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第四章蛋白质化学.pptx

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1、2006-8第四章 蛋白质化学1第四章第四章 蛋白质化学蛋白质化学(Chemistry of Protein)2006-8第四章 蛋白质化学2导导 学学1.掌握蛋白质的分子组成与结构掌握蛋白质的分子组成与结构掌握蛋白质的分子组成与结构掌握蛋白质的分子组成与结构2.熟悉蛋白质的理化;常用分离、纯化技术的熟悉蛋白质的理化;常用分离、纯化技术的熟悉蛋白质的理化;常用分离、纯化技术的熟悉蛋白质的理化;常用分离、纯化技术的基本原理。基本原理。基本原理。基本原理。3.了解蛋白质分子结构与功能的关系;蛋白质了解蛋白质分子结构与功能的关系;蛋白质了解蛋白质分子结构与功能的关系;蛋白质了解蛋白质分子结构与功能的

2、关系;蛋白质的分类以及重要的活性肽。的分类以及重要的活性肽。的分类以及重要的活性肽。的分类以及重要的活性肽。2006-8第四章 蛋白质化学3教学内教学内容容l 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成l 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构l 蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化l蛋白质的分类蛋白质的分类蛋白质的分类蛋白质的分类2006-8第四章 蛋白质化学4第一节第一节 蛋白质的分子组成蛋白质的分子组成蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量蛋白质含量=样品所含氮量样品所含氮量样品所

3、含氮量样品所含氮量6.256.256.256.25一、蛋白质元素组成:一、蛋白质元素组成:蛋白质的特征元素,平均含量:蛋白质的特征元素,平均含量:蛋白质的特征元素,平均含量:蛋白质的特征元素,平均含量:16%16%16%16%CHONS2006-8第四章 蛋白质化学5二、蛋白质的基本组成单位二、蛋白质的基本组成单位氨基酸氨基酸(一)氨基酸的结构(一)氨基酸的结构共同结构共同结构共同结构共同结构2006-8第四章 蛋白质化学6氨基酸结构特点:氨基酸结构特点:l2020种编码氨基酸种编码氨基酸种编码氨基酸种编码氨基酸l氨基酸的不同在于氨基酸的不同在于氨基酸的不同在于氨基酸的不同在于R R侧链不同侧

4、链不同侧链不同侧链不同l均为均为均为均为L-L-氨基酸氨基酸氨基酸氨基酸l(甘氨酸、脯氨酸除外)(甘氨酸、脯氨酸除外)(甘氨酸、脯氨酸除外)(甘氨酸、脯氨酸除外)2006-8第四章 蛋白质化学7(二)氨基酸的分类(二)氨基酸的分类1.非极性中性氨基酸非极性中性氨基酸非极性中性氨基酸非极性中性氨基酸2.极性中性基氨基酸极性中性基氨基酸极性中性基氨基酸极性中性基氨基酸3.极性酸性氨基酸极性酸性氨基酸极性酸性氨基酸极性酸性氨基酸4.极性碱性氨基酸极性碱性氨基酸极性碱性氨基酸极性碱性氨基酸根据根据根据根据R R基极性大小分:基极性大小分:基极性大小分:基极性大小分:R基有极性,但不带电,呈亲水性R基无

5、极性,呈疏水性R基有极性,电离后R基带负电荷R基有极性,电离后R基带正电荷2006-8第四章 蛋白质化学8非非极极性性中中性性氨氨基基酸酸NHCH32CH22006-8第四章 蛋白质化学9极极性性中中性性氨氨基基酸酸Cys,2006-8第四章 蛋白质化学10酸性氨基酸酸性氨基酸2006-8第四章 蛋白质化学11碱性氨基酸碱性氨基酸H2N-C-NH=NH2006-8第四章 蛋白质化学12(三)氨基酸的理化性质(三)氨基酸的理化性质氨基酸具有氨基酸具有氨基酸具有氨基酸具有氨基氨基氨基氨基、羧基羧基羧基羧基等等等等能接受能接受能接受能接受HH+而成而成而成而成NHNH3 3+具碱性具碱性具碱性具碱性

6、能电离出能电离出H H+而成而成COOCOO-具酸性具酸性1.两性电离和等电点两性电离和等电点2006-8第四章 蛋白质化学13氨基酸的两性电离氨基酸的两性电离pHpI pH=pIpHpIpHpI等电点:等电点:等电点:等电点:氨基酸所带正负电荷相等时溶液的氨基酸所带正负电荷相等时溶液的氨基酸所带正负电荷相等时溶液的氨基酸所带正负电荷相等时溶液的pHpHpHpH(pIpIpIpI)值即该值即该值即该值即该氨基酸的等电点氨基酸的等电点氨基酸的等电点氨基酸的等电点2006-8第四章 蛋白质化学142.茚三酮反应茚三酮反应(蓝紫色)(蓝紫色)(蓝紫色)(蓝紫色)脯氨酸、羟脯氨酸与茚三酮反应生成脯氨酸

7、、羟脯氨酸与茚三酮反应生成黄色化合物黄色化合物2006-8第四章 蛋白质化学15三、肽三、肽(一)肽的形成和命名(一)肽的形成和命名 肽键的形成肽键的形成1.肽键肽键2006-8第四章 蛋白质化学16肽键平面肽键平面肽键平面肽键平面2006-8第四章 蛋白质化学172.肽的形成与命名肽的形成与命名l肽、寡肽肽、寡肽肽、寡肽肽、寡肽(oligopeptide)(oligopeptide)、多肽、多肽、多肽、多肽(polypeptide)(polypeptide)l多肽链(多肽链(多肽链(多肽链(polypeptide chainpolypeptide chain)l主链骨架(主链骨架(主链骨架(

8、主链骨架(backbonebackbone)l侧链部分(侧链部分(侧链部分(侧链部分(side chainside chain)l羧基末端或羧基末端或羧基末端或羧基末端或C-C-末端(末端(末端(末端(C-terminusC-terminus)l氨基末端或氨基末端或氨基末端或氨基末端或N-N-末端(末端(末端(末端(N-terminusN-terminus)2006-8第四章 蛋白质化学18多肽链的结构多肽链的结构 侧链侧链N-末端末端C-末端末端主链骨架主链骨架HOH2006-8第四章 蛋白质化学19(二)体内重要的肽(二)体内重要的肽 谷胱甘肽(谷胱甘肽(GSH)的结构)的结构Glu-Cy

9、s-Gly功能基:功能基:-SH-SH解毒剂、抗氧化剂解毒剂、抗氧化剂2006-8第四章 蛋白质化学20第二节第二节 蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构蛋白质的分子结构基本结构基本结构空间结构空间结构一级结构一级结构二级结构二级结构三级结构三级结构四级结构四级结构2006-8第四章 蛋白质化学21一、一级结构一、一级结构l概念:多肽链中氨基酸的组成与排列顺序概念:多肽链中氨基酸的组成与排列顺序概念:多肽链中氨基酸的组成与排列顺序概念:多肽链中氨基酸的组成与排列顺序l主键:肽键主键:肽键主键:肽键主键:肽键l意义:决定蛋白质的空间结构意义:决定蛋白质的空间结构意义:决定蛋白质的空间

10、结构意义:决定蛋白质的空间结构2006-8第四章 蛋白质化学22胰岛素的一级结构胰岛素的一级结构A链链B链链2006-8第四章 蛋白质化学23二、二级结构二、二级结构 (secondary structuresecondary structure)l定义定义定义定义 蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转,构成蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转,构成蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转,构成蛋白质分子中由于肽键平面的相对旋转,构成的局部空间构象。的局部空间构象。的局部空间构象。的局部空间构象。2006-8第四章 蛋白质化学24(一)二级结构的类型(一)二级结构的类型l-螺旋螺旋l-折叠折叠l-转角转

11、角l无规则卷曲无规则卷曲2006-8第四章 蛋白质化学251.-螺旋(螺旋(-helix)右手螺旋右手螺旋右手螺旋右手螺旋 每周含每周含每周含每周含3.63.6个残基个残基个残基个残基 螺距螺距螺距螺距0.540.54nmnm 作用键:氢键作用键:氢键作用键:氢键作用键:氢键0.50nm0.54nm氢键氢键-碳原子碳原子侧链侧链2006-8第四章 蛋白质化学262.-折叠折叠(-sheet)锯齿状锯齿状锯齿状锯齿状顺向平行顺向平行顺向平行顺向平行、逆向平行逆向平行逆向平行逆向平行作用键:作用键:作用键:作用键:氢键氢键氢键氢键平行平行俯视俯视侧视侧视反平行反平行俯视俯视侧视侧视2006-8第四

12、章 蛋白质化学273.-转角(转角(-turn)2006-8第四章 蛋白质化学284无规卷曲(无规卷曲(random coil)l肽链的肽键平面不规则排列,形成松散的二级肽链的肽键平面不规则排列,形成松散的二级肽链的肽键平面不规则排列,形成松散的二级肽链的肽键平面不规则排列,形成松散的二级结构。结构。结构。结构。2006-8第四章 蛋白质化学29(二)超二级结构与结构域(二)超二级结构与结构域 超二级结构(超二级结构(超二级结构(超二级结构(super secondary structuresuper secondary structure)l二级结构单元进一步聚集和组合在一起二级结构单元进一

13、步聚集和组合在一起二级结构单元进一步聚集和组合在一起二级结构单元进一步聚集和组合在一起模模模模序(序(序(序(motifmotif)l如如如如、等等等等 亮氨酸拉链和锌指结构亮氨酸拉链和锌指结构亮氨酸拉链和锌指结构亮氨酸拉链和锌指结构 2006-8第四章 蛋白质化学30(二)超二级结构与结构域(二)超二级结构与结构域结构域(结构域(结构域(结构域(domaindomain)l超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区超二级结构的进一步组合、折叠形成的球状区域。域。域。域。l是蛋白质的功能部位是蛋白质的功能部位是蛋白质

14、的功能部位是蛋白质的功能部位2006-8第四章 蛋白质化学31免疫球蛋白结构域免疫球蛋白结构域免疫球蛋白结构域免疫球蛋白结构域 重链重链轻链轻链结构域结构域2006-8第四章 蛋白质化学32三、三级结构三、三级结构(tertiary structure)l定义:定义:定义:定义:在二级结构基础上,所有原子(主链在二级结构基础上,所有原子(主链在二级结构基础上,所有原子(主链在二级结构基础上,所有原子(主链+侧链)侧链)侧链)侧链)相互作用形成的空间构象相互作用形成的空间构象相互作用形成的空间构象相互作用形成的空间构象 2006-8第四章 蛋白质化学33三、三级结构三、三级结构(tertiary

15、 structure)l化学键化学键化学键化学键-氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键氢键、疏水键、离子键、二硫键等次级键-亲水基团:分子表面;疏水基团:分子内部亲水基团:分子表面;疏水基团:分子内部亲水基团:分子表面;疏水基团:分子内部亲水基团:分子表面;疏水基团:分子内部2006-8第四章 蛋白质化学34三级结构示意图三级结构示意图二硫键二硫键极性基团极性基团 离子键离子键 2006-8第四章 蛋白质化学35四、四级结构四、四级结构(quaternary structre)定义:定义:定义:定义:两个或两个以上独立三级

16、结构的多肽链两个或两个以上独立三级结构的多肽链两个或两个以上独立三级结构的多肽链两个或两个以上独立三级结构的多肽链 通过通过通过通过次级键次级键次级键次级键结合而形成的空间结构结合而形成的空间结构结合而形成的空间结构结合而形成的空间结构疏水键、氢键、盐键疏水键、氢键、盐键疏水键、氢键、盐键疏水键、氢键、盐键亚亚基基2006-8第四章 蛋白质化学36血红蛋白四级结构示意图血红蛋白四级结构示意图4 4个亚基构成个亚基构成个亚基构成个亚基构成2 2-亚基亚基亚基亚基2 2-亚基亚基亚基亚基2006-8第四章 蛋白质化学37 蛋白质一、二、三、四级结构示意图蛋白质一、二、三、四级结构示意图2006-8

17、第四章 蛋白质化学38五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键五、维持蛋白质分子空间构象的主要化学键 l氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等氢键、疏水键、离子键、范德华力、二硫键等2006-8第四章 蛋白质化学39蛋白质分子中的主要次级键蛋白质分子中的主要次级键 离子键离子键离子键离子键 疏水键疏水键疏水键疏水键 二硫键二硫键二硫键二硫键 氢氢 键键 范德华力范德华力 2006-8第四章 蛋白质化学40六、蛋白质结构与功能的关系六、蛋白质结构与功能的关系l蛋白质的一级结构决定其高级结构蛋白质的一级结构决定其高级结

18、构蛋白质的一级结构决定其高级结构蛋白质的一级结构决定其高级结构l蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。蛋白质的空间构象决定蛋白质的生物学功能。2006-8第四章 蛋白质化学41(一)一级结构与功能的关系(一)一级结构与功能的关系 l某些蛋白质的一级结构加工后,才具有生物学活某些蛋白质的一级结构加工后,才具有生物学活某些蛋白质的一级结构加工后,才具有生物学活某些蛋白质的一级结构加工后,才具有生物学活性。性。性。性。l如胰岛素原(如胰岛素原(如胰岛素原(如胰岛素原(proinsulinproinsulinproins

19、ulinproinsulin)的一级结构加工)的一级结构加工)的一级结构加工)的一级结构加工 2006-8第四章 蛋白质化学42(一)一级结构与功能的关系(一)一级结构与功能的关系l一级结构的改变可引起某些疾病的发生一级结构的改变可引起某些疾病的发生一级结构的改变可引起某些疾病的发生一级结构的改变可引起某些疾病的发生l由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病,称为由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病,称为由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病,称为由于蛋白质分子的变异或缺失而产生的疾病,称为分子病(分子病(分子病(分子病(molecular diseasemolecular diseasemo

20、lecular diseasemolecular disease)。l如镰状红细胞性贫血如镰状红细胞性贫血如镰状红细胞性贫血如镰状红细胞性贫血 2006-8第四章 蛋白质化学43(二)空间结构与功能的关系(二)空间结构与功能的关系 l空间构象决定蛋白质功能空间构象决定蛋白质功能空间构象决定蛋白质功能空间构象决定蛋白质功能l构象改变,功能改变构象改变,功能改变构象改变,功能改变构象改变,功能改变2006-8第四章 蛋白质化学44血红蛋白结合氧前后构象的变化血红蛋白结合氧前后构象的变化 l当血红蛋白结合氧以后,当血红蛋白结合氧以后,当血红蛋白结合氧以后,当血红蛋白结合氧以后,1 1 1 11 1

21、1 1与与与与2 2 2 22 2 2 2两个二两个二两个二两个二聚体彼此滑动聚体彼此滑动聚体彼此滑动聚体彼此滑动15151515,其构象由,其构象由,其构象由,其构象由T T T T(tensetensetensetense)型转)型转)型转)型转变为变为变为变为R R R R(relaxedrelaxedrelaxedrelaxed)型。)型。)型。)型。Hb(T态态)HbO2(R态态)1122152006-8第四章 蛋白质化学45任何一个亚基接受任何一个亚基接受氧氧分子后,会增进其它亚基吸附分子后,会增进其它亚基吸附氧氧分子的能力分子的能力环境氧浓度高时环境氧浓度高时Hb快速吸收氧分子快

22、速吸收氧分子环境氧浓度低时环境氧浓度低时Hb快速释出氧分子快速释出氧分子动脉动脉静脉静脉血红蛋白对氧的运输血红蛋白对氧的运输2006-8第四章 蛋白质化学46第三节第三节 蛋白质的理化性质与分离纯化蛋白质的理化性质与分离纯化 2006-8第四章 蛋白质化学47一、蛋白质的理化性质一、蛋白质的理化性质(一)蛋白质的一般性质(一)蛋白质的一般性质 1.蛋白质的紫外吸收特征蛋白质的紫外吸收特征蛋白质(色氨酸、酪氨酸)(苯丙氨酸)蛋白质(色氨酸、酪氨酸)(苯丙氨酸)蛋白质(色氨酸、酪氨酸)(苯丙氨酸)蛋白质(色氨酸、酪氨酸)(苯丙氨酸)=280nm =260nm=280nm =260nm 紫外吸收(与

23、蛋白质浓度成正比)紫外吸收(与蛋白质浓度成正比)紫外吸收(与蛋白质浓度成正比)紫外吸收(与蛋白质浓度成正比)2006-8第四章 蛋白质化学48蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收10,000100010010 200 250 300波长(波长(nm)TrpPheTyr摩摩尔尔吸吸光光度度(M-1cm-1)2006-8第四章 蛋白质化学492.2.蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离和等电点 l与氨基酸的两性电离、等电点相同与氨基酸的两性电离、等电点相同与氨基酸的两性电离、等电点相同与氨基酸的两性电离、等电点相同2006-8第四章 蛋白质化学50l双缩脲反应:双缩脲反应:双缩脲反应:双缩脲反应:

24、CuCu2+2+蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 紫色络合物紫色络合物紫色络合物紫色络合物 OHOH-3.3.蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应颜色反应颜色反应光吸收光吸收光吸收光吸收定量分析定量分析定量分析定量分析2006-8第四章 蛋白质化学513.3.蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应颜色反应颜色反应光吸收光吸收光吸收光吸收定量分析定量分析定量分析定量分析l酚试剂反应:酚试剂反应:酚试剂反应:酚试剂反应:磷钨酸磷钨酸磷钨酸磷钨酸 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 蓝色化合物蓝色化合物蓝色化合物蓝色化合物 磷钼酸磷钼酸磷钼酸磷钼酸2006-8第四章 蛋白质化学52l米伦试剂

25、反应:米伦试剂反应:米伦试剂反应:米伦试剂反应:米伦试剂米伦试剂米伦试剂米伦试剂 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 红色沉淀红色沉淀红色沉淀红色沉淀 3.3.蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应颜色反应颜色反应光吸收光吸收光吸收光吸收定量分析定量分析定量分析定量分析2006-8第四章 蛋白质化学53l考马斯亮蓝反应:考马斯亮蓝反应:考马斯亮蓝反应:考马斯亮蓝反应:考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝考马斯亮蓝 蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质 (R-250R-250)红蓝色红蓝色红蓝色红蓝色 (G-250G-250)蓝绿色蓝绿色蓝绿色蓝绿色3.3.蛋白质的呈色反应蛋白质的呈色反应 颜色反应颜色反应颜色

26、反应颜色反应光吸收光吸收光吸收光吸收定量分析定量分析定量分析定量分析2006-8第四章 蛋白质化学54(二)蛋白质的高分子性质(二)蛋白质的高分子性质 1.1.1.1.蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质l蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围蛋白质分子的直径在胶体颗粒的范围(1(1(1(1 100nm)100nm)100nm)100nm)l蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液蛋白质溶液是稳定亲水胶体溶液l稳定因素:水化膜、同种电荷稳定因素:水化膜、同种电荷稳定

27、因素:水化膜、同种电荷稳定因素:水化膜、同种电荷2006-8第四章 蛋白质化学55碱碱 碱碱酸酸 酸酸 2006-8第四章 蛋白质化学562.2.蛋白质的扩散与沉降蛋白质的扩散与沉降l蛋白质分子大,扩散速度慢蛋白质分子大,扩散速度慢蛋白质分子大,扩散速度慢蛋白质分子大,扩散速度慢l沉降:通过超速离心克服布朗运动使沉降:通过超速离心克服布朗运动使沉降:通过超速离心克服布朗运动使沉降:通过超速离心克服布朗运动使 蛋白质颗粒下沉的现象蛋白质颗粒下沉的现象蛋白质颗粒下沉的现象蛋白质颗粒下沉的现象 l沉降系数(沉降系数(沉降系数(沉降系数(S S)可粗略反映蛋白质分子大小可粗略反映蛋白质分子大小可粗略反

28、映蛋白质分子大小可粗略反映蛋白质分子大小2006-8第四章 蛋白质化学573.3.蛋白质的蛋白质的变性变性与复性与复性 变性剂变性剂变性剂变性剂蛋白质空间蛋白质空间蛋白质空间蛋白质空间构象破坏构象破坏构象破坏构象破坏生物学活性丧失生物学活性丧失生物学活性丧失生物学活性丧失理化性质改变理化性质改变理化性质改变理化性质改变加热、酸碱、有机溶剂、加热、酸碱、有机溶剂、加热、酸碱、有机溶剂、加热、酸碱、有机溶剂、尿素、盐酸胍、去污剂尿素、盐酸胍、去污剂尿素、盐酸胍、去污剂尿素、盐酸胍、去污剂易水解易水解易水解易水解易沉淀易沉淀易沉淀易沉淀蛋白质非共价键蛋白质非共价键蛋白质非共价键蛋白质非共价键和二硫键

29、破坏,和二硫键破坏,和二硫键破坏,和二硫键破坏,不涉及肽键不涉及肽键不涉及肽键不涉及肽键2006-8第四章 蛋白质化学58复性:去除变性因素,蛋白质恢复空间构象复性:去除变性因素,蛋白质恢复空间构象复性:去除变性因素,蛋白质恢复空间构象复性:去除变性因素,蛋白质恢复空间构象 与生物学活性的过程与生物学活性的过程与生物学活性的过程与生物学活性的过程3.3.蛋白质的变性与蛋白质的变性与复性复性2006-8第四章 蛋白质化学59核糖核酸酶的变性与复性示意图核糖核酸酶的变性与复性示意图8M尿素或尿素或-巯基乙醇巯基乙醇透析透析2006-8第四章 蛋白质化学60l某些蛋白质在发生热变性后,松散的多肽链相

30、某些蛋白质在发生热变性后,松散的多肽链相某些蛋白质在发生热变性后,松散的多肽链相某些蛋白质在发生热变性后,松散的多肽链相互缠绕在一起,变成固体状态,称为蛋白质的互缠绕在一起,变成固体状态,称为蛋白质的互缠绕在一起,变成固体状态,称为蛋白质的互缠绕在一起,变成固体状态,称为蛋白质的凝固凝固凝固凝固(coagulationcoagulation)。2006-8第四章 蛋白质化学61二、蛋白质的分离纯化鉴定技术二、蛋白质的分离纯化鉴定技术 蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及蛋白质在细胞内常与核酸、多糖、脂类及其它小分子物质结合

31、在一起,需要对其进行分其它小分子物质结合在一起,需要对其进行分其它小分子物质结合在一起,需要对其进行分其它小分子物质结合在一起,需要对其进行分离、纯化与鉴定。离、纯化与鉴定。离、纯化与鉴定。离、纯化与鉴定。2006-8第四章 蛋白质化学62(一)离心(一)离心l原理:分子大小、密度不同原理:分子大小、密度不同原理:分子大小、密度不同原理:分子大小、密度不同沉降速度不同沉降速度不同沉降速度不同沉降速度不同l分类:分类:分类:分类:普通离心:普通离心:普通离心:普通离心:310 kr/min310 kr/min 高速离心:高速离心:高速离心:高速离心:1025 kr/min1025 kr/min

32、超速离心:超速离心:超速离心:超速离心:25 kr/min25 kr/minl常用常用常用常用S S值表示蛋白质分子质量相对大小值表示蛋白质分子质量相对大小值表示蛋白质分子质量相对大小值表示蛋白质分子质量相对大小2006-8第四章 蛋白质化学63(二)透析(二)透析(dialysis)l用透析袋(半透膜)把大分子和小分子分开的方法用透析袋(半透膜)把大分子和小分子分开的方法用透析袋(半透膜)把大分子和小分子分开的方法用透析袋(半透膜)把大分子和小分子分开的方法2006-8第四章 蛋白质化学64(三)沉淀(三)沉淀(precipitation)l定义:定义:定义:定义:蛋白质分子相互聚集从溶液中

33、析出的现象蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现象蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现象蛋白质分子相互聚集从溶液中析出的现象l原理:原理:原理:原理:破坏同种电荷和水化膜破坏同种电荷和水化膜破坏同种电荷和水化膜破坏同种电荷和水化膜2006-8第四章 蛋白质化学65蛋白质的沉淀示意图蛋白质的沉淀示意图2006-8第四章 蛋白质化学66(三)沉淀(三)沉淀(precipitation)l方法:方法:方法:方法:盐析法盐析法盐析法盐析法 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法 生物碱试剂沉淀法生物碱试剂沉淀法生物碱试剂沉淀法生物碱

34、试剂沉淀法2006-8第四章 蛋白质化学671.1.盐析(盐析(salting out)法)法 l定义:高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀定义:高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀定义:高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀定义:高浓度中性盐使蛋白质从溶液中析出沉淀的方法的方法的方法的方法l原理:破坏水化膜、中和电荷原理:破坏水化膜、中和电荷原理:破坏水化膜、中和电荷原理:破坏水化膜、中和电荷l特点:蛋白质不变性特点:蛋白质不变性特点:蛋白质不变性特点:蛋白质不变性l分段盐析:不同浓度的中性盐分离不同蛋白质分段盐析:不同浓度的中性盐分离不同蛋白质分段盐析:不同浓度的中性盐分离不同蛋白质分段盐析

35、:不同浓度的中性盐分离不同蛋白质2006-8第四章 蛋白质化学682.2.有机溶剂沉淀蛋白质有机溶剂沉淀蛋白质 l原理:破坏水化膜原理:破坏水化膜原理:破坏水化膜原理:破坏水化膜l条件:条件:条件:条件:pH=pIpH=pIpH=pIpH=pIl特点:常在低温下进行特点:常在低温下进行特点:常在低温下进行特点:常在低温下进行l常用有机溶剂:乙醇、丙酮等常用有机溶剂:乙醇、丙酮等常用有机溶剂:乙醇、丙酮等常用有机溶剂:乙醇、丙酮等2006-8第四章 蛋白质化学693.3.重金属盐沉淀蛋白质重金属盐沉淀蛋白质l原理:中和负电荷原理:中和负电荷原理:中和负电荷原理:中和负电荷l条件:条件:条件:条件

36、:pHpHpHpHpIpIpIpIl特点:蛋白质变性特点:蛋白质变性特点:蛋白质变性特点:蛋白质变性2006-8第四章 蛋白质化学704.生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质生物碱试剂与某些酸类沉淀蛋白质l原理:中和正电荷原理:中和正电荷原理:中和正电荷原理:中和正电荷l条件:条件:条件:条件:pHpHpHpHpIpIpIpIl特点:蛋白质变性特点:蛋白质变性特点:蛋白质变性特点:蛋白质变性l常用酸类:苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝常用酸类:苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝常用酸类:苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝常用酸类:苦味酸、鞣酸、钨酸、三氯醋酸、硝酸、过氯酸等酸、过氯酸等酸、过氯酸等酸、过

37、氯酸等2006-8第四章 蛋白质化学71(四)蛋白质层析(四)蛋白质层析(chromatography)l定义:待分离的液体(流动相定义:待分离的液体(流动相定义:待分离的液体(流动相定义:待分离的液体(流动相mobile phase mobile phase)经)经)经)经过一个固态物质(固定相过一个固态物质(固定相过一个固态物质(固定相过一个固态物质(固定相solid phase)solid phase)后所发生的后所发生的后所发生的后所发生的各组分在两相中分布的变化。各组分在两相中分布的变化。各组分在两相中分布的变化。各组分在两相中分布的变化。l原理:根据混合物溶液中蛋白质分子的大小、形

38、原理:根据混合物溶液中蛋白质分子的大小、形原理:根据混合物溶液中蛋白质分子的大小、形原理:根据混合物溶液中蛋白质分子的大小、形状、极性、亲和力等差异而加以分离。状、极性、亲和力等差异而加以分离。状、极性、亲和力等差异而加以分离。状、极性、亲和力等差异而加以分离。2006-8第四章 蛋白质化学72l类型:类型:类型:类型:离子交换层析(离子交换层析(离子交换层析(离子交换层析(ion exchange chromatographyion exchange chromatographyion exchange chromatographyion exchange chromatography)凝胶

39、过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)(gel filtration chromatography)(gel filtration chromatography)(gel filtration chromatography)亲和层析亲和层析亲和层析亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)(affinity chromatography)(affinity chromatography)(四)蛋白质层析(四)蛋白质层析(chromatography)2006-8

40、第四章 蛋白质化学73离子交换层析离子交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析 亲和层析亲和层析2006-8第四章 蛋白质化学74(五)电泳(五)电泳(electrophoresis)l定义:定义:定义:定义:带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电极带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电极带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电极带电颗粒在电场中将向与自身电荷相反的电极移动,从而到达分离的方法。移动,从而到达分离的方法。移动,从而到达分离的方法。移动,从而到达分离的方法。2006-8第四章 蛋白质化学75l常用的电泳技术:常用的电泳技术:常用的电泳技术:常用的电泳技术:琼脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶电泳(琼

41、脂糖凝胶电泳(琼脂糖凝胶电泳(agarose gel electrophoresisagarose gel electrophoresis,AGEAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresispolyacrylamide gel electrophoresis,PAGEPAGE)等电聚焦电泳(等电聚焦电泳(等电聚焦电泳(等电聚焦电泳(isoelectric focusingisoelectric focusing,IEFIEF)双向电泳(双向电泳(双向电泳(双向电泳(two dimen

42、sional electrophoresistwo dimensional electrophoresis,2DE2DE)毛细管电泳(毛细管电泳(毛细管电泳(毛细管电泳(capillary electrophoresiscapillary electrophoresis,CECE)(五)电泳(五)电泳(electrophoresis)2006-8第四章 蛋白质化学76(六)(六)western blotting(蛋白印迹法,免(蛋白印迹法,免疫印迹法)疫印迹法)把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜(如把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜(如把电泳分离的蛋白组分转移到固定膜(如把电泳分离的蛋白组分转移到

43、固定膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜或硝酸纤维素膜、尼龙膜或硝酸纤维素膜、尼龙膜或硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDFPVDF膜)上的技术,膜)上的技术,膜)上的技术,膜)上的技术,称为称为称为称为蛋白印迹(蛋白印迹(蛋白印迹(蛋白印迹(western blottingwestern blotting)。2006-8第四章 蛋白质化学772006-8第四章 蛋白质化学78(七)蛋白质芯片(七)蛋白质芯片l将已知蛋白质固化于固体支持物上,利用蛋白将已知蛋白质固化于固体支持物上,利用蛋白将已知蛋白质固化于固体支持物上,利用蛋白将已知蛋白质固化于固体支持物上,利用蛋白质与蛋白质之间的相互作用,对未知蛋白质进质与

44、蛋白质之间的相互作用,对未知蛋白质进质与蛋白质之间的相互作用,对未知蛋白质进质与蛋白质之间的相互作用,对未知蛋白质进行检测的方法。行检测的方法。行检测的方法。行检测的方法。2006-8第四章 蛋白质化学792006-8第四章 蛋白质化学80第四节第四节 蛋白质的分类蛋白质的分类l根据分子形状分:根据分子形状分:根据分子形状分:根据分子形状分:球状蛋白球状蛋白 纤维状蛋白纤维状蛋白l根据分子组成分根据分子组成分根据分子组成分根据分子组成分 单纯蛋白质单纯蛋白质 结合蛋白质结合蛋白质2006-8第四章 蛋白质化学81the end2006-8第四章 蛋白质化学82D-型、型、L-性氨基酸结构性氨基

45、酸结构2006-8第四章 蛋白质化学83甘氨甘氨酸与脯氨酸结构酸与脯氨酸结构脯氨酸脯氨酸 COOH|HNCH|CH2CH2H2C COOH|H2NCH|H 甘氨酸甘氨酸2006-8第四章 蛋白质化学84 2006-8第四章 蛋白质化学85亮氨酸拉链亮氨酸拉链 锌指结构锌指结构2006-8第四章 蛋白质化学86胰岛素胰岛素A链链B链链胰岛素原胰岛素原C-肽肽前胰岛素原前胰岛素原信号肽信号肽胰岛素的转变生成过程胰岛素的转变生成过程2006-8第四章 蛋白质化学87镰状红细胞性贫血镰状红细胞性贫血l正常正常正常正常 链链链链 H-H-缬缬缬缬组组组组亮亮亮亮苏苏苏苏脯脯脯脯谷谷谷谷谷谷谷谷l镰状红细

46、胞性镰状红细胞性镰状红细胞性镰状红细胞性 贫血贫血贫血贫血 链:链:链:链:H-H-缬缬缬缬组组组组亮亮亮亮苏苏苏苏脯脯脯脯缬缬缬缬谷谷谷谷2006-8第四章 蛋白质化学88l对于某一特定蛋白质颗粒,其沉降速度在单对于某一特定蛋白质颗粒,其沉降速度在单对于某一特定蛋白质颗粒,其沉降速度在单对于某一特定蛋白质颗粒,其沉降速度在单位离心力场强度下为一常数,称为蛋白质的位离心力场强度下为一常数,称为蛋白质的位离心力场强度下为一常数,称为蛋白质的位离心力场强度下为一常数,称为蛋白质的沉降系数沉降系数沉降系数沉降系数,用,用,用,用S S(SvedbergSvedberg,1S=101S=10-13-13秒)表秒)表秒)表秒)表示。示。示。示。

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