Waters色谱柱故障排查指南.pdf

沃特世 HPLC 故障排查指南目 录变化的保留时间.1飘移的保留时间.2峰拖尾的原因.3不同批次色谱柱之间的重现性.5色谱柱寿命.7样品前处理的问题.8常见色谱问题及沃特世色谱柱产品解决方案.101变化的保留时间Q：我的色谱峰保留时间不稳定，会是什么问题？A：首先需要找出变化的模式，它会告诉我们很多潜在的原因。如果保留时间从这次进样到下次进样随机变化，我会首先检查泵和溶剂混合装置。为了校验泵是否工作正常，可以用量筒和秒表来测量流速。为了校验流动相组成没有变化，可以在流动相中加入跟踪剂来观察基线的变化。如果流动相组成是稳定的，基线也该很稳定。如果流动相组成有变化，你会观察到基线的相应变化。举例说明，如果你使用反相条件，UV检测器，可以在有机相溶剂中加入0.1%的丙酮，监测 254nm 下的基线变化。另一种方法也可以，你需要人工配制流动相，然后通过溶剂混合装置。如果保留时间的变化消失了，问题就出在溶剂混合装置上。Q：一天之内的进样保留时间一致，但是不同天数之间的保留时间会变化。A：这种情况下，仪器本身不太可能有问题。保留时间变化最有可能的原因是流动相组成的变化。在反相色谱中，保留因子 k 和流动相中有机溶剂的体积含量成指数关系。根据经验，如果有机溶剂含量误差 1%，那么保留时间的变化在 5%到 15%之间，典型情况在 10%左右。这意味着你必须仔细称量有机溶剂，最好的配制流动相方法是用质量称量代替体积称量。此外，流动相如何脱气也可能导致保留时间的变化。最好的脱气方法是使用真空超声脱气大约一分钟左右，这会最大程度的减少溶剂蒸汽的挥发。另一个方法是用氦气流喷射，在流动相被氦气平衡后，氦气流必须被关闭，否则氦气会带走溶剂蒸汽，溶剂的组成会由于蒸发而发生变化。如果你的样品组成是离子状态或者离子化的，那么控制流动相的 pH 值是非常重要的。小到 0.1 单位的 pH变化会导致保留时间漂移 10%左右。所以准确测量pH 值并保证 pH 仪被很好地的校准。在反相色谱中，随着流动相 pH 值的升高，酸保留时间会减少，碱的保留时间会增加。顺便提一下，化学老师常说“缓冲溶液之所以被称为缓冲溶液，因为它是用来缓冲 pH 值的。如果它做不到，那就不能称之为缓冲溶液”。举个例子，醋酸铵溶液只是醋酸铵溶液，醋酸缓冲液包括醋酸根离子和醋酸，如果它们的当量相同，此时的 pH 值就是醋酸缓冲溶液的 pK 值 4.75。缓冲溶液在它的 pK 值上有最大的缓冲能力。Q：我没有认识到要得到重现性好的实验结果竟然还要如此精确的控制流动相组成，有没有其它需要注意的？A：另一个重要因素是温度。如果所有色谱峰的保留时间都朝同一个方向漂移，那么你可以怀疑是温度原因所致。根据经验，每的变化导致保留时间变化大约 1%到 2%左右。在通常情况下没有什么问题，但是在许多地方空调和暖气在周末的时候会关闭，然后你会疑惑为什么样品在周末的保留时间会和平时不一样。使用柱温箱可以很好的避免这个问题。在反相色谱中，如果分析离子或离子化的样品，保留时间会受到缓冲溶液的离子强度的影响，但是影响会很小，通常可以忽略不计。典型的状况是缓冲液的摩尔数改变 20%，保留时间变化约 1%。由于缓冲液组分通常是称量的，那么大的误差是不会发生的。Q：有没一些特殊的情况需要考虑一些其它的参数？A：是的，在离子对色谱中，离子对试剂的浓度会影响离子化样品的保留。与离子对试剂电荷相反的分析物保留时间会增加，相同电荷的保留时间减少，中性化合物基本不受影响。在低浓度下，例如小于 5mM/L，样品组分保留时间的变化受与离子对试剂浓度影响，与离子对试剂的浓度成正比。在高浓度离子对试剂下，例如 10mM/L 左右，填料表面被离子对试剂饱和，那么试剂浓度的改变不会对样品保留时间有明显的影响。这是在方法开发时需要考虑的问题。如果你需要把方法做到不受任一个变量的影响，那就应该那么做。在正相色谱中，保留时间对流动相中极性组分的浓度非常敏感。这个组分无论是你需要还是不需要的，通常是指水。水含量的变化会导致保留时间的变化，比较好的解决办法是使用半饱和的非极性溶剂，例如正己烷或二氯甲烷。为了达到半饱和状态，通常需要往一定体积的溶剂中加一些水，搅拌一段时间使其饱和，然后把它和等体积的“干燥”溶剂混合。通过这个过程，理论上能让你在使用含水非极性溶剂时得到比较好的重现性，避免保留时间的漂移，这个在以后的章节会讨论到。2飘移的保留时间Q：我的色谱峰保留时间在漂移，这是什么问题？A：这是一个有趣的问题，可能有很多不同的原因，让我们一个一个来看。大多数人通常认为保留时间的漂移是平衡问题。如果你在使用未修饰的硅胶柱做正相色谱，那么这是最可能发生的问题。正相色谱的保留时间容易受到硅胶表面吸附的水含量的影响，结果使得水在流动相中溶解度低。因为水在正己烷或二氯甲烷等试剂中的溶解度非常低，所以色谱柱平衡需要很长时间。我曾见过使用非常干燥的正己烷平衡一星期后保留时间仍然漂移的情况，所以建议避免使用非常干燥的试剂。通常解决硅胶和水的平衡问题的办法就是使用与水“半饱和”的试剂。制备方法是把一定体积的疏水试剂用水饱和后，再与相同体积的“干燥”试剂混合。这个方法可以极大的加快平衡时间。在反相色谱中，平衡通常会很快。几个（5-10）柱体积的流动相通常就足够平衡了，但不全然如此。值得注意的一个例外就是在离子对色谱中，使用离子对试剂平衡色谱柱。典型的离子对试剂使用浓度在 2-5 个mmol/L 或者更少，它们吸附在反相色谱柱填料表面，表面浓度在 0.5-2mol/m2。1 根 2504.6mm 的色谱柱有大约 3g 填料，表面积约为 330 m2/g，这意味着一根色谱柱有大约 1000 m2的表面积，当表面平衡浓度为 2mol/m2，需要 2mmol 的离子对试剂进行完全的柱平衡。当流动相浓度为 2mmol/L 时,需要 1L 的流动相进行平衡。这虽然是极端状况，但如果用几百毫升的流动相去平衡色谱柱也不必大惊小怪。因此在离子对色谱中将离子对试剂转换为有机溶剂来过夜保存色谱柱是不明智的，因为离子对试剂被清除后，第二天你又要花很长时间去平衡。Q：所有这些现象都有共同的因素：流动相含有低浓度的强吸附试剂。这是保留时间漂移最常见的原因么？A：我想就是那样的，其它的现象不多见。但是强吸附剂也可能源于样品。这种情况下它们在重复进样中会慢慢累积，从而改变色谱柱的化学性质。举个例子，药品中的赋形剂。我们可以通过观察保留时间变化的速率来得知杂质是从流动相中引入还是从样品中引入。实验如下：1.进样几次，例如，4 次一共 1 小时进样。2.走相同量的流动相，不进样。3.重复第一步4.做一个关系图，保留时间 a.对时间的关系 b.对进样次数的关系如果第一个图得到一条平滑的曲线，那么流动相是引入杂质的原因。如果第二个图得到一条平滑的曲线，那么杂质的来源是样品。Q：还有其它保留时间漂移的原因么？A：是的，还可能是由于流动相的组成随着时间改变导致保留时间漂移。如果你没有使用仪器的在线混合装置，那么流动相的组分可能在缓慢的蒸发。当使用氦气流喷射排气泡时，通常会有这种情况发生，所以必须将喷射的速率控制到最小。此外，一个经常被忽视的原因就是键合相的水解。制造商通常会指定一个 pH 范围，超出范围可能导致键合相“不稳定”。这个范围通常是 pH2-8 或 9。然而，人们会有很多原因不得不接近这个极限。然而它并没有一个明显的分界线，因为水解还取决于其他因素如温度或有机溶剂，因而缓慢的水解也可能发生在这个极限范围内。3要保持固定相的水解稳定性，最好是在中性pH值（通常在 pH 35 左右）和低的温度。等度条件优于梯度条件。在等度条件下发生水解的过程中，键合相通常会自我吸附，并达成一种区域平衡。然而，在使用高浓度的有机溶剂时，例如在梯度洗脱或者冲洗色谱柱的过程中，这种平衡被打破，键合相会被冲洗出色谱柱。Q：我会记住这些的。温度变化也会导致保留时间漂移么？A：是的，温度通常会被怀疑。如果你的样品是自动分析过夜或者过了周末的，那么你得到的保留时间漂移的结果可能和实验室温度变化有关。在许多地方，为了节能，室温的设置在晚上或者周末通常是不一样的。通常来讲，1的变化导致保留时间漂移大约 1%到 2%。这个可以联系最后一个导致保留时间漂移的原因色谱柱返压的增加。增加的返压表明色谱柱被污染，但是仅仅是堵塞的塞板就足以导致保留时间的漂移。为了使流动相通过筛板，需要额外的压力来促使流动相通过筛板，这会使得流动相在摩擦过程中受热，从而导致保留时间的漂移。此外还有其他的一些原因，但是极少发生。在反相色谱上发生平衡很慢的现象是由于流动相中有机溶剂比例太少。高键合覆盖率、“完全封端”的C18 没有被流动相良好的“湿润”。这会导致一些现象，源于流动相和固定相没有很好的接触，造成的“疏水塌陷”，“疏水塌陷”这是由于键合相卷曲，固定相之间的相互吸附，从而导致固定相可用于和样品相互作用的表面积的减少。这时候立即用一定量柱体积的有机溶剂冲洗可以使色谱柱再生，最好是在你的流动相中加入有机调节剂。这类现象在所有没有被封端的固定相上很少发生，甚至不会遇到。峰拖尾的原因Q：我能做些什么来避免峰形拖尾？A：首先我们要找出峰形拖尾的原因。峰形拖尾有这么几种原因，包括色谱柱问题、化学原因，还有仪器的问题。最通常的峰拖尾原因是额外柱展宽，柱床的损坏，分析物和填料上活性位点的相互作用，显然必须根据拖尾的原因才能去做针对性的工作。Q：我明白，现在该怎样判断拖尾的原因？A：最快的方法就是仔细观察你的色谱图。色谱图能给你很多关于问题原因的信息，而且不需要知道样品和色谱条件。然后你利用一些其他的信息来证实由色谱图得到的信息得到的推断。最先要观察的就是峰高。如果是用 UV 检测器，峰高在 1AUFS 的数量级上，那么可能是由于过载造成的峰形拖尾。判断假设化合物的消光系数是在 1000 的数量级上，一个很合理的经验法则。为了确定质量过载，你需要知道色谱柱上的样品量是多少。通常，孔径在 100 左右的多孔填料，上样量约为 100ug 时会出现过载导致的扭曲峰形。这些虽然都是经验法则，但是它们可作为判断样品过载合理指导方法。你可以进1/10的量来测试过载，看峰形是否有所改变。4Q：好的，但是如果进少量样品时就发生拖尾该怎么办？A：再重复一次，观察色谱图上的峰会很有帮助。如果图上有很多峰，观察峰形是否大致不变，或者有相同情况的改变。如果保留时间短的峰拖尾要比保留时间长的峰拖尾严重，那么可能是色谱柱死体积的原因。柱死体积影响会随着峰形变宽而减小，也就是它对先出的峰的影响比后出的峰的影响更大。两种死体积的情况需要被考虑到：1额外的柱展宽效应2检测器的时间常数管路、进样器和检测器的扩散展宽会导致色谱图上先出的峰拖尾。如果你把细内径的色谱柱用在一台常规分析仪器上，或者你最近重新连接过系统，你就有可能会遇到这种情况。如果是后一种情况，那么检查你所使用的管路（从进样器到检测器的管路内径应该是9/1000”），同时检查所有的接口，看它们是否完好。通常接口扩散的主要原因是不同的色谱柱制造商使用不同的接口深度。对于接口扩散有一个偏离标准，仅仅 15uL 偏差在 5u 的色谱柱上流经 3mL 体积的流动相就能明显影响到色谱峰形。较大的检测器时间常数也会有相同影响。出峰较早的拖尾会比出峰晚的拖尾更明显。通常，默认的时间常数设定是 1 秒。如果使用一根 5m 高性能的色谱柱，可以看到色谱峰会拖尾延长（由 2min 延至 3min）。更大的时间常数能看到更为明显的影响。如果色谱图中所有化合物的峰形都出现十分明显且相同程度的拖尾，可能是由于以下两种原因：1.柱床损坏；2.所有样品组成具有相同的化学性质，我们将处理这种化学影响。第一种情况，按照标准条件，特别是根据厂商推荐的条件进行理论塔板数测试，可以判断色谱柱是否损坏。色谱柱可能是由于吸附了脏杂质或颗粒而被破坏。有时，可以通过一些合适的溶剂（如用于反相色谱柱的四氢呋喃）来去除这些脏的杂质，但如果是柱床本身变化，就没有其他办法可以修复柱子了。如果是所有色谱峰化学性质相似，那么化学效应可能是造成拖尾的潜在因素。如果仅仅是一些峰出现拖尾，而另一些峰具有良好峰形，化学效应是造成峰拖尾的主要原因。Q：这些“化学效应”指的是什么呢？能解释一下吗？A：通常有几种效应，但最常见的原因是分析物与不均匀的填料表面发生比较大的相互作用。典型的例子就是强碱性化合物在一些反相填料上发生拖尾。这类型的化合物能与填料表面残留的硅醇基及键合相发生了强的相互作用。如果残余的硅醇基在填料表面形成了非常不均匀的分布，就会导致拖尾。5不同批次色谱柱之间的重现性Q：我即将要开始一个新的HPLC方法开发。在认证过之后，方法会被转移到 QC 实验室，在那里这个方法可能要被使用很多年。我很关注方法重现性的问题，特别是色谱柱的重现性。那我怎么才能确保良好的重现性？A：首先，你能在开始工作之前想到方法开发的这个问题，那是值得赞扬的。如果预期到某个新方法会被使用很多年，那么重现性将是色谱柱选择过程中的一个重要问题。你需要确认在你的方法还在被使用的期间，色谱柱一直都有供应。这就意味着你需要选择一家大型的愿意长期合作的厂商。此外，你还要选择一种常见的固定相，例如 C18或者C8，尽量少选择特殊的或较少使用的固定相。换句话说，你在色谱柱的选择上需要谨慎。下一个需要考虑的问题就是色谱柱的重现性。如果你或你的同事对于使用过的某种色谱柱的重现性很有把握的话，那么可以从它开始。你还应该考虑从厂商处获得有用的信息。最近一些色谱柱厂商开始发布它们的色谱柱规格和批次重现性的调查。你可以从厂商那里得到相关信息，然后评判。Q：我能在这些信息中了解到什么？A：那么我来解释一下色谱柱和批次重现性的不同方面。下面我会讲到反相的填料，尽管它们是最常用的。如果你看同一批次填料生产出的不同的色谱柱时，你会发现它们的塔板数（峰宽），返压，保留时间会有所不同。保留时间的改变与填料密度和色谱柱的体积成比例，后者的重现性主要取决于色谱柱的内径。这种改变对你的方法是有利的，虽然所有色谱峰的保留时间都会相应的改变，分离度会保持不变。然而，你需要意识到这点，来正确的规定你的方法的洗脱时间表。由于这种效应造成的保留时间的改变通常在3%RSD，如果厂商在色谱柱硬件上控制较好的话也可以减小到 1%RSD 左右。色谱柱塔板数的变化也会影响到你的方法，特别是涉及到刚好能基线分离的一对色谱峰时。典型的塔板数Q：如何消除因化学影响造成的拖尾呢？A：首先，你应该考虑选择一款不会出现这种现象的色谱柱。一些新的反相填料就是专为碱性化合物的拖尾最小化而设计的。其次，这种拖尾现象能被控制，通过调节流动相的pH 值或者在流动相中使用碱性有机溶剂来竞争化合物的活化位点。这是因为硅醇基作用通常是离子交换。在酸性条件下，很少的硅醇基带负电，所以可以观察到带正电的分析物拖尾现象会减弱。三乙胺经常会作为竞争性碱使用。然而，在这些竞争性碱中，疏水性更大的物质通常效果会更好，如：辛胺，四丁基盐。有一种情况残余硅醇基与分析物之间的相互作用并不是离子交换作用，而是氢键作用，你可以改变氢键作用的溶剂来改善峰形。如：甲醇与乙腈相比，更能改善峰形，可作为流动相中有机溶剂添加剂。类似的情况在正相色谱中也会遇到，可以用相似的原由来减少拖尾。通过改变醇类或乙腈作为流动相中极性的添加剂可以观察到拖尾现象的显著变化。峰形拖尾也会因其它一些原因造成，但相对较少。样品组份堵住色谱柱筛板或者进样器部件也会造成拖尾。还可能是分析物在色谱分析的过程中出现了化学改变，这种情况可能是化合物发生降解或者是被分析物不同的分子形式之间的缓慢平衡。6重现性在+/-10%左右，尽管现在标准偏差已经减小至 2-3%。记住塔板数是一个平方数，分离度只取决于塔板数的 2 次方根。因此塔板数改变 2%意味着峰宽的变化只有 1左右。你应该核查色谱柱生产商是否有塔板数的上限和下限的数据，或者仅一个下限数据，最好是两种数据都有。色谱柱的返压在任何填料的生产过程中重现性都比较好。一个批次的填料的返压改变应该在+/-5%左右。Q：那么不同批次之间的重现性问题呢？A：如果你在寻找不同批次填料之间色谱参数的重现性问题，那么上面所提到的参数会改变。但更重要的是，不同批次的填料的分离选择性会有所变化。这就意味着色谱峰的相对保留时间会变化，比如他们在色谱图上的相对位置。这会不利于你的方法确定。这种改变是你最需要避免的事情。因此你需要从生产商那里收集批次重现性是否稳定的信息。这个通常是测量一些填料的色谱性能和理化参数。在物理参数中，最重要的可能是填料的表面积，因为它的改变直接导致保留时间的改变。因此你需要确认生产商提供的填料表面积的变化程度是可以接受的。通常的范围是+/-10%，目前能控制在+/-5%。你需要确认的最重要的化学参数，是键合相的表面覆盖率的改变。这点通常表示为 umol/m2。许多生产商不会直接给出这个数据，但是会有填料的碳载量。我们需要确认的还是上限和下限和区间的范围。小于+/-10非常普遍，目前小于+/-4也已经能做到了。最后，你需要了解生产商测试色谱重现性所用的试剂。通常，色谱柱会附赠 1 瓶混合物标准品，像甲苯，萘和蒽。这不是一个较好的重现性的测试方法。中性疏水化合物之间的相对保留时间重现性一般都很好，而且对于填料表面覆盖率的改变很不敏感。较好的批次重现性测试是在测试混合物中加入碱性化合物。经优选的碱性化合物在优化过的条件下，主要和填料上的游离硅醇基相互作用，而中性化合物主要和键合相发生相互作用。这样，碱性化合物和中性化合物之间的相对保留时间是对反相填料批次重现性的严格测试。如果生产商是这样测试批次重现性，而且有比较小的参数改变范围，那么你的好感度会上升。Q：我不确定生产商如何进行测试对我测试化合物含量的影响，我怎么做才能确认我的实验会有较好的批次重现性?A：你说的非常正确，上面所提到的信息只是给你选择色谱柱，获得好的批次重现性的一个起点。最终测试则是对你的测试本身进行的重现性测试。一些生产商会有不同批次的填料的色谱柱包来用于这种测试。其它的生产商也会根据客户的需求提供类似的不同批次的色谱柱。你必须明白你拿到的是什么，来自同一批次的填料的不同批次的色谱柱是没有用的，你需要的是用不同键合反应生产出的填料装填的色谱柱。这里需要区分的是，生产商会认为用同一批次填料但是装的时间不是同一天的色谱柱是不同批次的。所以最好再三确认生产商是否真的提供给你所需要的东西。你大概需要用三根不同批次填料装填的色谱柱来测试你的方法的重现性。如果你的测试被证实不会受到填料批次变化的影响，那么你可以相信你的方法在几年内都是可以重现的。7Q：很好，可能就是这个问题，那我该怎么去解决呢？A：有几种方法可以避免这类情况发生。一种就是使用合适的样品前处理技术。使用化学性质类似的固相萃取柱做预分离能很好的解决这个问题。另一种比较有效的方法就是使用保护柱。当上述问题发生时，保护柱可以作为柱前端的替代品。如果想得到最好的分析结果，你应该使用和分析柱填料、装填技术完全相同的保护柱。如果使用不同品牌填料的保护柱，在分离能力和保护分析柱这两方面可能得不到最好效果。也不要使用更大粒径的保护柱，更大粒径或者装填较差的保护柱，由于它的峰展宽作用会导致分离能力下降。Q：使用保护柱听起来很好，还有其它的解决方法么？A：当然还有一些方法，但是它们都有缺点。我不赞成用溶剂“清洗”色谱柱，通常希望他们能把色谱柱前端的杂质溶解。在许多情况下，这个过程是不起作用的。例如，蛋白质杂质沉淀在色谱柱前端，当你试着去冲洗它们的时候，蛋白质可能会变性，甚至发生交联，导致它们再也不可能被溶解。此外，每次冲洗会带走水解的固定相，此时在发生水解的地方会有新的平衡，所以重复冲洗实际上会加速色谱柱的消耗。同时，在冲洗后必须要用流动相重新平衡色谱柱，有些情况下会是离子对色谱，那会消耗相当长的时间。其它常用的方法就是反向冲洗色谱柱。如果使用和流动相不同的溶剂反冲色谱柱，那效果会和上面提到的冲洗色谱柱一样。如果仅仅使用流动相冲洗，那你会消耗很长时间直到把杂质冲洗掉或许根本就没有作用。此外，反冲色谱柱会减弱柱床。尽管如今的色谱柱装填能足够承受反冲，我还是不建议把反冲作为标准的解决方法。色谱柱寿命Q：我的色谱柱只能进样100次，在那之后，峰形变宽，塔板数也很低，请问这是什么原因？A：100 次进样确实是寿命很短，通常情况下，色谱柱应该能用更长的时间。为了判断问题的原因，必须要确定第一，是否由于你的应用方法造成色谱柱寿命缩短两个基本的注意事项1.以前的色谱柱做这个方法是不是能持续更长的时间？2.所有做这个方法的色谱柱在使用了相同次数后都损坏了？如果是第一种情况，则必须确认方法是否完全一致。样品组成是否有变化？一些样品中强吸附的杂质会影响色谱柱的效果。仪器上的管路密封圈是否完好？掉落的密封圈会堵在色谱柱的筛板和填料层前端，这样会影响到样品的分布。如果你有理由确定色谱条件没有变化，那问题的原因就是填料床机械强度减弱造成的。包括在实验室使用中剧烈的震动（比如摔过？）或者是运输，或者是生产的缺陷。标准的色谱柱 QC 无法检测出这个缺陷，只有当色谱柱使用一段时间后才会显现出来。这种情况下色谱柱厂商会免费更换。Q：厂商能这样做挺好，但我的问题不是这样。我的色谱柱使用寿命一直很短，有时进样 100 次，有时进样 200 次。即使是进样200次，但只有100次的结果可以接受，这样造成的费用很昂贵，该怎么办？A：我完全赞同，我们要做的就是一起找出问题的原因，然后看看能不能做些什么。最有可能的情况是样品组分吸附在色谱柱前端。它们可能是由于在流动相中溶解度低而沉淀出来，或者是强吸附。当你进的样品越多，杂质会在色谱柱前端积累起来，从而阻止样品的正常吸附与分布，结果就是峰形变差，通常这类问题还会伴随着返压的升高。8Q：那你最好的建议就是使用保护柱了？A：完全正确。保护柱的花费并不昂贵，根据品牌和类型的不同价格在 10 到 50 美元之间，但它们保护的色谱柱的价格通常都是保护柱的 10 倍。此外，它们能保护色谱柱免受其它难以查明的杂质污染。举个例子，问题可能是流动相中带着的沙石或者是泵密封圈开裂后脱落的碎片，或者是流动相中的杂质被吸附。这些问题可能很难发觉，但是保护柱可以避免它们的发生。Q：有没有其它导致色谱柱寿命缩短的原因？A：是的，但如果你遵循厂商的使用建议，那些情况就不太可能发生。一种可能是流动相 pH 值超出了厂商建议的范围，导致色谱柱的塌陷。这种情况也可能是样品溶解在强酸或者强碱溶剂中造成。此外，对于一些特定色谱柱会有特殊情况。例如氨基柱会和醛、酮发生反应。当氨基柱处于未缓冲的水相溶剂中会产生强碱性，那样会导致局部硅胶溶解。色谱柱也可能由于走错溶剂而塌陷。色谱柱结构在理论上是很“松弛”的，颗粒彼此之间仅有部分是贴在一起的，当流动相经过时它们的连接会被打破，这样增加了柱床塌陷的机会。这种情况偶尔发生，例如氰基柱使用中等极性溶剂或者苯基柱使用 THF 的时候，这也是避免“冲洗”柱子的原因之一。样品前处理的问题Q：我在样品的前处理上遇到了一些问题。我使用反相吸附剂的 SPE。通常回收率不错，在 80左右或者更好。但是有时候只有 50甚至更差。那会是什么问题？A：你的这个问题是不寻常的。我发现大部分低回收率问题源于不好的方法开发。尽管 80的回收率已经能满足你的分析要求，但是就方法耐久性而言并不好。这很有可能是由于某一原因造成回收不完全，于是回收率有时候会损失 20，有时候会损失 50。我们需要做的就是一起找出这 20%-50%的损失在哪里。Q：好的，那么我们该怎么做？A：有四种可能性1被分析物在固相萃取前就已经丢失了2被分析物在吸附过程中没有被完全吸附3被分析物在冲洗过程中被部分冲洗掉了4部分被分析物在洗脱过程后仍残留在固相萃取柱上为了确认被分析物在第一根 SPE 柱的吸附过程中是否有穿透现象，你可以在吸附过程中在第一根 SPE 柱下面再放一根 SPE 柱，然后按照第一根 SPE 柱处理步骤处理第二根 SPE 柱。如果第二根 SPE 柱上收集得到的馏分中含有一定量的被分析物时，那么可以证明吸附过程是不完全的。这种情况的发生会有几种可能的原因。首先，溶解样品的溶剂是一种强洗脱溶剂。如果是这种情况，你可以用水来稀释你的样品，或者如果样品是离子化的，可以用缓冲盐。然后，你需要确认在上样前你已经活化了 SPE 柱。反相 SPE 柱需要用有机溶剂像甲醇，乙腈来活化，然后用水或者缓冲盐平衡，然后才能上样。许多人尝试跳过这些麻烦的步骤，但是这些对于方法的正确操作来讲那是完全必要的。9Q：我根据生产商的建议活化了 SPE 柱，所以我认为不是这个问题。我很想试一下用第二根 SPE 柱来确认测试吸附过程完整性的建议。对于方法中其他步骤的检查，我需要怎么做呢？A：检查冲洗步骤，你需要收集全部的馏分然后通过 HPLC进行分析。如果冲洗过程会把一些干扰被分析物定量的化合物除去，这就不是那么容易做到。精确定量收集物中的被分析物的量是很困难的。你可以尝试以下的方法去解决这个问题。把有疑问的收集物蒸干，用和原来样品相同组分的溶剂重新溶解，然后把这个样品采用和原来样品一样的方法上到 SPE 柱上。如果你发现在洗脱过程中有被分析物，那么说明有一部分被分析物在冲洗过程中被一起冲洗掉。另外一个方法就是使用标准品，用样品的前处理方法上 SPE 柱。这个方法不是很严格，因为杂质的存在会影响到被分析物。Q：这些都是不错的建议，那么我怎么分析那些洗脱过程后仍然残留在 SPE 柱上的样品呢？A：你必须在第一步洗脱过程后再用更多的溶剂洗脱，这样会把残留的样品洗脱下来。通常，你需要增加洗脱溶剂的强度。需要考虑一下为什么一定比例的被分析物会有很强的残留。是否由于游离硅醇基的作用？那么你可以改变洗脱过程中缓冲液的 pH 值或者缓冲液的洗脱强度。是否由于疏水作用？那么你可以增加有机溶剂的比例或者选用洗脱力更强的有机溶剂（例如用乙腈代替甲醇）。是否可能是样品与残余的硅醇基间的氢键作用？那么增加甲醇来替代乙腈或者 THF 可能会有帮助。Q：好的，如果我在所有这些步骤中没有发现不妥的地方，是否可以排除 SPE 是造成问题的原因？A：是的，我们现在需要去探索，是否样品在其它前处理过程中有所损失。可能是由于样品在样品容器表面的强吸附。一个疏水很强的分析物很可能吸附在聚乙烯的瓶壁上。强碱性的分析物可能和玻璃瓶表面的硅醇基结合。也有可能是分析物吸附在固体基质或者和基质上的其它物质结合（例如蛋白质）。这些问题可能会更难分离。从根本上来说，越接近 100%回收率就越好。这样就能保证你的方法从一开始就是严谨的。即使这样，环境也可能会造成有回收率的重现性不好，但是这种情况发生的可能性会比一开始就选用一个不耐受的方法要小。如果在开始时就能得到很好的回收率，那么通常洗脱剂组成的改变或者填料本身都不太会影响你的方法，唯一可能导致回收率变化的原因可能是 SPE 柱的柱床质量问题。如果柱床上有空隙，那么流速就不是均匀的，可能造成分析物很早就流穿。你可以通过粗略地检查 SPE 装置来避免这个问题，因为能影响到方法的空隙肯定是非常明显的。10常见色谱问题及沃特世色谱柱产品解决方案常见色谱问题色谱柱选择与解决方案对应产品特点简介碱性分析物峰拖尾XBridgeTM色谱柱可利用高 pH 条件对碱性化合物获得更好的保留与峰形，获得更高的载量与分辨率，避免由于峰拖尾造成的杂质漏检等问题XBridge 系列柱：沃特世第二代杂化颗粒专利产品 具有行业领先的化学稳定性（pH 1-12），通用的色谱柱选择，无以伦比的流动相 pH 使用范围、温度与压力的耐受兼容性 多种固定相选择用于小分子分析物6 种和生物制药分析物8 种产品手册：XBridge HPLC 柱手册，2012 年，720001255ZH亚乙基桥杂化BEH技术及其在液相色谱中的应用，2004 年：720001159en（英文）既有标准方法要求使用中-高pH 条件，柱寿命差XBridge 色谱柱在高 pH 条件下，耐受性极佳，显著延长色谱柱使用寿命，帮您节省实验室成本既有标准方法要求使用较高温度（大于 40），柱寿命不佳XBridge 色谱柱在高温下的耐受性远优于常规硅胶柱，延长色谱柱寿命，帮您节省实验室成本色谱峰分离不佳，通过增加实验次数来优化方法XBridge 色谱柱，允许您使用 pH 作为有力的方法开发工具，可供您高低pH 两端，更加灵活的筛选色谱条件既有标准方法要求使用高比例水相条件，色谱柱不能兼容于 95%水相，发生“疏水塌陷”（停泵后丧失保留；or 保留时间持续前漂）Atlantis柱能耐受 100%水相，避免高比例水相条件给您带来重现性问题Atlantis 柱：用于极性分子保留的业内标杆产品特别设计用于反相保留极性化合物 很好地增强了对极性化合物的保留能力与 100%水相完美兼容 增强了在高水相条件下对低 pH 条件的耐受力 LC-MS 兼容 峰形好，分离重现性好产品手册：Atlantis 色谱柱，卓越的极性化合物保留，72000286en（英文）技术白皮书：液相色谱仪题（一）：设计反相色谱柱用于极性化合物保留，720001889en（英文）极性化合物在高键合密度的C18柱上保留很差Atlantis 柱增强极性化合物保留的专用硅胶色谱柱强极性化合物在反相条件中，完全没有保留，死时间出峰1、XBridge Amide(pH 2-11)：特殊键合相满足特定需求，酰胺基用于极性物质例如糖分析等2、XBridge HILIC(pH 1-9)Atlantis HILIC Silica(pH 1-5)对强极性碱有更好的保留和分离，如吗啡及其代谢产物、三聚氰胺、多巴胺类、胆碱等使用 HILIC 系列柱，可以给您带来以下便利：保留 在反相中不保留的强极性化合物 提供与反相色谱保留互补的选择性 增强质谱的灵敏度：高比例的有机相(80%ACN)可以增加 ESI-MS 响应 PPT 处理的样品，HILIC 模式不需要挥干和复溶，可以采用直接进样，增加样品的高通量相关产品资料：Atlantis 色谱柱应用文集（72000472en）XBridge Amide 色谱柱应用文集（720003438en）极性化合物保留全面解决方案（单页）高比例水相，提高化合物保留，然而质谱响应极低采用 HILIC 模式分离，高比例有机相，可增加 MS 响应11常见色谱问题色谱柱选择与解决方案对应产品特点简介使用传统氨基柱做糖及类似糖结构的化合物时，柱寿命短，基线噪音大，MS 或 ELSD检测器不兼容XBridge Amide 柱：宽 pH 耐受范围 2-11，无键合相流失问题，柱寿命长，解决传统硅胶柱的局限性为了确保分析方法的持续的可靠性与重现性，有必要测试和评估来自不同批次色谱填料的柱沃特世大多数色谱柱品种均有色谱柱方法验证包，提供三根来自于不同批次色谱填料的色谱产品，帮助您判断分析方法的耐受性、可靠性和一致性 XSelect 分析柱方法验证包（含 XP 柱）Sunfire 分析柱方法验证包 Atlantis 分析柱方法验证包 XTerra 分析柱方法验证包 Symmetry，SymmetryShield和Symmetry300方法验证包 UPLC 柱方法验证包 肽分离技术方法验证包（UPLC 和 HPLC 柱）以上仅列举部分，其中未包含的产品或相关产品信息请咨询沃特世工作人员柱-柱之间与批次之间重现性不够稳定作为硅胶及杂化颗粒的主要生产商，沃特世公司为不同批次之间的重现性设立了行业基准，使得批与批、柱与柱之间的变异性最小化，从而为分析方法长期的可靠性提供信心制造工厂经认证依从 cGMP 规范、ISO9001 以及 ISO13485 沃特世提供最广泛和最精深的液相色谱化学消耗品（色谱柱产品和样品前处理相关产品），这些产品由沃特世自有的世界一流的工厂制造生产以达到业内最高质量标准，并由技术娴熟的销售和支持团队加以支持。作为市场领导者，沃特世公司将成为您的合作伙伴，帮您解决工作中遇到的难题，让您更加轻松、自信的应对日常分析工作。更加详细的产品信息，请咨询沃特世公司工作人员。2012沃特世公司。中国印刷 2012年09月 沃特世科技（上海）有限公司上海市浦东新区张东路1387号41栋电话：[phone]传真：[phone] 北京分公司北京市朝阳区铜牛国际大厦光华路15号院2号楼9层电话：[phone]传真：[phone]广州分公司广州市荔湾区中山七路50号西门口广场1707-08室电话：[phone]传真：[phone]成都分公司成都市新光华街7号航天科技大厦1803室电话：[phone]传真：[phone]沃特斯中国有限公司香港新界沙田香港科学园科技大道西2号生物资讯中心6楼608室电话：852-2964 1800传真：852-2549 6802免费售后服务热线：800(400)820 2676