰CH2=NH2C(CH3)3+,在高质荷比处有3个强度较弱的特征碎片离子分别是衍生物断裂重排后的碎片离子,243(失去(CH3)3SiOH和CH3)、262(失去CH2NHC(CH3)3)、277(失去NC(CH3)3)。在对肉食品进行分析时,为了提高检测的选择性和灵敏度,采用以上4个离子进行选择离子检测。3.2 固相萃取条件的优化3.2.1C18柱和SCX离子交换柱对盐酸克伦特罗的保留 取10.1 mgL的标准溶液100 mL加入5 mL的20 mmolL乙酸胺缓冲体系中作为上样液,依次用5 mL水、5 mL甲醇、再用5 mL甲醇淋洗,收集各次淋洗液衍生、气质分析发现在第一次5 mL甲醇淋洗液中,95%以上的盐酸克伦特罗被洗脱下来,在第二次5 mL甲醇淋洗液中,仅存5%以下的盐酸克伦特罗。同样在SCX柱上样后依次用5 mL水、5 mL甲醇、5 mL氨化甲醇淋洗柱子,分析结果显示,甲醇淋洗出来的盐酸克伦特罗的量非常少,约占总量的2%左右,增加甲醇淋洗的体积也不会明显增加。在氨化甲醇淋洗液中,95%以上的盐酸克伦特罗被洗脱出来。3.2.2 不同浓度盐酸克伦特罗在C18柱及SCX柱上的回收率 根据上面的实验结果,把C18和SCX离子交换柱从上到下连接对样品进行处理。分别取浓度为10.1、1.26、0.126和0.0126 mgL的标准溶液100L加入5 mL 20 mmolL的醋酸胺缓冲溶液作为上样液,按前文方法进行固相萃取、衍生化和气质分析。不同量盐酸克伦特罗在两个柱子上的回收率见表1。从表中数据看出,在加入量大于12.6 ng时,9031第11期谢孟峡等:固相萃取2气相色谱2质谱分析肉样中盐酸克伦特罗的残留量平均回收率基本在80%以上,相对标准偏差也在10%以内。上样量比较低时,回收率稍有降低,相对标准偏差也大于10%。表1 不同量的盐酸克伦特罗在固相萃取柱上保留行为Table 1The retention behaviors of different quantities of clenbuterol in solid phase extraction column加入量(ng)Added回收率(%)Recovery相对标准偏差RSD(%)测定次数Determination times加入量(ng)Added回收率(%)Recovery相对标准偏差RSD(%)测定次数Determination times1010955.1612.681.38.6612686.66.361.2675.612.573.3 肉样中盐酸克伦特罗的回收率及检出限准确称取3份不含盐酸克伦特罗的猪肉样品10 g,分别加入不同量的盐酸克伦特罗标准品,经提图2 气相色谱2质谱定量测定肉样中盐酸克伦特罗的色谱图Fig.2The gas chromatography2mass spectrogram ofclenbuterol in meat sample取、固相萃取净化富集、衍生化和气相色谱2质谱分析测定考察检测方法的回收率,其结果见表2。气相色谱2质谱定量测定肉样中盐酸克伦特罗的色谱图见图2。从图中看出,样品得到了较好的净化,在盐酸克伦特罗衍生物的色谱峰附近没有明显的干扰峰。表2 盐酸克伦特罗在肉样中的回收率Table 2The recoveries of clenbuterol in meat sample加入量Added(ng)测定值Found(ng)回收率Recovery(%)相对标准偏差RSD(%)测定次数Determinationtimes10183.482.64.95550.539.678.46.31610.17.2271.513.46从表中数据可以看出,盐酸克伦特罗的回收率在70%85%之间。当加入量小于10 ng时,由于杂质峰的干扰,给峰面积的准确积分造成很大困难。因此,此方法的检出限为10 ng,即相当于肉样中1gkg的残留量。3.4 肉样中盐酸克伦特罗的检测从北京、天津、上海和深圳等地采集到的肉样经免疫检测呈阳性者,利用上述方法进行了样品的提取、富集和净化,气相色谱2质谱的定量分析。表3列出了各地区阳性肉样中盐酸克伦特罗残留量的最高值和最低值。表3 不同地区采集的阳性肉样中盐酸克伦特罗的残留量Table 3The residues of clenbuterol in meat samples collected from different districts样品编号Serial numberBJ08BJ31T J16T J27SH09SH27SZ04SZ32测定值(gkg)Found34.75.2924.76.712.0513630.32.19References1Van Vyncht G,Preece S,Gaspar P,Maghuin2Rogister G,Depauw E.J.Chromatogr.,1996,A 750:43492Haasnoot W,Streppel L,Cazemier G,Salden M,Stouten P,Essers M,Van2Wichen P.Analyst,1996,121:111111143Bacigalupo M A,Lus A,Meroni G,Dovis M,Petruzzilli E.Analyst,1996,120:226922714Ploum M E,Haasnoot W,Paulussen R J A,Vanbruchem GD,Hamers A R M,Schilt R,Huf F A.J.Chromatogr.,1991,A564:4134275G irault P G,Fourtillan J B.Biomed.Environ.Mass.Spectrom.,1990,19:80856Lee X,Whaites E,Murby John.J.Chromatogr.,1999,B728:67737Bruins C H P,Jeronimus2Stratingh C M,Ensing K,Van Dongen W D,de Jong GJ.J.Chromatogr.,1999,A863:1151220131分 析 化 学第30卷8Fente C A,Vazquez B I,Franco C,Cepeda A,G igosos PJ.J.Chromatogr.,1999,B726:1331399Seija Berg,Rizzo A F.Adv.Mass Spectrom.,1998,12:11310Saniye Kedkin,Durisehvar Ozer,Aytekin Temizer.J.Pharm.Biomed.Anal.,1998,18(4,5):63964411Fernando Ramos,Laura Ribeiro,Rui Saltao,Manuel Jose.Rev.Port.Farm.,1999,49(1):374012Mario Vincenzo Russo,Bruno Neri.Ann.Chim.,1997,87(728):505512Determination of Clenbuterol in Meat Sample by Coupling Solid PhaseExtraction with G as Chromatography2Mass SpectrometryXie Mengxia3,Liu Yuan,Jiang Min(Analytical&Testing Center,Beijing Normal University,Beijing100875)AbstractSolid phase extraction and gas chromatography2mass spectrometric method have been developed for thedetermination of the residues of clenbuterol in meat sample.The retention behaviors of clenbuterol on C18and ionexchange column were investigated.It has been found that the recoveries of different quantities of clenbuterol on thecolumns are between 75%95%.The average recoveries of clenbuterol in meat sample are 70%83%;therelative standard deviations are 4.95%13.4%and the detection limit is 1gkg for meat samples.The selectedion mode(SIM)detection method(ions selected:86,243,262,277)was used for the detection of the clenbuterolderivatives.There is a good linear correlation(the calibration coefficient is above 0.9999)between the peak areasand concentration of clenbuterol in the range of 0.00252 mgL to 2.02 mgL.KeywordsClenbuterol,gas chromatography2mass spectrometry,solid phase extraction,meat(Received 19 November 2001;accepted 21 May 2002)1131第11期谢孟峡等:固相萃取2气相色谱2质谱分析肉样中盐酸克伦特罗的残留量