薄层色谱在中药检验的具体应用讲解及实验培训班讲义.pdf

薄层色谱在中药检验的具体应用讲解及实验培训班讲义薄层色谱在中药分析中应用及操作规范化颜玉贞?中药的真伪优劣直接关系到人民用药的安全和有效。在检验中药真伪方面通常采用的检测手段有形态鉴别、理化鉴别和光谱色谱分析等。而作为色谱技术一个分支的薄层色谱由于其独具的长处而被广泛应用于中药分析。?薄层色谱技术在中药分析与?检验领域中的地位薄层色谱技术在中药分析与检验领域中的地位?自从中华人民共和国药典（1990年版一部）起，薄层色谱鉴别除有化学对照品作为鉴别药材的指标成分对照品以外，鉴于单一化学对照品不能反映药材的整体特征，一些多种植物共存的化学成分没有专属性，以及没有化学对照品鉴别就无法进行的问题，开始增加了“对照药材”，以药材对照品的色谱整体为特征进行对比鉴别，解决了上述存在的问题，并于1993年委托药典委员谢培山先生主持试验研究和编写出版了中华人民共和国药典1990年版中药薄层色谱彩色图集，供实际应用的中药参考资料。薄层色谱技术在中药分析与检验领域中的地位?2005版中药薄层色谱彩色图集即将出版,由于本彩色图集的编辑及出版滞后于现行版中国药典的发行，所以它的编辑出版就具有承前启后的作用，既承接2005版的已经收载的品种薄层色谱鉴别的原方法，也为下一版的修订和增删打下基础。薄层色谱技术在中药分析与检验领域中的地位?自1990年版以来，从全国范围讲，中药薄层色谱鉴别在技术层面上有了较大的提高，含有薄层色谱鉴别的品种也逐渐增加，2005年版药典更有了较大幅度增加，用于鉴别的已达1523项，用于含量测定的为45项。另外，新药研制的质量标准研究资料基本上采用了以对照药材作对照的薄层色谱鉴别，说明薄层色谱技术在中药分析与检验上占着重要的地位薄层色谱技术的优势?薄层色谱独有的特点是分析结果以直观的彩色图像表达，为其它色谱技术所不能。而图像给出的多层面的信息是文字难以表达的，正是“一幅图胜过千言万语，而且丰富多彩的图像可以给分析者更多的思考判断的空间。白芷HPTLC色谱图(上图样品未熏硫;下图样品被硫熏过)连翘薄层色谱陈皮HPTLC薄层色谱图高效薄层色谱(HPTLC)在中药指纹图谱的应用品种的真伪鉴别12934567814：柴胡（Bupleurum chinese)、5：狭叶柴胡(B.scorzonerifolium）、6：三岛柴胡(B.falcatum)、7：大叶柴胡（B.longiradiatum)、8：锥叶柴胡(B.bicaule)、9：西藏柴胡(B.marginatum var.stenophyllum）北柴胡与其它同属近缘植物的鉴别S1-4 Bupleurum chinese B.longiradiatum）B.bicauleB.marginatum var.stenophyllum B.scorzonerifolium北柴胡大叶柴胡锥叶柴胡西藏柴胡南柴胡HPTLC fingerprint of various Chai HuS1-4.:柴胡皂苷对照品可见光色谱UV 366nm 荧光色谱T:18,RH:50%S1-4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 13 14 S1-4dab2f北柴胡与其它“柴胡”的指纹图谱鉴别+Simulated123456789101112131415161718192021222300.250.50.75150100150200 Rf Value+Smoothed6891011121316171819212200.250.50.75150100150200 Rf Value+Smoothed269101113141516171819212200.250.50.75150100150200 Rf Value+Smoothed1N/A2357910111314151617181920212300.250.50.75150100150200250 Rf Value+Smoothed67910111314151617181920212223N/AN/AN/AN/AN/AN/A00.250.50.7550100150200250 Rf Value+Smoothed7121317212300.250.50.75150100150200 Rf Value+Smoothed12131617192100.250.50.75150100150200 Rf Value三岛柴胡西藏柴胡锥叶柴胡大叶柴胡小柴胡(地上部分)竹叶柴胡(地上部分)-3-2-10123-101234PC1 PC2 Std Fingerprint 北柴胡 14 南柴胡 1 大叶柴胡 4 锥叶柴胡 2 西藏柴胡 1 小 柴胡 1 竹叶柴胡 1 三岛柴胡 1 商品 15北柴胡HPTLC共有模式柴胡指纹图谱PCA分析171301020304050600100200300400500600 min mAU人参内在质量的差别人参（池底参）人参（吉林安图GAP基地）池底参“Chi-di”ginsengRb1+Smoothed12345678900.250.50.75255075100125150 Rf ValueRb1+Smoothed124567891011121300.250.50.75255075100125150 Rf ValueRb1吉林安图”An-tu”ginsengRg1ReRo+Rb2Ro+Rb2ReRg1HPLC-ELSD市场商品生脉饮制剂的HPTLC指纹图谱某厂的一批人参提取物人参原料药材Ginseng extract Ginseng crude drugRg1RdReRb1Rg31，Ginsenosides reference 2，Ginseng extract 3，4,ginseng root 1 2 3 41 2 3 4人参提取物与原料人参原料药材的HPTLC指纹图谱比较(示提取工艺造成人参皂苷水解）三七薄层图谱三七薄层指纹图谱云南文山商品药材广东信宜00.10.20.30.40.50.60.70.80.9050100150200250300350 min mAU05101520250.750.80.850.90.951Sample Similarity 05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-侧柏叶(S:槲皮素)05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-路路通(S:路路通酸)05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-竹节参05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-红大戟05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-蟾酥(S上-下：脂蟾素配基，华蟾素基）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-陈皮（S：陈皮苷）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-大黄（S：大黄酸）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-诃子（S：没食子酸）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-红参05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-黄连05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-五味子（S上-下：五味子乙素、五味子甲素、五味子醇甲）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-刺五加（S：异嗪皮啶）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-桔梗05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-鹿茸05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-绵马贯众05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-满山红（S：杜鹃素）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-白芷05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-虎杖（s：虎杖苷）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-麦冬05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-片姜黄05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-何首乌05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-黄芪（S：黄芪甲苷）S05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-丹参（S：丹参酮IIA）Tanshenone IIA05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-胡黄连（S：香草酸、肉桂酸）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-苦地丁（S：紫堇灵）S05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-阿胶（S：甘氨酸）S05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-菝葜（S：菝葜皂苷元）S05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-闹洋花05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-巴豆05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-半边莲05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-积雪草（S：羟基积雪草苷、积雪草苷）05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-漏芦05版中国药典中药彩色图谱集部分图谱-罂栗壳（S：下-上：吗啡、磷酸可待因、盐酸罂粟碱薄层色谱的优点离线操作的灵活性?各单元操作既有关联，又相互独立，点样器材和方法、展开方式、显色试剂选择、直观比较或扫描比较可根据需要灵活变通。根据需要操作可以视实际需要和实验室条件分层次进行和中止，节省分析时间和资源。?由于是离线操作，所以个人占机时间短，甚至不需要占机。供试品溶液制备点样于薄层板展开、衍生薄层色谱直观观察照片记录数码成像薄层扫描计算机处理相似度直观比较相似程度给出估计结果给出计算结果手工点样；机械点样；自动点样多种组合的正相展开溶剂系统；通用及专属的显色衍生化可选择可选择简单的操作组合（适合GAP基地及中药饮片的指纹图谱分析）：供试品溶液制备手工半定量点样玻璃双槽展开箱展开显色拍摄色谱图像照片记录直观观测（可见光、紫外光、荧光）判断样品真伪优劣供试品溶液制备计算机控制半自动或全自动定量点样玻璃双槽展开箱或自动展开箱展开显色拍摄色谱图像照片记录直观观测（可见光及紫外光）数码成像及数据处理（生成数码轮廓图，给出积分数据）计算机相似度评价薄层色谱扫描仪（产生轮廓扫描图谱及给出积分数据）黄连药材味连雅连云连薄层色谱的优点正相色谱流动相(展开剂)的广泛适用性?薄层色谱最常用的是以硅胶板为基础固定相的正相色谱，最适合中等极性成分的展开；有多种组合的有机溶剂展开系统可供选择；?甲苯系统；氯仿系统、己烷系统、乙酸酯类系统、正丁醇系统等。?酸性、碱性、中性。?高极性、中等极性、低极性色谱后衍生的灵活性和专属性?色谱后灵活方便的衍生技术，同一色谱薄层板可生成可见光色谱、紫外光色谱、荧光淬灭色谱或荧光色谱，给出丰富的检测成分的化学类别信息。如三氯化铝试剂是黄酮类化合物的专属试剂；碘化铋钾是生物碱类成分的专属试剂；三氯化铁是酚类成分的专属试剂；醋酐硫酸是三萜类和甾醇类成分的专属试剂等。硫酸则是许多成分激发产生荧光的通用试剂，非常方便。黄芪薄层色谱图-硫酸加热显色柴胡薄层色谱图-对二甲氨基苯甲醛葛根薄层色谱图-5%三氯化铝同板多个样品平行比较?成本相对低廉、色谱生成快速、同板可以同时产生多达1618个样品色谱，供平行直观地比较，色彩丰富的图像给人的视觉冲击远远大于较为柱色谱的轮廓色谱图，可以迅速地粗略地，而且颇为有效地评价样品色谱图像之间的相似程度。甚至非专业人士也可以对一幅图像进行直观判断。对药材产地、加工炮制、生产工艺考察提供了简便快速有效的鉴别手段季胺碱类生物碱药材薄层色谱图薄层色谱在中药分析的简单回顾?自20世纪60年代薄层色谱取代纸色谱（纸层析）技术作为一种快速、简单、灵敏的鉴别手段应用于中药材及中成药的鉴别，薄层扫描用于许多中药及中成药的含量测定，并收载于中国药典以来，在控制中药质量方面起到积极的作用，已为中药生产及质量监督管理部门所广泛认同。薄层色谱在中药分析的简单回顾?80年代后期虽然各国药典逐渐倾向于应用液相色谱技术，但在草药分析领域，薄层色谱仍然广泛地被应用，尤其是欧洲国家。他们在器械、仪器、计算机化、自动化等方面都有快速的发展，而我们在技术上长期滞留在初始阶段的状态，逐渐拉开了距离。薄层色谱在中药分析的简单回顾?欧洲国家草药分析实验室已放弃了自制薄层板，均改用商品预制板，以避免因不同实验室自制的薄层板质量不一致而结果互有差异。而我国大多数实验室依然使用实验室自制薄层板，同时多半使用的是简陋的器材，操作粗放，长期处在“低水平，广覆盖”的状态薄层色谱在中药分析的简单回顾?对此，1990年版药典委员会陆续组织了多次以药检所和药厂为对象的薄层色谱操作规范化学习班，并出版了中国药典中药薄层色谱彩色图集，在普及薄层色谱操作规范化方面起到良好的作用，许多实验室逐渐注意操作条件和操作环境的控制的重要性，在薄层色谱的质量有了明显的提高和改善。含量测定用的薄层色谱扫描仪也逐渐由以单板机控制和配备积分仪的薄层扫描仪，渐渐转型为以工作站控制的台式计算机自动控制操作的薄层扫描仪。薄层色谱在中药分析的简单回顾?由人工设置样品波长及参比波长的“双波长扫描”逐渐转向以计算机自动校正背景的单波长扫描，提高了效率，减少了人为误差。但是在薄层色谱制作的一般器材，如点样、展开、加热、喷雾显色等设备上仍然落后，造成头小尾大的状况。自然劣质的器材、粗放的操作对任何色谱技术都是无法接受的，所以不可能期望这样得到的质量低劣的薄层色谱能够得出良好的结果。（可与当前普遍应用的HPLC比较）我国薄层色谱应用于中药的现状?自中国药典2005年版开始加强了对薄层色谱规范化的要求，如比较强调使用商品预制薄层板及高效版，注意适度温度对色谱质量和重现性的影响，在准备出版的中国药典中药薄层色谱彩色图集2005年版，推荐使用的是预制硅胶版，并对操作条件有教详细的规定（参照1993年版的彩色图集，注明了温度和相对湿度），各地药检所的仪器的配置上也有了较大幅度的提高和改进。薄层色谱技术如何发展提高?为了充分发挥薄层色谱在中药分析的有效应用，目前急需的仍然是器材和操作的规范化。薄层色谱技术如何发展提高器材的规范化?点样设备：?定量点样微升毛细管（0.5,1.0,2.0,5.0l)?手工点样器（如Nanomat III)?半自动点样器（如Linomat IV)?全自动点样器（如SAMPLER4）薄层色谱技术如何发展提高器材规范化?展开设备：?平底展开箱和双槽展开箱（推荐）?自动展开设备（如ADC）?显色设备；?玻璃喷雾器；显色剂浸渍槽；紫外光灯。?薄层扫描仪?图像处理设备（照相设备和数码摄像设备）薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?由于复方中药制剂所含化学成分很复杂，“杂质”对待测的活性成分或指标成分形成干扰，在待测成分含量较低，而其他干扰成分较多的情况下，干扰尤为严重。为了获得尽可能多的可供鉴别的信息，对于一个未知成分较多的植物药样品，进行试验时，经常是用极性较大的甲醇等溶剂溶解制备供试液。不可避免地带进许多本来分析所不需要的杂质。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?尤其是复方中药制剂，杂质对色谱的干扰经常是很严重的。对于薄层色谱而言，一切干扰物质在板上基本都是显性的（液相色谱是污染色谱柱），如果供试品溶液不经预处理净化，将很难得到清晰明确的结果。雪莲花供试品溶液未经预处理（上）及经预处理（下）的色谱图像白头翁药材TLC供试品溶液无预处理经C18预处理净化后红参HPTLC?A:未经Al2O3小柱的人参样品；B：未经Al2O3小柱的红参样品；C：经过Al2O3小柱的红参样品；（*：与其他皂苷斑点位置重叠的人参皂苷Ro）A B C薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?预处理的方法通常视情况和实验室条件选用溶剂加热回流或超声提取，液液萃取和固液萃取等方法。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?如果待测的目标成分是脂溶性的，可以用低极性有机溶剂（如己烷、低沸程石油醚、二氯甲烷、乙醚、醋酸乙酯）提取，提取后的药渣还可以根据需要再选用高极性溶剂（如丙酮、乙醇、甲醇、水）继续提取，分别制备成供试品溶液薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?如蜜丸等含糖较高又有黏性的样品，有机溶剂较难渗透到样品的内部，可加硅藻土、滑石粉等分散剂共同研匀后再提取。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?液液萃取适合于液体样品如合剂及口服液、注射剂等的处理，选用适当的憎水性有机溶剂（如醋酸乙酯、正丁醇等）萃取，如液体样品较黏稠，可先予以稀释。萃取液调整到一定容积，可以直接做为供试品溶液薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?如上所述，许多情况下，这种用溶剂直接提取的供试品溶液，由于杂质干扰较为严重，所以往往还需要进一步净化，如脱色、沉淀、吸附-解吸、离子交换、分子筛分等，净化样品采用的技术一般均属固液萃取，即样品的提取液通过固相小柱处理薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?固相小柱萃取基本上是基于吸附、键合相分配、正相、反相、离子对、离子交换原理富集待测组分，去除部分杂质。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?固相小柱（预处理柱）可以在实验室自己装填，但由于装填技巧和熟练程度以及装填材料规格的不规范，不同实验室较难相互重复处理的效果，最好采用商品预处理小柱（如实验室装填，应对所用材料及装填方法、规格、技巧等关键内容有清楚明确的文字描述，以便于其他实验室重复）薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-供试品溶液制备?商品小柱的种类较多，如硅胶柱、硅藻土柱、硅镁吸附剂柱、氧化铝柱、活性炭柱、聚酰胺柱、大孔树脂柱（聚乙烯高分子材料）、阴阳离子交换树脂、C18反相柱、此外国外尚有固相微萃取设备（Solid Phase Microextraction）是用特制的探针从样品溶液（水溶液）中吸附待测组分(挥发性或半挥发性成分)，如用气相色谱，可直接进样，如与液相色谱联用，则需特制的接口，目前尚不适用于薄层色谱。不同类型吸附柱的作用?硅胶柱是正相吸附柱，适用于低极性溶剂提取物的净化?硅藻土柱是惰性材料柱，起液相载体的作用，可避免液液萃取容易乳化和不易分层?硅镁吸附剂柱适用于从非极性提取物样品中富集极性组分。不同类型吸附柱的作用?氧化铝柱对有极性基团的化合物有较强的吸附力，适用于不易被氧化铝吸附的中性皂苷、脂肪酸甘油脂或其他低极性化合物的净化，但由于氧化铝吸附力强选择性差，选用时宜小心。?活性炭柱用于水溶液或稀醇溶液的脱色处理，选择性差，而且不适宜非极性溶液，没有商品柱。不同类型吸附柱的作用?聚酰胺柱适用于与酰胺基能形成氢键的化合物的净化，如黄酮类化合物、酚性化合物等，有些极性较强的多酚类可能由于氢键结合的太牢固而不易洗脱，应注意。?大 孔 树 脂 柱 常 用 的 Amberlite-XAD4（非 极性）、XAD7（极性）柱，是利用不同分子大小的成分滞留在柱上程度不同而富集待测组分选择何种预处理柱以及洗脱条件须根据样品所含成分及待测组分的性质而定。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?薄层板?在铺有吸附剂(如硅胶、氧化铝）的薄层板上，用溶剂通过解吸附的方法，将吸附在硅胶等吸附剂上的样品展开与分离的方法叫薄层色谱法。因此，薄层板的质量好坏非常重要薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?薄层板应该逐渐推广商品预制板，以避免由于手工铺板的技巧不同，所制备的薄层板质量不同造成的重现性差，同时提高时效，试验结果也易于为国外实验室接受。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?但应注意不同厂家生产的预制板质量可能有差异，有的厂家的产品质量尚不稳定。贮放预制板时应注意保持干燥及避免污染，必要时板在临用前甲醇或氯仿甲醇混合溶剂预洗，以免由于打开包装后的预制板板面的污染及杂质影响定量结果，即使在展开和显色时也要注意尽量避免尘埃和纤维碎屑的污染，特别在薄层荧光扫描时，如板面上的纤维粉尘，因有强烈的荧光足以使试验失败。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?手工铺制薄层板用的铺板器必须标化，确证刻槽的精度。所用硅胶（硅胶为最常用吸附剂）颗粒在10m左右（目前国产硅胶为1040m），颗粒大小尽量呈正态分布的硅胶，铺制的板面应平整均匀。由于硅胶质量不佳或操作技巧低劣粗放，铺制的薄层板面质地松散、厚薄不均、有气泡沙眼等造成的负面影响不可低估。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?通常，用1份硅胶G（G是煅石膏的缩写，意即用煅石膏为粘合剂），加2.53份水，缓慢地沿一个方向搅拌，直至“水”“渣”不分层，变成均匀的糊状物，立即迅速地倒入手工铺板器中，沿一个方向直线快速前推或后拉，铺成板面的最佳状态是质地均匀细腻，表面呈奶油般的光泽。晾干后在100105oC活化30min至1h。将板贮存在干燥器中备用薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?推荐使用商品预制板（也要注意不同产品的质量差异）；?新鲜制备的薄层板，所用的硅胶G也不宜储放太久（减少污染和煅石膏的失效）。一般6g硅胶可以铺制10cm x 15cm的玻璃板3块。在有些情况下，需要在水中加入0.3%的羧甲基纤维素钠作为增强粘合力，使板面牢固。符合要求的薄层板应该在反射光下板面平滑均匀，无气泡、灰尘或颗粒，透射光下薄层纹理均匀细腻。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-薄层板?有些情况下，为了提高样品的分离度和减少斑点的拖尾，铺板时在硅胶中加入某些酸（如硼酸、草酸）、碱（如氢氧化钠）、盐（如磷酸二氢钠、磷酸氢二钠）或络合剂（硝酸银）等将硅胶板改性。商品预制板除化学键合相板外，硅胶预制板可用浸板的办法改性。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-点样?薄层定量测定时，点样是最开始的也是最关键的一步。不正确的点样也会造成色谱的歪扭，斑点变形，直接影响指纹图谱的鉴别。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-点样?一般应注意下列事项：?（1）避免劣质的点样毛细管或者样品溶液的过载造成原点（条带）的扩散；?（2）避免毛细管对板面原点部位的机械损伤；?（3）避免由于粘稠的生物样品供试液或者含有太多的杂质造成原点部位局部样品浓度过高而形成黏结；?（4）避免使用黏度或沸点太高或太低或比重大的溶剂溶解样品，如乙醚、氯仿、丁醇等溶剂。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-点样?推荐使用标准的薄层色谱用的微升毛细管或自动点样器，更好的办法是使用喷雾技术点样的设备（如CAMAG的LinomatV或全自动点样设备），喷雾点样可将供试液点成很窄的（1 mm）条带，以提高分辨率。薄层色谱的展开装置推荐使用标准的双槽展开箱，它有利于控制展开条件和节省溶剂，提高试验结果的重现性。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-展开溶剂的选择?展开溶剂在色谱展开中起着关键作用至今植物药分析的薄层展开剂的优化基本上还是依靠经验。主要是因为植物药含有太多的未知因素，色谱行为各不相同，所以试错法（Trial&error）仍然是中药分析实验室在选择展开剂时最常用的方法（包括借鉴他人的经验）薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-展开溶剂的选择?植物药分析对展开剂的要求，视目的而有所不同，对鉴别而言，全色谱的分离度越高越好，斑点越多，可供鉴别判断的信息越多。?对定量测定而言，则焦点是在于将欲测定的物质斑点与相邻的物质斑点的分离度要求符合定量的要求（如分离度应大于1.5），并保证欲测定的物质斑点没有容易被忽略的斑点重叠，而其他斑点的分离度可以忽略。诃子药材外型图诃子的薄层色谱图-药典条件诃子药材薄层色谱图-优化含季铵碱类药材-金果榄含季铵碱类药材-功劳木含季铵碱类药材-黄柏?关黄柏川黄柏含季铵碱类药材-黄连味连云连雅连含季铵碱类药材-两面针金果榄、功劳木、黄柏、黄连薄层色谱鉴别药典条件川黄柏黄柏金果榄功劳木黄柏黄连含季铵碱药材的薄层色谱图溶剂蒸气对色谱行为的影响?薄层色谱（平面色谱）不同于柱色谱的重要的一点是在一个“开放”环境下展开时，展开溶剂的蒸气也参与色谱展开的全过程。（固相板上的吸附剂如硅胶、液相展开剂、气相溶剂蒸气三相相互作用）溶剂蒸气对色谱行为的影响?在展开前，展开箱用溶剂蒸气预平衡，并注意小心地调整，在很多情况下，对改善色谱质量起着不容忽视的作用。?一般有：不用溶剂蒸气预平衡；?用溶剂蒸气的“部分预平衡”展开缸；用溶剂蒸气“饱和”展开缸；层析板与展开缸同时用溶剂蒸气预平衡人参皂甙的薄层色谱人参皂甙的薄层色谱(溶剂蒸气的影响）溶剂蒸气的影响）未经溶剂蒸气预平衡展开箱预先用溶剂蒸气预平衡黄连薄层色谱氨试液预平衡用量比较2ml 3ml 4ml 5ml 6ml 溶剂蒸气对色谱行为的影响?薄层板面上负载的溶剂蒸气是参与了色谱的分离，因为极性溶剂蒸气容易被硅胶颗粒吸附，即使非极性溶剂中微量的极性溶剂也可能改变色谱的分离情况。譬如乙醚或氯仿常常含有微量的乙醇等作为稳定剂，当用做展开剂时，这微量作稳定剂的极性溶剂也会影响色谱的重现性。薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-相对湿度的控制?作为一种“开放系统”的薄层色谱，环境因素往往明显地影响色谱的层析行为。对于如硅胶、氧化铝这类亲水性吸附剂，以及对疏水性展开溶剂，环境的相对湿度对其影响是很明显的苍术薄层色谱图苍术薄层色谱图(RHRH比较比较)此样品适宜在较高相对湿度环境下展开连翘薄层色谱湿度比较连翘薄层色谱湿度比较（*：连翘苷）：连翘苷）18%32%47%58%65%72%白头翁与木香相对湿度比较RHRH相对湿度比较表薄层色谱技术如何发展提高操作规范化-展开温度的控制?温度对层析行为的最明显的影响是分离度和Rf值。经常遇到的一种情况是同样的试验需要在夏天做，又须在冬天做，或者在南方和北方的试验室重复试验，这就遇到温度不同造成的影响，而使结果不易重现。最基本的要求是在薄层色谱记录中同时记录试验时的温度和相对湿度。在像我国这样幅员辽阔的国家，很需要有一种可以控制温度和相对湿度的展开装置。现在已有相对湿度可控的展开设备ADC2。淫羊藿薄层色谱不同展开温度的比较*宝藿苷）?3018关于薄层色谱的重现性问题?薄层色谱的重现性一直被认为是一个难以解决的问题。但是，器材落后、操作粗放造成的重现性不好，不应该是任何色谱技术，乃至所有分析技术的“原罪”(我们不妨假设液相色谱仍然是手工装柱的状况)。其实，规范化的条件是保证良好重现性的必要前提。Aristolochiaspp.药材中马兜铃酸的薄层色谱鉴别重现性验证实验室A 实验室B西洋参不同薄层板色谱图比较中国药典2005年版一部薄层色谱附录的修订?中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法?1，强调了“市售预制板”，以进一步保证收载在药典中的中药薄层色谱鉴别和含量测定的质量。讲自制薄层板放在次要的位置，即“在保证色谱质量的前提下，如需要对薄层板进行特别处理和化学改性，以适应供试品分离的要求时，也可用实验室自制的薄层板”。这就为将来全面推广使用商品预制板进一步规范化规范化做准备。中国药典2005年版一部薄层色谱附录的修订?2，点样器材也提高了要求。提出使用微升毛细管，用“手动、半自动、全自动点样器材”。?3，增加了对高效薄层板的使用注意点，点样的直径(不大于2mm)和样品间距(不少于5mm),展距(58mm)。?4，色谱记录强调用拍摄光学照片或电子图像的形式保存。中国药典2005年版一部薄层色谱附录的修订?5，薄层色谱扫描法项下，规定“扫描方法可采用单波长扫描或双波长扫描。如采用双波长扫描，应选用待测斑点无吸收或最小吸收的波长为参比波长，供试品色谱中待测斑点的比移值(Rf值)和光谱扫描得到的吸收光谱或测得的光谱最大吸收与最小吸收应与对照品相符，移保证测定结果的准确性。中国药典2005年版一部薄层色谱附录的修订?6，含量测定时，通常采用线性回归二点法计算，如线性范围很窄时，可用多点法校正，多项式回归计算。?7，扫描式，应沿展开在方向扫描，不可横向扫描。?对同一板上点样的数量要求为“供试品点样不得少于2个”，对照品每1浓度少于2个。?分离度应大于1.0，同板的标准偏差应不大于3.0%，显色后测定的应不大于5.0%薄层色谱扫描定量测定黄连中小檗碱荧光扫描测定（典型案例）甲苯-醋酸乙酯-甲醇-异丙醇-水(6:3:2:1.5:0.3)氨蒸气预平衡荧光扫描；线性范围：18.28ng329.04ng回归方程：Y=720.146+34.942X r=0.9981 RSD=3.80 小檗碱