中和抗体测定.pptx

病毒分离技术（四）中和抗体测定u目的评价人群中抗脊灰病毒的免疫状态。评价OPV的有效性和免疫效果。u适用范围人群脊髓灰质炎中和抗体效价的测定。免疫成功率的监测。病毒分离技术（四）中和抗体测定u必备材料待检血清（灭活处理）稀释液（MM）细胞悬液510104/ml标准血清（WHO CDC/EPI）标准病毒（Sabin）（滴度106.0CCID50/ml）u必备材料96孔微量板微量可调式移液器无菌吸尖/无菌吸管无菌1.5ml离心管/试管封板胶带CO2孵箱病毒分离技术（四）中和抗体测定u待检血清稀释（1411024）每份待检血清的稀释在型板的第1排进行。0.15ml稀释液，加入 0.05ml的血清，吹吸均匀后，将这个稀释度的血清向下一个稀释度移0.05ml，至最高稀释孔吹吸均匀后，弃去0.05ml。（在微量板上进行，板子标记和稀释详见附录1）型板型板 血清血清1血清血清2血清血清3血清血清4血清对照血清对照1414 血清稀释血清稀释1414 116116 164164 12561256 1102411024 血清对照血清对照1414 血清稀释血清稀释1414 116116 164164 12561256 1102411024 血清血清5血清血清6血清血清7血清血清8病毒分离技术（四）中和抗体测定稀释度稀释度 1 1：4 14 1：16 116 1：64 164 1：256 1256 1：10241024稀释液稀释液 0.15 0.15 0.15 0.15 0.150.15 0.15 0.15 0.15 0.15 血血 清清 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 废废0.050.05 移入它孔移入它孔 （每孔（每孔55）0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 0.025 n待检血清稀释方法示例：病毒分离技术（四）中和抗体测定u待检血清稀释用排枪向第2排孔及、型板的相应稀释度的两排孔中，每孔移入0.025ml，原稀释孔保留0.025ml。标准血清稀释（根据血清效价而定）standard serum:18000standard serum:12000standard serum:12000病毒分离技术（四）中和抗体测定u标准毒株稀释（200CCID50/0.025ml）（病毒滴定及攻击病毒含量的计算与稀释见附录2、3）u中和试验时所用抗原量过大或过小都会影响血清抗体滴度。每次试验应设病毒对照，核 对 所 用 病 毒 剂 量，一 般 应 在 32320CCID50/0.025ml的用量时其结果才被认可。（病毒滴定对照见附录4）病毒分离技术（四）中和抗体测定u中和作用，向血清板上加入已稀释好的标准毒株悬液0.025ml（200CCID50）。（注意型别的区分和对应）轻摇混匀后，放入CO2孵箱，培养24小时u加入事先准备好的细胞悬液0.1ml/孔Hep-2:510104/mlu再次摇匀，密封好放在36.5培养57天。病毒分离技术（四）中和抗体测定u对照的设立血清对照（14），标准血清和待检血清同时设立细胞对照、稀释液对照100CCID50的抗原对照v每个对照设两孔，血清、抗原的量各为0.025ml/孔，补加稀释液0.025ml/孔，细胞对照孔的稀释液应为0.05ml，然后全部加细胞悬液0.1ml/孔，密封后放34.5培养57天。病毒分离技术（四）中和抗体测定u结果判定当100CCID50的抗原对照出现完全病变时，判定最终结果 当最高稀释度的血清病毒混合液接种的2孔细胞中有1孔不出现CPE，该稀释度的倒数即为该血清标本的中和抗体滴度。型板型板 血清血清1血清血清2血清血清3血清血清4血清对照血清对照1414 血清稀释血清稀释1414 116116 164164 12561256 1102411024 血清对照血清对照1414 血清稀释血清稀释1414 116116 164164 12561256 1102411024 血清血清5血清血清6血清血清7血清血清8病毒分离技术（四）中和抗体测定CCID50100Sabine1010.1100Sabine1010.1100Sabine1010.1病毒滴定结果判断示意图1001病毒分离技术（四）中和抗体测定uSpearsmanKarber公式：LogCCID50=Xm1/2dd（Pi/100）Xm=所用病毒最低稀释度（最高浓度）的对数 d=稀释度系数（倍数）的对数。Pi=各稀释度出现CPE百分数的总和。病毒分离技术（四）中和抗体测定u病毒滴定结果的判定Sabine：LogCCID50=0+0.5-1（100+100+100+25）/100=-2.75Sabine：LogCCID50=0+0.5-1（100+75+25）/100=-1.50Sabine：LogCCID50=0+0.5-1（100+100+50）/100=-2.00病毒分离技术（四）中和抗体测定u病毒滴定对照结果的判断Sabine：取2.75的反对数，即得到攻击病毒的含量：562CCID50/0.025ml。Sabine：取1.50的反对数，即得到攻击病毒的含量：31.6CCID50/0.025ml。Sabine：取2.00的反对数，即得到攻击病毒的含量：100CCID50/0.025ml。病毒分离技术（四）中和抗体测定u简单的判定是否有效的方法：32320 CCID50/0.025ml 的对数：1.5052.505（1.52.5）1.52.5的反对数：31.62316.2（32320 CCID50/0.025ml）题外话u感谢大家多年来对免疫预防工作的支持u新的问题不断涌现，促使我们不断的向前u未来，任重而道远Thank you very much!