第四章酶学分析技术.pptx

1第四章酶学分析技术酶学分析技术2酶（酶（enzymeenzyme）的本质：）的本质：高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性 酶的应用：酶的应用：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂 酶的特点：酶的特点：酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断床诊断和疗效判断3主要内容：主要内容：l酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识l酶活性单位的计算与校准酶活性单位的计算与校准l酶活性的测定酶活性的测定 l代谢物的酶法检测代谢物的酶法检测l同工酶测定同工酶测定 4l掌握掌握酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的酶活性单位的表示方法与计算、酶活性测定的定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。定时法与连续监测法、代谢物的酶法测定。l熟悉熟悉酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定酶促反应进程、酶促反应动力学、酶活性测定的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。的直接法与间接法、酶活性测定的影响因素。l了解了解同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的同工酶产生的机理与测定方法、酶活性单位的校准、工具酶的应用。校准、工具酶的应用。教学要求：教学要求：5第一节第一节 酶活性测定的基本知识酶活性测定的基本知识酶测定酶测定绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法绝对定量法（酶量直接测定法）：免疫学方法相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法相对定量法（酶活性间接测定法）：生化检测方法 EE6简介内容：简介内容：一、酶活性一、酶活性二、酶活性单位与酶活性浓度二、酶活性单位与酶活性浓度三、酶促反应进程三、酶促反应进程 四、酶促反应动力学四、酶促反应动力学 7一、酶活性一、酶活性n定义：酶活性（定义：酶活性（enzyme activityenzyme activity）也称为酶活力，指）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成产物的生成量量或底物的减少量。或底物的减少量。n表示方法：表示方法：或或 式中式中v v：反应速率，：反应速率，P P：产物浓度，：产物浓度，t t：时间，：时间，SS：底物浓度。：底物浓度。8二、酶活性单位与酶活性浓度二、酶活性单位与酶活性浓度（一）酶活性单位（一）酶活性单位u定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。u表示方法：表示方法：惯用单位（一定的反应量惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）一定的反应时间）国际单位国际单位IUIU（mol/minmol/min）KatalKatal单位（单位（mol/smol/s）91 1惯用单位：惯用单位：2020世纪世纪6060年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位 ALPALP的金氏单位（的金氏单位（KingKing）氨基移转酶的卡门氏单位（氨基移转酶的卡门氏单位（KarmenKarmen）特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较现在临床应用较少。少。卡门氏单位：卡门氏单位：1.0ml1.0ml血清在血清在2525，340nm340nm，反应体积，反应体积3.0ml,3.0ml,光径光径1.0cm1.0cm时时每分钟测定吸光度下降每分钟测定吸光度下降0.0010.001，即消耗，即消耗4.82 4.82 10 10-4mol NADH-4mol NADH为一个为一个卡门氏单位卡门氏单位举例：举例：金氏单位：金氏单位：100ml100ml血清血清ALPALP在在3737与底物作用与底物作用15min15min，产生，产生1mg1mg酚。酚。102.2.国际单位国际单位IUIU（mol/minmol/min）定义：在规定条件下（定义：在规定条件下（2525及其他最适条件），每及其他最适条件），每minmin催化催化1 1molmol底物转变为产物的酶量，为底物转变为产物的酶量，为1IU1IU或或1U1U，1IU=11IU=1mol/minmol/min。IFCC,2001IFCC,2001年年37373 3KatalKatal单位单位 定义：定义：1Katal1Katal是在规定条件下，每秒钟催化是在规定条件下，每秒钟催化1mol1mol底物转变为产物的底物转变为产物的酶量。酶量。1Katal1Katal1mol/s1mol/s。IUIU与与KatalKatal单位的关系：单位的关系：1katal=60101katal=60106 6IUIU，1IU=16.67nkatal 1IU=16.67nkatal 11（二）酶活性浓度（二）酶活性浓度 酶活性浓度指酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位单位体积样本中的酶活性单位。国际单位国际单位用用IU/LIU/L或或U/LU/L表示表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.12三、酶促反应进程三、酶促反应进程 以以产物生成量（或反产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标反应时间为横坐标作图所作图所得到的一条曲线，称为反得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲曲线、速率曲线、时间曲线）线）t1 t2 时间t 图5-1酶促反应进程曲线吸光度A延滞期线性期非线性期13（一）延滞期（一）延滞期（lag phase、延迟期、延迟期）u特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟 t1 t2 时间t 图5-1酶促反应进程曲线吸光度A线性期非线性期R1R2延滞期孵育期延滞期14（二）线性期（二）线性期此阶段酶促反应速率此阶段酶促反应速率基本保持恒定基本保持恒定；对底物而言，为反应速率与底物浓度对底物而言，为反应速率与底物浓度SS的零次方成正比的的零次方成正比的零级反应零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；此时底物的消耗量小于此时底物的消耗量小于5%5%，反应速率，反应速率为反应初速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短酶活性浓度越高，线性期就越短 线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A A）相对于时间（）相对于时间（minmin）变化的可以接受）变化的可以接受的程度的程度。线性度线性度=前半段前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min/（前半段（前半段A/minA/min后半段后半段A/minA/min）/2/2100100 线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于1515，否则判为非线性，否则判为非线性u特点：可代表酶促反应速度特点：可代表酶促反应速度15（三）非线性期（三）非线性期（偏离线性期、平坦期偏离线性期、平坦期）u进入非线性期的原因：进入非线性期的原因：反应的不断进行，反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。等使得反应速率明显下降。u特点：特点：若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度SS的一次方的一次方成正比，为成正比，为一级反应一级反应。16四、酶促反应动力学四、酶促反应动力学n研究内容：研究内容：研究研究酶促反应的速率酶促反应的速率及其及其各种影响因素各种影响因素（如底物浓度、（如底物浓度、酶活性浓度、温度、酶活性浓度、温度、pHpH、激活剂和抑制剂等）的科学、激活剂和抑制剂等）的科学 指导指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最适适pHpH、激活剂和抑制剂类型与含量、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性等，从而准确测定酶活性或代谢物浓度。或代谢物浓度。n研究意义研究意义:17（一）酶促反应（一）酶促反应u酶促反应式酶促反应式u米氏方程：米氏方程：K418（二）（二）Km的含义与意义的含义与意义1 1K Km m的含义的含义:当当K Km m=S=S时，时，可见，可见K Km m值等于反应速率达到最大反应速率值等于反应速率达到最大反应速率V Vmaxmax一半时的底物浓度。一半时的底物浓度。2 2KmKm的意义的意义 KmKm是酶的一个是酶的一个特征性常数特征性常数（其他如等电点），（其他如等电点），KmKm的大小只与酶的性质有关的大小只与酶的性质有关反映反映酶对底物亲和力酶对底物亲和力的大小的大小 选择酶的选择酶的最适底物最适底物或天然底物或天然底物 计算不同底物浓度时的计算不同底物浓度时的反应程度反应程度 鉴别鉴别酶的种类酶的种类 判断判断可逆反应的速率可逆反应的速率 判断酶偶联反应的判断酶偶联反应的限速反应限速反应计算计算工具酶的用量工具酶的用量19（三）（三）Vmax的含义的含义u定义：定义：VmaxVmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。u应用：计算酶的转换数（应用：计算酶的转换数（TN，催化常数，催化常数Kcat）单位时间内每）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值个酶分子将底物分子转换成产物的最大值 。计算公式为：计算公式为：(单位是单位是s s-1-1)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）20（四）（四）Km和和Vmax的测定的测定1 1、双倒数作图法：、双倒数作图法：纵轴截距为纵轴截距为斜率为斜率为横轴截距为横轴截距为 Linweaver-Burk作图法作图法21利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质：利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质：如竞争性抑制：如竞争性抑制：为表观为表观K Km mKmKm22第二节第二节 酶活性单位的计算与校准酶活性单位的计算与校准一、酶活性单位的计算（掌握）一、酶活性单位的计算（掌握）二、酶活性单位的校准（了解）二、酶活性单位的校准（了解）内容简介：内容简介：23一、酶活性单位的计算一、酶活性单位的计算（一）通用公式（一）通用公式前提条件：前提条件：必须保证启始底物量充足（必须保证启始底物量充足（SSKmKm），使），使酶促反应处于零级反应期即线性期，反应初速率等于最酶促反应处于零级反应期即线性期，反应初速率等于最大反应速率，从而使酶发挥最大活性大反应速率，从而使酶发挥最大活性mumu与酶活性正与酶活性正相关，而与启始底物量无关相关，而与启始底物量无关 24注释：式中注释：式中U U：酶活性单位数，：酶活性单位数，m0m0：规定的产物生成量：规定的产物生成量或底物消耗量，或底物消耗量，V0V0：规定的样本体积，：规定的样本体积，t0t0：规定的反：规定的反应时间，应时间，mumu：实际产物生成量或底物消耗量，：实际产物生成量或底物消耗量，VuVu：实：实际样本体积，际样本体积，tutu：实际反应时间：实际反应时间 实测的酶活性大小规定的酶活性单位(5.1)25（二）（二）采用酶活性采用酶活性惯用单位的计算公式惯用单位的计算公式常用设立标准管（校准管）的对比法（简称对比法、比较法）常用设立标准管（校准管）的对比法（简称对比法、比较法）测量吸光度的变化求出。测量吸光度的变化求出。特点：校准管并不含酶特点：校准管并不含酶 常用定时法（固定时间法）求常用定时法（固定时间法）求A,A,A=A终止点终止点-A空白空白也可用不设校准管的比尔定律摩尔吸光系数法求出也可用不设校准管的比尔定律摩尔吸光系数法求出 um mu u的确定方法：的确定方法：26u惯用单位的计算公式：惯用单位的计算公式：测定产物生成类的计算公式测定产物生成类的计算公式 测定底物消耗类的计算公式测定底物消耗类的计算公式 根据测根据测定对象定对象271 1、测定产物生成类的计算公式、测定产物生成类的计算公式 m mu u为生成的产物量，反应后从无到有，其存在量即生成量，与酶活性成正比为生成的产物量，反应后从无到有，其存在量即生成量，与酶活性成正比 常规计算方法和公式：常规计算方法和公式：设立设立一个一个校准校准管，与测定管同步操作管，与测定管同步操作。特点：特点：Cc=Cu Au：测定管吸光度，：测定管吸光度，Ac：校准管吸光度，：校准管吸光度，Cc：校准物摩尔浓度，：校准物摩尔浓度，Vc：校准物体积：校准物体积 Mu=CuVc（5.2）28校准曲线法和公式：校准曲线法和公式：设立多个校准管制备设立多个校准管制备A-UA-U校准曲线，测出校准曲线，测出AA值后查出值后查出U U值值 其中，其中，k k1 1和和AAc c都是变量，随不同都是变量，随不同的的V Vc c而呈比例变化。上相当于直线方而呈比例变化。上相当于直线方程程Y=bX Y=bX。图图5-35-3纵坐标上某一点纵坐标上某一点Au(=Ac)Au(=Ac)相对应的横坐标相对应的横坐标U U值为值为k1k1。各校准管所相当的酶活性单位数。各校准管所相当的酶活性单位数k1k1可由其不同的可由其不同的VcVc代入公式算出代入公式算出。（）(5.3)29测定管测定管：血清：血清0.1ml0.1ml加底物液等后于加底物液等后于3737水浴水浴15min15min，再加显色液显色。，再加显色液显色。同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管（在反应最后加血清），同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管（在反应最后加血清），510nm510nm处以空白管调零测出处以空白管调零测出AAu u。校准管校准管：以：以校准校准曲线中第曲线中第2 2管为例。取管为例。取0.05mg/ml0.05mg/ml的酚的酚校准液校准液0.4ml0.4ml，加，加显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚校准液校准液、其它步骤相同、其它步骤相同的空白管调零，的空白管调零，510nm510nm处测出处测出AAc c。【计算计算】由式由式5.25.2有：有：可见，第可见，第2 2管相当于酶活性单位为：管相当于酶活性单位为：2020金氏单位金氏单位/100ml/100ml血清，常简写为血清，常简写为2020金氏单位。金氏单位。【单位定义单位定义】1金氏单位：金氏单位：100ml血清血清ALP在在37与底物作用与底物作用15min，产生，产生1mg酚。酚。【操作操作】例例:金氏法测定血清金氏法测定血清ALPALP。302 2测定底物消耗类的计算公式测定底物消耗类的计算公式 mumu为消耗的底物量，反应后从多到少为消耗的底物量，反应后从多到少 在测定底物消耗类时，将不加样本不加底物而加蒸馏水、其他操作与测定在测定底物消耗类时，将不加样本不加底物而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为空白管管相同的操作管称为空白管；将不加样本而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为将不加样本而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为“对比对比”校校准管（校准管）。空白管不含有底物。准管（校准管）。空白管不含有底物。“对比对比”校准管与测定管反应前底物校准管与测定管反应前底物量相同。量相同。特点：特点：单一单一校准校准管即管即“对比对比”校准校准管时的测定：因产物生成量与底物消耗量管时的测定：因产物生成量与底物消耗量相等，将式相等，将式5.25.2中代表产物生成量的中代表产物生成量的AAu u换成代表底物消耗量的换成代表底物消耗量的AAc c-A-Au u后有：后有：计算方法和公式：计算方法和公式：（5.4）31例：碘色法测定血清淀粉酶（例：碘色法测定血清淀粉酶（AMSAMS）【单位定义单位定义】1 1惯用单位：惯用单位：100ml100ml血清血清AMSAMS在在3715min3715min，水解，水解5mg5mg淀粉。淀粉。【操作操作】测定管：稀释测定管：稀释1010倍后的血清倍后的血清0.2ml0.2ml中加中加0.4g/L0.4g/L的淀粉溶液的淀粉溶液1ml371ml37水浴水浴7.5min7.5min后显色。后显色。校准校准管管(“对比对比”校准校准管管)：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同。：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同。反应完成后，反应完成后，660nm660nm处以蒸馏水调零，分别测出处以蒸馏水调零，分别测出AuAu、AcAc。【计算计算】由式由式5.45.4有：有：32（三）（三）采用酶活性采用酶活性国际单位的计算公式国际单位的计算公式1 1用微摩尔吸光系数（用微摩尔吸光系数（）表示的国际单位计算公式）表示的国际单位计算公式 摩尔吸光系数摩尔吸光系数是表示吸光度与摩尔浓度（是表示吸光度与摩尔浓度（mol/Lmol/L）、光）、光径（径（cmcm）之间关系的一个法定计量单位）之间关系的一个法定计量单位.摩尔吸光系数摩尔吸光系数微摩尔吸光系数微摩尔吸光系数毫摩尔吸光系数毫摩尔吸光系数33 在在连续监测法测定酶活性连续监测法测定酶活性时，时，tutu为酶促反应曲线线性期内时间变化为酶促反应曲线线性期内时间变化值（亦可表示为值（亦可表示为tu tu），），AuAu为线性期内测定管吸光度变化值为线性期内测定管吸光度变化值 上式中上式中：摩尔吸光系数，：摩尔吸光系数，CuCu：样本摩尔浓度（原始浓度），：样本摩尔浓度（原始浓度），l l：比：比色杯光径。色杯光径。注意注意Cu/nuCu/nu为比色杯中的样本摩尔浓度（比色浓度）为比色杯中的样本摩尔浓度（比色浓度）。根据酶活性国际单位的定义：根据酶活性国际单位的定义：m m0 0=1=1molmol，t t0 0=1min=1min。常取规定样本体积。常取规定样本体积V V0 0=1L=1L。相应地，。相应地，t tu u计量单位为计量单位为minmin，变为变为的的L Lmolmol-1-1cmcm-1-1，l l为为cmcm，则用微，则用微摩尔吸光系数（摩尔吸光系数（）表示的国际单位）表示的国际单位计算计算公式由上式可简化为：公式由上式可简化为：(5.5)34另外一种推导方式另外一种推导方式 将比尔定律将比尔定律Au=Cul/nuAu=Cul/nu两边同时除以两边同时除以tutu，结合样本稀释倍数展开后得到，结合样本稀释倍数展开后得到35 0.2ml 0.2ml样本中加入底物液于样本中加入底物液于3715min3715min，终止反应后总体积为，终止反应后总体积为5.2ml5.2ml。405nm405nm处以空白管调零，处以空白管调零，1cm1cm比色杯中测比色杯中测AAu u。已知对硝。已知对硝基酚在该条件下的基酚在该条件下的为为18 380 L18 380 Lmolmol-1-1cmcm-1-1。例例:对硝基酚比色法测对硝基酚比色法测-N-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAGNAG）。）。【计算计算】由式由式5.75.7有有362 2用毫摩尔吸光系数（用毫摩尔吸光系数（mm）、摩尔吸光系数（）、摩尔吸光系数（）表示的国际单位计算公式表示的国际单位计算公式 在吸光系数的数值关系上，以在吸光系数的数值关系上，以340nm340nm处处NADHNADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型辅酶苷酸，还原型辅酶）在一定条件下的吸光系数为例：在一定条件下的吸光系数为例：=6.2210=6.22103 3 L Lmolmol-1-1cmcm-1-1 mm =6.22 L=6.22 Lmmolmmol-1-1cmcm-1-1 =6.2210=6.2210-3-3 L Lmolmol-1-1cmcm-1-1 可见，可见，mm值值 =10=103 3值，值，值值=10=106 6值值，各代入式，各代入式5.55.5后有后有：（5.6）（5.7）（5.8）37 3 3计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化方向的关系方向的关系 式式5.55.5、式、式5.65.6、式、式5.75.7中中AAu u/t/tu u以外的部分都相等，称为计算因数以外的部分都相等，称为计算因数FactorFactor值（简称值（简称F F值，或值，或K K值）：值）：（5.9）由式由式5.95.9展开后可见，展开后可见，F F值的单位是值的单位是mol/Lmol/L。不作校准时可采用试剂盒。不作校准时可采用试剂盒厂家给定的厂家给定的F F值值.384 4国际单位间无可比性国际单位间无可比性 国际单位数相同的不同酶国际单位数相同的不同酶并不表示酶含量相同，因为其并不表示酶含量相同，因为其具体反应条件不尽相同，酶的激活与抑制状态也不相同，故具体反应条件不尽相同，酶的激活与抑制状态也不相同，故国际单位之间无可比性国际单位之间无可比性。一般用分光光度法测定酶活性，也可用荧光法测酶活性。荧光法测定一般用分光光度法测定酶活性，也可用荧光法测酶活性。荧光法测定酶活性的计算式与分光光度法计算式相似，酶活性的计算式与分光光度法计算式相似，仅将式中的吸光度仅将式中的吸光度A A换成荧光换成荧光强度强度F F即可。即可。（四）（四）katalkatal单位与国际单位间的关系式单位与国际单位间的关系式 据定义，据定义，1katal=1mol/s=1katal=1mol/s=106106mol/(1/60min)=60106mol/(1/60min)=60106mol/min=60106IUmol/min=60106IU 1nkatal=0.06IU 1nkatal=0.06IU 1IU=16.67nkatal 1IU=16.67nkatal（五）荧光法测定酶活性单位的计算公式（五）荧光法测定酶活性单位的计算公式39二、酶活性单位的校准二、酶活性单位的校准(了解了解)两种方式：两种方式：一是用实际测定的摩尔吸光系数一是用实际测定的摩尔吸光系数进行校准进行校准；二是用酶校准物（二是用酶校准物（calibratorcalibrator，校准品）来校准。，校准品）来校准。速率法测酶活性时，需要用实际测定的速率法测酶活性时，需要用实际测定的来计算真实来计算真实的的K K值：将已知浓度的生色物如值：将已知浓度的生色物如NADPHNADPH（还原型尼克酰胺腺（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶）、对硝基苯酚等，或）、对硝基苯酚等，或底物如葡萄糖等作为样本进行酶活性测定，测出吸光度变底物如葡萄糖等作为样本进行酶活性测定，测出吸光度变化值后计算出真实的化值后计算出真实的K K值，再代入连续监测法公式可以比值，再代入连续监测法公式可以比较准确地计算出样本酶活性含量。较准确地计算出样本酶活性含量。用实际测定的摩尔吸光系数进行校准:40第三节第三节 酶活性的测定酶活性的测定n测定方法分类：测定方法分类：按照仪器检测方法分类按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、：分光光度法、浊度法、荧光法、放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。按照反应时间分类按照反应时间分类；分为；分为定时法、连续监测法定时法、连续监测法和平衡法。和平衡法。按照检测对象分类按照检测对象分类：分为直接法和间接法。：分为直接法和间接法。41一、按照反应时间分类的酶活性测定方法一、按照反应时间分类的酶活性测定方法（一）定时法（一）定时法u原理：原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1t1t2t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。u特点：特点：优点：优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2t1-t2）是否）是否为零级反应为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。，故难以确保测定结果的准确性。吸光度At1 t2 时间t图5-6定时法的三种反应进程231定时法与两点法、终点法的区别定时法与两点法、终点法的区别42（二）连续监测法（二）连续监测法u原理：原理：连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，又称速率法、零级反应速率法、斜率法。又称速率法、零级反应速率法、斜率法。该方法是在一定的反应时间区段内（至少该方法是在一定的反应时间区段内（至少9 9120s120s）每隔一定时间）每隔一定时间（常为（常为2 230s30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4 4点），点），然然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率间内的反应速率A/minA/min，最后据式最后据式5.75.7等计算出酶活性。等计算出酶活性。（5.75.7）4344u特点：特点：与与定定时时法法相相比比，属属于于即即时时观观测测，无无需需停停止止酶酶促促反反应应、不不需需添添加加其其他他呈呈色色试试剂剂，且且可可将将多多点点的的测测定定结结果果绘绘图图连连线线，快快速速、直直观观查查看看酶酶促促反反应进程，应进程，很容易找到呈直线的线性期很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应；，检查到是否偏离零级反应；连连续续监监测测法法要要求求不不显显色色而而是是直直接接测测定定底底物物（或或辅辅助助底底物物即即中中间间底底物物）或或产产物物量量的的变变化化，因因此此，在在测测定定原原理理上上，可可以以选选择择紫紫外外吸吸收收法法或或生生色色原显色法；原显色法；要要求求能能够够准准确确地地控控制制温温度度、pHpH值值和和底底物物浓浓度度等等，要要求求仪仪器器具具有有恒恒温温装装置置及及自自动动监监测测功功能能，半半自自动动及及全全自自动动生生化化分分析析仪仪都都能能满满足足这这些些要要求求 ；测测定定结结果果常常较较定定时时法法高高，因因为为在在酶酶促促反反应应初初始始阶阶段段底底物物最最充充裕裕，而而产产物物的的抑抑制制作作用用、可可逆逆反反应应、酶酶变变性性等等均均很很小小，所所以以反反应应后后期期的的吸吸光光度等检测信号就比定时法要高且真实，因而度等检测信号就比定时法要高且真实，因而测定结果也较定时法准确。测定结果也较定时法准确。常用指示酶及其指示反应常用指示酶及其指示反应1 1脱氢酶脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例为辅酶的脱氢酶，例如如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：等，它们催化下列反应：P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+可对可对NAD(P)HNAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定 n应用：应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。等酶活性测定。2 2过氧化物酶过氧化物酶 PODPOD可可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比氨基安替比林（林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：2H2O2+4-AAP+酚酚 醌类化合物（红色）醌类化合物（红色）+4H2OTrinder反应反应：n应用应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，偶联，通过通过Trinder反应加以测定。反应加以测定。POD47（一）直接法（一）直接法指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。测定测定NADNAD（P P）H H的方法的方法测定人工合成的色素原底物的方法测定人工合成的色素原底物的方法测定耗氧量的方法测定耗氧量的方法测定测定pHpH改变的方法改变的方法 等等 二、按照检测对象分类的酶活性测定方法二、按照检测对象分类的酶活性测定方法481 1测定测定NADNAD（P P）H H的方法的方法原理：原理：监测监测340nm340nm吸光度的变化可以反映吸光度的变化可以反映NADNAD（P P）H H量的量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。变化，其变化与待测酶的含量正相关。对象：对象：以以NADNAD（P P）+或或NADNAD（P P）H H为辅酶的脱氢酶类为辅酶的脱氢酶类。例。例如如LDLD、G-6-PDG-6-PD、GLDHGLDH等等 。49人工合成的色素原底物人工合成的色素原底物待测酶待测酶产物的毫摩尔吸光系数产物的毫摩尔吸光系数对硝基苯酚磷酸二钠盐对硝基苯酚磷酸二钠盐（PNPP-Na2）ALP对硝基酚对硝基酚（PNP）（）（405nm，pH10.3）18.5L-谷氨酰谷氨酰-3-羧基对硝基羧基对硝基苯胺苯胺GGT2-硝基硝基-5-氨基苯甲酸氨基苯甲酸（405nm，pH8.1）9.492-氯氯-硝基酚硝基酚-半乳糖半乳糖-麦麦芽糖苷芽糖苷AMS2-氯酚（氯酚（2-CP）（）（405nm，pH6.0）6.12-氯氯-硝基酚硝基酚-岩藻糖苷岩藻糖苷-岩藻糖苷酶岩藻糖苷酶（AFU）2-CP（405nm，pH6.5）6.22 2测定人工合成的色素原底物的方法测定人工合成的色素原底物的方法 原理：原理：一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团被水解或转移，使被水解或转移，使无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原底物。底物。根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后测定酶活性。底物后测定酶活性。底物和测定对象：底物和测定对象：50（二）间接法（二）间接法 酶偶联法酶偶联法 化学法化学法 是指加入相应试剂后是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或间接测定酶促反应的产物转化物或底物转化物的理化指标底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。以测定酶活性的方法。511 1酶偶联法酶偶联法 u原理：原理：在测定待测酶在测定待测酶ExEx的活性时，常采用偶联一个工具酶（指示酶的活性时，常采用偶联一个工具酶（指示酶EiEi）或几个工具酶（辅助酶）或几个工具酶（辅助酶EaEa和指示酶和指示酶EiEi）将待测酶的某一产物转化为）将待测酶的某一产物转化为新的产物，反应速率达到平衡时，测定指示酶的反应速率来代表待测酶新的产物，反应速率达到平衡时，测定指示酶的反应速率来代表待测酶的活性。反应模式可简化为：的活性。反应模式可简化为：Ex、Ea、Ei这一连串酶促反应称为酶偶联体系这一连串酶促反应称为酶偶联体系 零级反应零级反应 一级反应一级反应 一级反应一级反应 AKmx BKma u指示酶的反应系统：指示酶的反应系统：以以NADNAD（P P）+或或NADNAD（P P）H H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反应物为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反应物NADNAD（P P）H H于于340nm340nm处紫外吸收或在紫外激发光处紫外吸收或在紫外激发光365nm365nm波长照射下，其在波长照射下，其在460nm460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统发射强烈荧光的变化速率的测定系统 ；是偶联过氧化氢（是偶联过氧化氢（H H2 2O O2 2）以过氧化物酶（）以过氧化物酶（PODPOD）为指示酶的测定系统。）为指示酶的测定系统。Trinder反应：反应：52表表5-4 5-4 一些酶偶联法的待测酶与工具酶一些酶偶联法的待测酶与工具酶待测酶辅助酶指示酶指示系统ALT无LDNAD(P)HASTLD*LD、苹果酸脱氢酶（MD）NAD(P)HCKHKG6PDNAD(P)H5-核苷酸酶（5-NT）腺苷脱氨酶（ADA）GLDHNAD(P)HLPS共脂酶、甘油激酶（GK）、GPOPODH2O2*LD：消除内源性丙酮酸的干扰。532 2化学法化学法 化学法是在反应体系中化学法是在反应体系中加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性的试剂，的试剂，这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化。这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化。丁酰硫代胆碱丁酰硫代胆碱ChE硫代胆碱（硫代胆碱（SCh）硫代胆碱（硫代胆碱（SCh）+5，5-二硫代二硫代-双（双（2-硝基苯甲酸）硝基苯甲酸）5-巯基巯基-2-硝基苯甲酸（硝基苯甲酸（5-TNBA）（黄色）（黄色）第四节第四节 酶活性测定最适条件的选择酶活性测定最适条件的选择一、标本一、标本 1.1.溶血溶血 2.2.抗凝剂抗凝剂 3.3.标本存放时间标本存放时间二、测定条件二、测定条件 底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激活剂和抑制剂因子、激活剂和抑制剂