Waters_2475_荧光检测器使用指南.pdf

Waters 2475 多多通道荧光检测器荧光检测器操作员指南34 Maple StreetMilford,MA 01757715022475MD,版本 C声明本文档中的信息如有更改，恕不另行通知，且这些信息并不作为 Waters Corporation 的承诺。Waters Corporation 对本文档中可能出现的任何错误不负任何责任。本文档在出版时被认为是完整和准确的。任何情况下，对与使用本文档有关或因使用本文档而导致的偶发或继发的损害，Waters Corporation 不负任何责任。20012006 WATERS CORPORATION.在美国和爱尔兰印刷。保留所有权利。未经出版商的书面允许，不得以任何形式转载本文档或其中的任何部分。Alliance、Millennium 和 Waters 是注册商标，Empower、LAC/E 和 SAT/IN 是 Waters Corporation 的商标。Windows 和 Windows NT 是 Microsoft Corporation 的注册商标。所有其它商标或注册商标均为其各自所有者的专有资产。iii注意：注意：使用本仪器时，请遵守质量控制和方法开发的通用步骤。如果发现某种化合物的稳定性有变化、两种化合物间的溶解性状有变化或峰形状有变化，请立即查明变化原因。变化原因查明之前，请不要相信分离结果。注意：注意：本仪器的安装类别（超电压类别）为 II 级。II 级类别适用于使用本地电压水平的（如墙壁电源插座）的设备。?注意：注意：用户若未经有关法规认证部门明确允许便对本设备进行改变或改装，将失去合法使用该设备的权利。注意：注意：处理承压聚合物管路时应该谨慎：处于承压聚合物管路附近时，一定要戴防护眼镜。熄灭附近所有明火。请勿使用严重挤压或扭曲的管线。不要在非金属管线中使用四氢呋喃(THF)、浓硝酸或浓硫酸。使用二氯甲烷及二甲基亚枫会导致非金属管线膨胀，大大降低管线的耐压能力。注意：注意：用户应当清楚，如果以制造商未指定的方式使用设备，可能有损设备所提供的保护。注意：注意：为防止发生火灾，更换保险丝时应使用类型和额定值相同的保险丝。注意：注意：为避免可能的电击，请在维修该仪器前断开电源线。iv常用符号常用符号直流电交流电保护性导线端子框架或底盘接线端注意或参阅手册注意，表面过热或温度过高注意，有电击的危险（高电压）注意，有被针刺伤的危险注意，紫外线光保险丝电源打开电源关闭UVv美国 FCC 放射性声明本设备符合 FCC 规则第 15 款之规定。设备操作受下列两个条件限制：(1)本设备不得产生有害干扰，(2)本设备会接受任何接收到的干扰，包括可能会影响正常操作的干扰。用户若未经有关法规认证部门明确允许便对本设备进行改变或改装，将失去合法使用该设备的权利。注意：注意：本设备已经过测试并被证实符合 FCC 规章第 15 款关于 B 类数字设备的限定。这些限定的目的是合理防止对居住安装环境可能产生的有害干扰。本设备产生、使用并且可能辐射射频能量，如果未按说明安装和使用，可能会对无线电通信产生有害干扰。当然，我们不保证在特定安装过程中不会出现干扰。如果本设备确实对无线电或电视接收造成有害干扰（可通过打开和关闭设备来确定），我们鼓励用户尝试以下方法来纠正干扰：重新定向或定位接收天线。加大设备与接收器之间的间隔距离。将设备连接到与接收器不同电路的插座上。咨询经销商或求助于有经验的无线电和电视技术人员。根据 FCC 规章 B 类的限制，本设备必须使用屏蔽电缆。加拿大 光谱管理放射性声明Cet appareil numrique de la classe B est conforme la norme NMB-003.本 B 类数字仪器符合加拿大 ICES-003 的要求。vi2475 多通道荧光检测器信息设计用途Waters 2475 多通道荧光检测器可应用于体外诊断性测试，以分析多种化合物，包括诊断指示剂和疗效监测化合物。开发方法时，请遵照“American Journal of Medical Technology（美国医疗科技期刊）”(1978)44 卷第 1 期 30-37 页上的“Protocol for the Adoption of Analytical Methods in the Clinical Chemistry Laboratory”。此协议包含实现系统性能和方法性能所需的完善操作步骤和方法。生物危害性分析生理性液体时，请采取一切预防措施，把所有的标本都当成潜在的传染源来对待。相关预防措施请参阅 CDC-NIH Manual（CDC-NIH 手册）上的“CDC Guidelines on Specimen Handling”。校正按照适用的纯标准样校正方法对方法进行校正。生成标准曲线时至少应使用 5 个标准样。浓度范围应覆盖质量控制样本、典型标本和非典型标本的全部范围。质量控制常规运行三个质量控制样本。质量控制样本应代表正常水平以下、正常水平和正常水平以上的化合物。确保质量控制样本的结果在允许范围内，并在每天、每次测试时都评估其精确度。质量控制样本的结果超出范围时搜集的数据可能无效。除非您确信色谱系统的性能可靠，否则不要报告此类数据。目录vii前言前言.xv第第 1 章章 工作原理工作原理.11.1 荧光原理.11.2 荧光检测.21.2.1概述.21.2.2激发源.21.2.3光源类型.21.2.4源强度过滤.31.2.5激发样品.31.2.6流动池.41.3 测量荧光.41.3.1发散单色器.41.3.2光电倍增管(PMT).41.3.3扫描.41.3.4多通道操作.41.3.5荧光数据.51.3.6参考文献.51.4 检测器说明.61.4.1独立和远程功能.61.4.2功能.71.5 工作原理.81.5.1检测器光学组件.81.5.2光学组件光路.91.5.3光电倍增管(PMT)校正.101.5.4PMT 灵敏度.101.5.5信号处理和噪音计算.101.5.6过滤噪音.111.5.7电子设备.121.5.8波长检验和测试.13目录目录viii目录1.6 操作模式.141.6.1单通道模式.141.6.2多通道模式.151.6.3光谱扫描.161.6.4空闲模式.171.6.5发散单位和归一化.171.6.6能量单位.171.7 灯能量和性能.181.8 自动优化增益.191.8.1方法优化.191.8.2建议的方法开发方法的示例.201.8.3确保为每个所需的峰进行增益优化.211.9 启动诊断.22第第 2 章章 安装检测器安装检测器.232.1 简介.232.2 场地选择和电源要求.252.2.1场地选择.252.2.2电源要求.252.3 拆箱检查.262.3.1拆除包装.262.3.2检查.262.4 进行管线连接.262.4.1连接色谱柱.272.4.2装配接头.282.4.3进行连接.282.5 连接交流电源.292.6 进行信号连接.302.6.1组件连接概述.302.6.2连接以太网电缆.322.6.3选择信号连接.342.6.4连接 I/O 信号.352.6.5连接 Alliance 分离单元.36目录ix2.6.6连接 RS-232 设备.412.6.7连接以太网设备.422.7 连接其它设备.452.7.1必备材料.452.7.2连接电缆.452.7.3使用 Bus SAT/IN 模块连接数据系统.462.7.4连接 746 数据模块.492.7.5连接图表记录器.502.7.6连接 600 系列泵.512.7.7连接 717plus 自动进样器.55第第 3 章章 使用检测器使用检测器.573.1 启动检测器.583.1.1初始化检测器.583.1.2启动失败.593.1.3空闲模式.593.2 使用操作员界面.603.2.1使用显示器.603.2.2荧光和信息图标.613.2.3使用小键盘.643.2.4浏览用户界面.693.2.5浏览至/自主屏幕.693.3 准备开始运行.713.3.1运行设置.713.3.2访问主要功能和辅助功能.723.3.3操作迹线和缩放功能.753.3.4配置检测器.773.3.5配置事件输入和接线端子.773.3.6设置脉冲周期.783.3.7设置显示器对比度.793.3.8显示系统信息.793.3.9使用帮助.79x目录3.4 操作检测器.803.4.1两种操作模式.803.4.2独立操作.803.4.3通过 RS-232 对 474 仿真模式进行远程控制操作.803.4.4使用 2475 仪器控制软件通过以太网进行远程控制操作.843.4.5检验检测器.843.4.6手动波长校正.853.4.7归一化发散单位.863.4.8在单通道模式中操作检测器.873.4.9在多通道模式中操作检测器.873.4.10 设置增益和 EUFS.893.5 设定方法和事件.923.5.1存储方法.923.5.2设定定时事件.933.5.3设定阈值事件.953.5.4存储方法.963.5.5恢复方法.973.5.6查看方法中的事件.973.5.7重置方法.973.5.8清除事件.983.6 扫描光谱.993.6.1扫描类型.993.6.2开始操作前的准备.993.6.3扫描新光谱.1043.6.4设定零扫描.1053.6.5运行样品扫描.1063.6.6使用静态流动池进行扫描.1093.7 管理结果.1103.7.1存储光谱.1103.7.2获取已存储光谱的信息.1113.7.3查看存储的光谱.1113.7.4创建差异光谱（减去光谱）.1113.7.5重放光谱.112目录xi3.8 延长灯寿命.1123.8.1手动关闭灯.1123.8.2手动打开灯.1133.8.3使用定时事件方法设定灯.1133.9 关闭检测器.114第第 4 章章 维护过程维护过程.1154.1 介绍.1154.1.1Waters 技术服务.1154.1.2备件.1154.1.3安全预防措施.1154.1.4取下左前面板机盖.1164.2 日常维护.1174.3 检查、清洗并更换流动池.1174.3.1冲洗并钝化流动池.1174.3.2取下流动池装置.1184.3.3更换流动池.1194.4 更换灯.1204.4.1何时更换灯.1204.4.2取下灯.1204.4.3安装新灯.1234.4.4记录新灯序列号.1234.5 更换保险丝.1254.5.1确定出问题的保险丝.1254.5.2更换后面板保险丝.126xii目录第第 5 章章 错误信息、诊断和故障排除错误信息、诊断和故障排除.1275.1 启动错误信息.1275.2 操作错误信息.1295.3 用户可选诊断.1325.3.1诊断概述.1325.3.2样品和参比能量诊断.1345.3.3拉曼信噪比测试诊断.1355.3.4输入和输出诊断.1355.3.5更换灯诊断.1385.3.6测试小键盘诊断.1385.3.7测试显示屏诊断.1395.3.8其它诊断.1395.3.9生成测试峰诊断.1405.3.10 覆盖滤光器诊断.1405.3.11降低 PMT 灵敏度.1415.4 故障排除.1425.4.1简介.1425.4.2联系 Waters 时需要提供的信息.1425.4.3诊断.1425.4.4电涌.1425.4.5硬件故障排除.143附录附录 A 2475 检测器规格检测器规格.145附录附录 B 备件备件.149目录xiii附录附录 C 溶剂注意事项溶剂注意事项.151C.1 概述.151C.2 溶剂混溶性.153C.3 缓冲溶剂.155C.4 头高度.155C.5 溶剂粘度.155C.6 流动相溶剂脱气.156C.6.1气体溶解度.156C.6.2溶剂脱气方法.157C.6.3溶剂脱气注意事项.157C.7 波长选择.158索引索引.163xiv目录xv前言Waters 2475 多通道荧光检测器操作员指南介绍“Waters 2475 多通道荧光检测器”的拆除包装、安装、操作、校验、维护及故障排除步骤。附录中还介绍了仪器规格、备用零件及溶剂注意事项。本指南的使用对象为任何安装、维护、操作或对“Waters 2475 多通道荧光检测器”进行故障排除的人员。使用此指南的所有人员均应熟悉 HPLC 术语和常规，并能执行基本的 HPLC 系统操作，如进行流路连接。结构本指南包含以下内容：第 1 章概述此检测器的功能并介绍操作原理和规则。第 2 章介绍如何安装此检测器、装设管线并连接电源以及将检测器连接到其它设备。第 3 章介绍如何操作此检测器以及如何使用操作员界面。第 4 章介绍如何清洗和更换此检测器的各零件。第 5 章介绍错误消息、诊断及对此检测器进行故障排除时建议使用的操作。附录 A 包括有关此检测器的操作、光学和电压规格。附录 B 列出了该检测器的推荐使用备用零件和可选备用零件。附录 C 提供了有关 Waters 检测器所用溶剂的信息。相关文档Waters 许可、担保和支持：许可、担保和支持：提供软件许可和担保信息、介绍培训和扩展支持、解释 Waters 公司如何处理运输、损坏、索赔和退货事宜。在线文档在线文档Empower 帮助：帮助：介绍基本软件及其选项的所有窗口、菜单、菜单选项和对话框。还包括 Empower 相关任务的参考信息和步骤。打印文档打印文档Waters 2695 Separations Module Operators Guide（Waters 2695 分离单元操作员指南）：分离单元操作员指南）：讲述如何拆除包装、安装、使用、维护以及对“Waters 2695 分离单元”进行故障排除。Waters 600E Multisolvent Delivery System Users Guide（Waters 600E 多溶剂输送系统用户指南）：多溶剂输送系统用户指南）：讲述如何安装、使用、维护以及对“Waters 600E 多溶剂输送系统”进行故障排除。xviWaters Bus SAT/IN Module Installation Guide（Waters Bus SAT/IN 模块安装指南）：模块安装指南）：讲述如何拆除包装、安装、使用、维护以及对“Waters Bus SAT/IN 模块”进行故障排除。Waters e-SAT/IN 模块安装指南：模块安装指南：讲述如何拆除包装、安装、使用、维护以及对“Waters e-SAT/IN 模块”进行故障排除。Empower 软件入门指南：软件入门指南：讲述如何拆除包装、安装和使用软件。Web 上的文档上的文档可在“万维网”上找到相关产品信息及文档。网址为 http:/。本指南中所使用的约定本指南中使用以下约定：注注“注”介绍对操作员有帮助的信息。例如：注意：注意：在进行下一步之前，先记录您的结果。注意注意“注意”提供有关防止损坏系统或设备的信息。例如：小心小心“小心”提供保证操作员安全所需的重要信息。例如：约定使用情况约定使用情况斜体斜体表示需要您提供的信息，如变量。它也表示强调和文档标题。例如，“以实际文件名替换 file_name。”按键术语按键表示小键盘上的按键。.三个句点指示可以任意跟随多个同类项。例如，“您可以在每个文件夹中存储 filename1、filename2.”。菜单选项间的右箭头表示用户应按顺序选择每一选项。例如，“请选择 File（文件）Exit（退出）”表示用户应首先从菜单栏选择 File（文件），然后从 File（文件）菜单中选择 Exit（退出）。?注意：注意：要避免损坏检测器流动池，请勿触摸流动池窗口。注意：注意：为防灼伤，关灯至少 60 分钟后才能拆卸它以进行更换或调整。xvii注意：注意：为避免电击和受伤，请在执行维护操作前拨下电源线。注意：注意：为避免化学或电气危险，在操作系统时，请务必遵守实验室的安全规定。xviii荧光原理1第 1 章工作原理本章介绍 Waters 2475 多通道荧光检测器的功能、工作原理和操作规则。1.1 荧光原理在某些分子吸收特定波长的光从而越升到更高的能量状态时，会产生荧光现象。当返回正常能量状态时，“激发”的分子会以光子形式释放所吸收的能量。许多有机化合物吸收光，但很少会发出荧光。集成了荧光检测功能的 HPLC 系统可有效识别多环芳烃化合物、碳氢化合物、氨基甲酸盐杀虫剂、黄曲霉毒素、维生素、氨基酸等。化学衍生法还将荧光检测扩展到某些非荧光化合物。荧光色谱（用于检测样品的荧光信号）极为灵敏。低样品浓度不会对荧光分析的有效性造成不良影响。这不同于吸附色谱法，样品浓度较低时吸附色谱法容易失败，因为吸附色谱法的结果取决于溶解样品和其流动相所吸收的光之间的差异。不同的化合物分子受到相同能量作用时发出荧光级别不同。荧光检测监控分子的激发和发散波长，这样仪器即可获得较高的选择性。不过，如下一些条件可能会干扰化合物发出荧光的能力，从而降低性能：pH 值变化值变化 质子的得失及随之产生的电荷的增减会影响分析物的结构，并可能增强或减弱荧光。温度变化温度变化 处于较高能量状态中的分子不如处于较低能量状态的分子那样易于吸收光并再发散质子。因此，荧光将随样品温度升高而减少。虽然提高温度可降低粘度（增强分离效率），但却会减弱荧光响应。溶解气体的量的变化溶解气体的量的变化 脱气效率的降低会减弱分析物的荧光响应。荧光检测器还可用来测量化学发光，此时未受到任何激发能量作用的分子会发出低强度信号。通过禁用光源（如使用本检测器时）或启用光闸以阻止任何激发光到达流动池，可对此类检测进行调节。溶液中的分子会散射光。有许多散射的示例，包括瑞利和拉曼类型。在瑞利散射中，吸收和发散的质子的波长相同。强度与波长的四次方成反比，因此 UV 波长散射能力比可见光强。当激发波长与发散波长极为接近（相差不到 50 nm）时便会发生散射。单个分子就象镜子一样，散射入射光而不是将其吸收。拉曼散射涉及到对产生振动激发的质子的吸收。2工作原理较长波长会发生发散或散射，且发散/散射始终以恒定的能量差（入射激发波长能量的两倍）变化。因此，较长波长的可见光激发会使发散波长产生的拉曼位移比 UV 光的更大。荧光检测的过程涉及多个组件和过程：激发源 过滤源光 使用过滤光激发样品 收集和过滤发散的荧光 测量发散的荧光 放大发散信号1.2 荧光检测1.2.1 概述扫描荧光检测器通过窄带高强光照射样品。然后检测器测量样品所发散的较低级别的荧光。发散光经过滤、放大，然后转换为可记录和分析的电子信号。1.2.2 激发源用于荧光检测的能量源通常是，可提供范围在 UV 和可见光内、高强度、光谱稳定的灯。所产生的荧光强度与激发光谱的强度有直接关系。因而，高灵敏度的检测器使用可用的最强的激发源。1.2.3 光源类型常见的激发光源包括：蒸气灯蒸气灯-汞、镉或锌 弧光灯弧光灯-氙蒸气灯可提供 UV 和可见光范围内的高强度、窄波段输出，而弧光灯则可提供强度较低、范围较宽的光谱。在弧光灯中，氙弧灯提供范围最宽的光谱，因此对于通用的荧光检测器，可选其作为激发光源。荧光检测31.2.4 源强度过滤所选的激发波长需要进行某种形式的过滤。现代检测器中通常使用以下两种通用过滤源光的方法：滤光器 单色器滤光器滤光器通常并不昂贵而且易于使用。滤光器具有较广的波长范围，但其对被测物的选择性不如单色器。带通过滤器允许其中心波长附近的一定范围内的波长通过。短波长截止过滤器传输波长短于额定值的光，而长波长截止过滤器则传输波长长于额定值的光。过滤器的额定值定义为出现 50%峰传输时的波长。该值固定不变。要更改激发波长和发散波长，必须更换滤光器。单色器单色器是可进行调整以在较广范围的光谱上选择波长的设备。光栅单色器使用只有波长很小或带宽很小的波长通过的衍射光栅。通过移动光栅，可选择所需波长范围内的波长。相比过滤器而言，光栅具有以下优点：可选波长范围更为广泛 波长带通更小（具有更强的选择性）光谱扫描 易于自动化光栅单色器还可通过所选波长的碎片或级数。例如，如果单色器设置为通过 600 nm 的光能，则它还将通过 300 nm 次级波长的能量。长通过滤器可用来吸收单色器所产生的更高级的能量。同通过单色器选择激发一样，也可通过单色器选择发散（辐射能）。这样便可精确选择发散波长。具有激发和发散单色器的检测器可通过保持其中一个单色器为恒定设置，同时变化另一单色器上的设置执行扫描。当评估混合物或分析物质的化学结构时，需要进行此类操作。1.2.5 激发样品灯所发出的宽带高强光可通过过滤器或单色器，这样便选择了波长中较窄的波段。将窄带宽的光定向到流动池，当其通过时，便会在其中激发分析物。激发波长通常与分析物的吸收波长对应。4工作原理1.2.6 流动池石英流动池使可能影响测量的漫射光的量降至最低程度，并使荧光信号最大化。将样品室进行布置，以便以垂直于激发（灯）光束的角度收集荧光能量。这使 Raleigh 散射对背景光级的影响降至最低。流动池实质是一个激发和发散强度的过滤器。荧光检测器中流动池的正确定位至关重要。1.3 测量荧光要测量流动池中的荧光，检测器必须在高选择性（以区分特定荧光波长）需求与高灵敏度（以测量低荧光强度）需求间加以平衡。1.3.1 发散单色器发散单色器（而非滤光器）提供了平衡灵敏度与选择性的最佳解决方案。单色器提供较窄的带通以提高选择性和灵敏度，通过优化到达光电倍增管的发散信号可提高选择性和灵敏度。通过限制其间的光学元件，可将发散信号损失降至最低。1.3.2 光电倍增管(PMT)荧光强度通常很低，尤其在处理较低级别的分析物时。PMT 将荧光能转换为电流并放大低级荧光信号。注意：注意：PMT 的非线特性常会造成检测器的可变性。1.3.3 扫描配备有激发和发散单色器的检测器可轻易扫描某个范围的激发或发散波长。更改波长涉及更改单色器设置。扫描过程中，一个单色器上的设置保持不变，而另一个单色器扫描某个波长范围。1.3.4 多通道操作配备有激发和发散单色器的检测器可改变激发和发散设置的波长。在多通道操作中，两个单色器可在所选的波长对之间迅速移动以生成多条色谱迹线。然后多个输出便可从单个分离中衍生其它信息。测量荧光51.3.5 荧光数据检测器以荧光强度单位报告其数据。但是，该检测器还使用归一化单位报告强度。这弥补了单个检测器之间的可变性，并弥补了由于老化引起的灯强度降低。使用归一化单位时，增益中的更改将提高信噪比，而不会改变峰响应。此独特的属性使荧光信号测量在不同工作台上的再现性更强。1.3.6 参考文献有关荧光检测的其它信息，请参阅以下文献：N.Ichinose、G.Schwedt、F.M.Schnepel 和 K.Adachi，Fluorometric Analysis in Biomedical Chemistry，第 5 章，Wiley-Interscience：纽约，1991。Detectors for Liquid Chromatography，E.S.Yeung，ed.，第 5 章，Wiley：纽约，1986。W.R.Seitz，Treatise on Analytical Chemistry，第 2 版，P.J.Elving、E.J.Meehan、Kolthoff，Eds.，第 I 部分，第 7 卷，第 4 章，Wiley：纽约，1981。J.R.Lakowicz，Principles of Fluorescence Spectroscopy，Plenum：纽约，1983。S.G.Schulman，Fluorescence and Phosphorescence Spectroscopy：Physicochemical Principles and Practice，Pergamon Press：纽约，1977。J.D.Winefordner、S.G.Schulman 和 T.C.OHaver，Luminescence Spectroscopy in Analytical Chemistry，Wiley-Interscience：纽约，1972。6工作原理1.4 检测器说明本检测器（图 1-1）为多通道、可调式荧光检测器，针对高性能液相色谱仪(HPLC)应用而设计。图 1-1 Waters 2475 多通道荧光检测器1.4.1 独立和远程功能该检测器可作为独立的装置（与图表记录器或积分器配合）进行操作，或作为 Waters 色谱系统的组成部分进行操作。有两种远程接口方法可用。一种是以太网连接，通过该连接可以使用仪器控制软件(ICS)。ICS 包括专门为 2475 检测器开发的方法编辑器和样品管理功能。该接口允许多通道控制，支持多达四个波长对通道，还支持“快速扫描”模式，该模式可提供实时三维光谱数据。第二种接口是在 RS-232 上的串行连接，它允许 2475 检测器使用为 474 检测器所开发的方法开发和样品管理软件组件模拟 474 检测器。该接口允许将系统中的 2475 与为 474 检测器开发的方法一起使用。注意：注意：该检测器仅能通过 Empower 系统或 Millennium32 工作站（仅限于 Windows NT 平台上配置的版本 3.2、版本 4.0 或更高版本）进行控制。它可以模拟 Waters 474 荧光检测器（即仅作为单通道检测器）的功能。要选择 474 仿真模式，请按下检测器小键盘上的 Shift 键、CONFIGURE（配置）键打开 2475 Configure（2475 配置）页面，然后选择 474 Emulation（474 仿真）。注意：注意：当已安装了具有仪器支持服务包 2(ISSP 2)的 Empower build 1154 和 2475 仪器控制软件(ICS)时，可通过 Ethernet 通信控制检测器。?开/关开关检测器说明71.4.2 功能该检测器的操作范围为 200 到 900 nm。它采用新设计的带有增强照明系统的光学组件来提高性能。这些设计上的特点提高了光通量和灵敏度。这就导致了信噪比的整体提高。注意：注意：该检测器与 Empower 系统和 Millennium32 色谱工作站版本 3.2 或 4.0 兼容。当选中 474 Emulation（474 仿真）配置框时该检测器可以模拟 474 检测器的功能。独立可编程性独立可编程性-存储了多达 10 个用户定义程序（或方法），每个由多达 48 个可编程定时事件和 2 个可编程开关组成。单通道或多通道模式单通道或多通道模式-监视一个或多个离散波长对的荧光。积分铒校正参比积分铒校正参比-确保波长准确性。自动次级滤光器自动次级滤光器-自动处理 400 nm 和更长的波长，并删除 399 nm 或更短的波长。光谱扫描和存储光谱扫描和存储-除标准的可调荧光功能外，还支持光谱扫描、显示、扣除、存储和重放。全面诊断功能全面诊断功能-支持内置诊断工具以优化功能和性能。数据通信和控制数据通信和控制-用于 Empower 系统或 Millennium32 色谱工作站（版本 3.2 或 4.0）。向后兼容性向后兼容性-使用 RS-232 串行通信时，可以作为 474 检测器与 Empower 系统或 Millennium32 色谱工作站版本 3.2 或 4.0 配合操作。两个可编程接线端子输出两个可编程接线端子输出-具有两个可配置开关，每个开关的最大调节量为+30 V 和 1 A。开关（SW1 和 SW2）可触发碎片收集器和其它外部设备。时间和荧光可启动这些开关。归一化发散单位归一化发散单位-检测器提供归一化为标准水拉曼参比的测得荧光信号。因此，任何特定荧光峰的高度在不同检测器间都更加一致，而且独立于增益设置。空闲模式空闲模式-当检测器不进行测量时，会关闭光闸以防高强度氙激发光源导致光学组件老化。快速扫描模式快速扫描模式-通过可选的波长范围动态扫描发散或激发光栅以监视一系列波长的荧光。（此功能仅在 Empower 系统中，通过远程以太网接口使用 2475 ICS 软件控制时可用。）8工作原理1.5 工作原理要有效地使用检测器，应熟悉检测器的光学和电子设计以及工作原理和操作原则。光学 波长检验和测试 流动池 电子设备1.5.1 检测器光学组件光学组件基于一对可调单色器，其中包括以下零件：氙弧灯 两个椭球面镜和一个抛物面镜 光闸，波长校正过滤器和次级滤光器 入口狭缝 定向、平面和凹面全息衍射光栅 光电倍增管(PMT)Waters 轴向点亮流动池图 1-2 和图 1-3 显示了光学装置的光路和组件图。图 1-2 激发单色器光学组件氙气灯滤光器轮光栅狭缝抛物面镜流动池椭球镜工作原理9图 1-3 发散单色器光学组件1.5.2 光学组件光路该检测器采用了多种独特的设计元素，因此性能比其它标准荧光检测器更为出色。其新颖的流动池设计使漫射背景光降至最低，并提高了低级信号的检测能力。保持光学组件简单化有利于将信号丢失降至最低并使通量达到最高。光源此检测器使用高强度的 150 瓦氙弧灯作为其光源。发散光穿过激发单色器泛光照射流动池的孔。灯光经灯后的椭圆反射镜收集，其曲率中心面向灯的亮点。激发单色器检测器使用单色器选择按其几何所定义的适当的激发波长。光栅可快速旋转，从而响应多个激发波长和/或进行扫描。发散单色器样品所发散的光从流动池的顶部传播到发散光学组件。发散光学组件以垂直于激发源的角度进行定位。这样可使漫射光到达 PMT 的可能性降至最低。发散单色器将选择适当的发散波长。光电倍增管发散光学组件入口狭缝椭球镜流动池出口遮罩流动池光栅10工作原理轴向点亮流动池流动池设计包含轴向点亮、熔凝石英流动池（图 1-4）。图 1-4 轴向点亮流动池轴向点亮可以使路径长度更长。轴向池的灵敏度比传统的荧光检测流动池设计更高。因为荧光信号与样品所吸收的光量成正比，所以与传统荧光检测器相比，轴向流动池设计具有极为出色的灵敏度。激发能量在几何形状相匹配的镜面（其形状与激发能量入口透镜的形状相反）上聚焦。激发能量沿流动池轴反射并返回，有效地加倍了流动池的路径长度。1.5.3 光电倍增管(PMT)校正检测器的全刻度灵敏度由增益设置来控制，通过增加供给 PMT 的电压值以放大和增加响应值。通过控制供给 PMT 的高电压可获得此增益。但是，PMT 响应并非线性，因此每个检测器都必须单独进行校正以确定每个增益值所需的电压设置。在组装和对齐检测器后，并在每次更换 PMT 或任何 PC 板时，Waters 人员都会使用内建的服务诊断装置校正 PMT。1.5.4 PMT 灵敏度校正 PMT 后，在色谱进样前，为光电倍增管在仪器方法内选择增益设置是对使用 PMT 的检测器进行荧光管理的必需部分。但是，因为 2475 检测器的灵敏度比其先前设备有很大提高，或与其它商用的荧光检测器相比，即使 PMT 增益设置为最低级别(1)，也可能发生饱和。当样品浓度很高或试验用流动相背景较高时，这种情况常会发生。因此，2475 多通道荧光检测器具有 PMT 灵敏度诊断功能（第 5.3.11 节），该诊断使用户可调整增益的粒度。如果增益设置过高，前置放大器将过载，并出现饱和。值-9999.9 出现在 Emission/Energy（发散/能量）单位字段中，色谱中出现负向下降，从而提醒您该状态。发散能量石英窗反射镜反射镜液体输出液体输入激发能量透镜工作原理111.5.5 信号处理和噪音计算电源波动可能导致荧光检测器输出中有噪音。这可能是高信号级别的主要噪音源。因此，追踪灯光波动的参考信号可以修正样品(PMT)信号。1.5.6 过滤噪音该检测器提供了两种过滤器可使噪音降至最低：海明滤波器海明滤波器-默认的过滤器是海明滤波器，一种数字有限脉冲响应过滤器，可创建与 RC 过滤器等量的峰高老化，但可增强对高频噪音的过滤。RC（电阻（电阻-电容）过滤器电容）过滤器-RC 过滤器是无限脉冲响应过滤器，其等效于一级、低通、电阻-电容过滤器。过滤器行为取决于所选择的时间常数。过滤器时间常数调整过滤器响应，以获得最佳的信噪比。较低时间常数设置将产生以下影响：去除较少的基线噪音 产生的窄峰在失真和延时方面都达到最小 使非常小的峰与基线噪音难以区别较高的时间常数设置将产生以下影响：大大减少基线噪音 缩短并增宽峰海明模式中，缺省时间常数 1.5 秒可满足大多数应用的要求。要计算特定条件下适合的时间（过滤器）常数，请使用公式：TC=0.2 PW其中TC=时间常数（过滤器）设置PW=最窄峰半高处的峰宽12工作原理图 1-5 显示了增加的时间常数和响应时间之间的关系。图 1-5 时间常数（过滤器设置）比较注意：注意：尽管峰形会显示失真，各种时间常数会延迟信号输出，但峰面积仍保持不变。1.5.7 电子设备电子设备控制以下部件：前置放大器板前置放大器板-收集并处理从 PMT 和光电二极管到微处理器的模拟输入信号以进一步进行信号波形加工。样品信号和参考信号被积分并同时进行 A/D 转换。这确保了最大程度地舍弃两个光束中的共模噪音，从而得到静音基线。控制板控制板-接收来自前置放大器板、键盘和外部事件的输入信号。同样提供了对定位子系统和灯光电源的光学组件的控制。CPU 板板-包含数字信号处理器、通信端口、非易失性 RAM（有备用电池）和驻留固件的闪存 RAM 空间。RS-232 串行通信接口串行通信接口-RS-232 通信使检测器可与 Waters Empower 系统或 Millennium32 色谱工作站（版本 3.2 或更新版本）进行通信。以太网通信接口以太网通信接口-使该检测器能与 Empower 软件进行通信。小键盘小键盘-允许访问控制系统、编程方法、校正以及排除该检测器的故障。灯电源灯电源-由 CPU 控制以提供稳定的氙灯操作。DC 电源电源-为模拟和数字电路供电。检测器采用 DC 电源。0.2 秒1.0 秒2.0 秒吸光度时间工作原理131.5.8 波长检验和测试氙弧灯和积分铒过滤器列出了已知波长的传输光谱中的峰。启动时，检测器将等待 5 分钟以使氙灯加热并稳定。该检测器通过将这些峰位置与内存中存储的校正数据进行对比来校验校正。如果校验结果与存储的校正相差大于 2.0 nm，则检测器将显示波长校验失败信息。检测器将进行校验（而非重新校正）以避免流动池含有残料时可能发生的错误。校正需要清洁的流动池和透明的流动相。注意：注意：检测器的组合波长准确度规格为 3.0 nm，而每个光栅的波长准确度控制为 2.0 nm。可随时启动手动波长校正（请参阅第 3.4.6 节）。手动校正将用新数据替换以前的校正数据。校验和校正算法实质上是相同的。不过，校验算法可能会发出错误信息，指示实际数据与存储的数据不相匹配。检测器连续运行时，应通过将其关闭，然后再打开的方式，每周对其执行波长校验。校验测试需要将灯预热 5 分钟以使灯稳定。检测器校验过程中，会进行以下操作：1.检测器使用激发和发散光栅原位传感器找到原位。2.在正向和反向中可找到每种光栅的零级峰位置。3.将积分铒过滤器移至流动池入口狭缝前的公共光路径中，以使检测器确定其它两种波长为 379.0 nm 和 521.5 nm 的光谱特征。4.通过扫描每个吸收波段从而确定更准确的位置，将光栅恰好定位在预期的步进位置之前。5.当使用 PMT 采集能量数据时，检测器可通过将光栅阶跃至这两个校正点中每个的预期阶跃范围内，查找校正点。该技术使由光栅/步进电机子系统相对粗糙的一步解决方式所引入的任何错误和伪数据降至最低。通过激发 0 级光栅使发散光栅回原位激发光栅回原位并建立波长到步长关系后，发散光栅会以类似的方式回原位。1.激发光栅置于零级(0 nm)，从而将所有光反射到流动池中。2.铒过滤器置于激发光束路径中，从而将铒光谱引入流动池中。来自铒光谱的散射光在流动池中很充足，足够由发散光栅引向 PMT。3.然后可能会以对激发光栅相同的方式旋转发散光栅从而查找 379 nm 和 521.5 nm 处的峰。4.记录这些参比点后，同样的校正过程可准确定位操作中发散光栅的位置。14工作原理使滤光器回原位波长校验过程使用光栅原位传感器确立大概的位置。通过打开灯并充分预热建立原位后，激发光栅