尖孢镰刀菌碳化硅量子点标记及其长时程荧光成像.pdf

第 29 卷 第 17 期 农 业 工 程 学 报 Vol.29 No.17 2013 年 9 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Sep.2013 286 尖孢镰刀菌碳化硅量子点标记及其长时程荧光成像 宋月鹏1,2，康 杰1,2，高东升2，李江涛3，王晓波4，尹承苗2，毛志泉2（1.山东农业大学机械与电子工程学院，泰安 271018；2.山东省园艺机械与装备重点实验室，泰安 271018；3.中国科学院理化技术研究所，北京 100190；4.山东文登整骨医院，文登 264400）摘 要：致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）的荧光标记与活体细胞的长时程荧光成像示踪是研究其侵染机制较为有效的方法之一。采用化学腐蚀法制备出 SiC 量子点标记材料，研究了化学腐蚀法制备工艺过程，对 SiC量子点标记材料的微观结构及光学性能进行检测分析，而后对尖孢镰刀菌进行标记及长时程荧光成像，结果表明，SiC 量子点具有良好的生物相容性及光学性能，发射光颜色与其尺寸有内在关联性，腐蚀过程中即可在表面形成多种亲有机物功能团。尖孢镰刀菌生长初期 SiC 量子点将标记在分生孢子细胞膜处，而后通过内吞作用，进入活体细胞内部并形成稳定标记。进一步研究发现，SiC 量子点无细胞毒性，可以实现活体细胞的长时程荧光成像，同时对其标记特征及原理进行了初步分析讨论。这对于尖孢镰刀菌侵染致病过程组织学与细胞学特征研究，揭示其致病机理、发展新型植株枯萎防治方法提供直观依据和理论分析基础。关键词：荧光，标记，成像技术，长时程荧光成像，尖孢镰刀菌，活体细胞，碳化硅量子点 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.17.037 中图分类号：O657.3 文献标志码：A 文章编号：1002-6819(2013)-17-0286-07 宋月鹏，康 杰，高东升，等.尖孢镰刀菌碳化硅量子点标记及其长时程荧光成像J.农业工程学报，2013，29(17)：286292.Song Yuepeng,Kang Jie,Gao Dongsheng,et al.Labeling Fusarium oxysporum with silicon carbide quantum dots and long-term-distance fluorescent imaging for living cellsJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(17):286292.(in Chinese with English abstract)0 引 言 荧光标记与成像技术是生命科学研究中重要的也是普遍应用的分析检测手段之一，它可为细胞结构、生物体器官功能及其生命活动规律等生物学问题的研究提供理论分析直观依据1-7。但是，长期以来，该技术所采用的荧光染料（荧光素类、罗丹明类，菁染料等）存在荧光光谱较宽，易漂白，化学稳定性不强，易淬灭寿命短，生物相容性差等缺陷，不能满足活体细胞长时程荧光成像要求1-5。纳米生物技术是目前农业工程技术领域中最前沿的研究方向8-12，量子点（quantum dots，QDs）作为一种新型纳米生物材料，在农业工程领域的应用越来越受到广泛重视。而镉系量子点（CdSe、收稿日期：20130407 修订日期：20130720 基金项目：国家自然科学基金(51001111)；“十二五”国家支撑计划项目(2011BAD12B02)；山东省博士后创新基金(201203101)；山东省研究生教育创新计划（SDYY11079）；中国博士后科学基金（2013M531636）。作者简介：宋月鹏（1971），男，博士后，副教授，主要从事新材料制备与计算机数值模拟。泰安 山东农业大学机电学院，271018。Email： 通信作者：高东升（1967），男，博士，教授，主要从事果树生长生理及其高产低耗研究。泰安 山东农业大学园艺学院，271018。Email： CdTe、CdS 等）是近几年研究重点，而 ZnS 包覆CdSe 核壳结构量子点材料的研究最为深入13-21。到目前为止，在长时程示踪方面，已有多篇研究成果在Science、Nature等杂志上发表6-9，成为当前纳米生物材料领域研究的热点。但是，镉系量子点细胞毒性及其结构尺寸难以调控是影响其在活体细胞长时程示踪成像方面进一步应用的主要因素22-24。近年来开发的新型SiC 量子点荧光标记与成像材料是一种生物惰性陶瓷材料，具有无毒、生物相容性良好且制备工艺简单等特点而逐渐被人们所重视12,22,25-28，如孙祥鸣等12制备的 SiC 量子点对出芽短梗霉菌进行标记且实现了长时程荧光成像。由致病性尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）侵染引起的植物枯萎病是一种世界性的土传真菌病害，可引起 100 多种植物维管束萎蔫死亡，在植株的全生育期中都可发生，一旦侵染蔓延很快，导致农作物和园艺作物大面积减产而造成巨大经济损失29，中国各栽培区均有发生且呈蔓延趋势。其侵染过程的动态性，种群的多样性（120 多个专化型及小种）及其相互间相干性，种内菌株形态、生理、病理等多变性与复杂性，遗传的多态性等因素造成侵染机制研究的复杂性及难度，成为当前发展第 17 期 宋月鹏等：尖孢镰刀菌碳化硅量子点标记及其长时程荧光成像 287 新型防治技术的一个瓶颈29-30。基于此，本文利用化学腐蚀方法制备出 SiC 量子点水相溶液，对尖孢镰刀菌长时间培养并进行活体细胞长时程荧光成像，为动态监测尖孢镰刀菌侵染过程及单细胞生长发育遗传机制、调控规律及其与生长环境的相干性规律等理论研究提供支持与分析依据。1 材料与方法 1.1 活体细胞试验 按文献10给出的方法制备出 400 mL 碳化硅量子点水溶液。本文采用的是由连作果园苹果腐烂的 根 中 分 离 出 的 尖 孢 镰 刀 菌（Fusarium oxysporum），具体的培养方法为 将保藏于霉菌培养箱内的斜面菌种刮取 2 环在无菌条件下接种至配好的PD培养基（马铃薯200 g，洗净去皮切碎，加水 1 000 mL 煮沸 30 min，纱布过滤，再加 20 g 葡萄糖，121灭菌 20 min，冷却后贮存备用。）内进行活化，恒温振荡器（28，200 r/min）培养 2 d；在超净工作台内操作，无菌条件下量取含有尖孢镰刀菌的 PD 培养基 18 mL，SiC量子点水溶液 6 mL，配制成体积比为 3:1 的霉菌液体培养基，置于恒温振荡器（28，200 r/min）内培养 340 d，定期取样在荧光显微镜下观察尖孢镰刀菌不同时间的生长状况及分裂形貌。1.2 微观形貌及光谱特征表征 用日本 JEOL 公司的 JEM-2100 型电子透镜（transmission electron microscope）及HITACHIS-4300 型扫描电子显微镜（scanning electron microscope）对量子点微观形貌结构进行分析检测，用 F-4600 型荧光分光光度计(激发光源为氙灯)测试样品的激发光谱、发射光谱。利用 Nicolet 6700 傅氏转换红外线光谱分析仪（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）对量子点表面物化特性进行检测，用日本奥林巴斯 IX-71 型荧光显微镜观察活体细胞形貌并进行照相。2 结果与分析 2.1 碳化硅量子点微观结构及其光学特性 本研究采用的原料是自蔓延燃烧合成的纳米均质-碳化硅粉体，由于反应迅速且冷却速度快而形成非平衡结晶条件，粒子表面形成较多缺陷（晶格畸变等），活性较高，腐蚀激活能较低，极易腐蚀成网格状镂空结构，如图 1a 所示。图 1 SiC 粉体腐蚀镂空结构及其量子点透射电子显微镜下形貌 Fig.1 Latticed-hollow micro-morphology of silicon carbide particles and transmission electron microscope(TEM)micro-morphology of silicon carbide quantum dots 文献12也获得了此类结构的证据。而后经过机械研磨、超声空化破碎及分散，超重力场离心层析剪裁，获得直径小于 5 nm 的 SiC 量子点水相溶液，透射电子显微镜（TEM）下观察量子点形貌如图 1b 所示。图中显示的黑点即为 SiC 量子点，而右上角为一个 SiC 量子点局部放大图，图中清晰的显示出该材料（001）位向原子排列形式。由 SiC 量子点直径（100 个）测量结果可以看出，本研究制备的量子点直径在 13.5 nm 之间，近似服从中心分布，平均直径为 2.5 nm。这与文献10给出的结果极为相似。由于其小于 SiC 体材料激子波尔（Bohr）直径（5.4 nm），因此可形成极为显著的光致发光效应，进一步研究表明，在340 nm激 发 光 波 长 下，其 光 致 发 光 效 应（photoluminescence，PL）最强，此时荧光发射特征波长为 450 nm，斯托克斯位移可达 110 nm（FITC农业工程学报 2013 年 288 异硫氰酸荧光素仅为 35 nm），因此，该量子点材料在蓝光激发区才显现出强烈的荧光效应。进一步研究发现，不同直径的 SiC 量子点在相同波长激发光（340 nm）下呈现不同的颜色，如图2 所示。图 2 SiC 量子点水溶液多色荧光特征 Fig.2 Multi-color fluorescent displaying of SiC QDs aqueous solution 由图可见，在白光下，粒径为 2 nm 的 SiC 量子点水溶液呈黄色，这与文献13,25-28给出的结果相一致如图 2a。根据不同粒径在超重力场中的分布特性，通过调整重力系数，获得 2 种 SiC 量子点水相溶液，在电子透镜下观察测量出各自粒径，分别为 5 及 2 nm。在 340 nm 单一激发光下，直径为 5 nm 的量子点水溶液呈黄绿色，而 2 nm 的呈现淡蓝色，如图2b、c 所示。荧光分光光度计对两种不同粒径的量子点溶液进行发射光谱分析，结果表明，量子点直径从 5 nm 减小到 2 nm 时对应荧光最大发射波长随之由 470 nm 蓝移至 439 nm。该研究结果的深层次意义在于，可以制备出不同直径的 SiC 量子点材料，分别对不同客体进行标记，在单一激发光下识别，从而实现可多目标标记示踪，文献2-5报道了镉系量子点材料在此方面的应用，如美国量子点公司已成功实现了对同一细胞不同细胞器的三色标记4。这也是传统荧光材料所无法匹敌的荧光特性。2.2 尖孢镰刀菌碳化硅量子点标记及其特征 将培养 5 d 的 2 种不同的尖孢镰刀菌菌液（一种培养液内无 SiC 量子点，一种有直径为 2.5 nm 的SiC 量子点）分别滴到载玻片上，置于荧光显微镜观察，首先在白光下观察，结果如图 3a，b 所示，而后在波长为 340 nm 的蓝色激发光下观察，结果如图 3c，d 所示。由图 3 可以看出，培养液内无 SiC 量子点的尖孢镰刀菌蓝色激发光下不会产生荧光（图 3c），而加入 SiC 量子点的尖孢镰刀菌在 340 nm 蓝色激发光下发出明亮荧光，在此激发光波下，长时间（约1 h）照射该样品，其荧光强度没有任何变化，说明该量子点在强光照射下，不会发生光漂白，也不容易被尖孢镰刀菌微环境所淬灭。同时即使在白光下，该样品也有较为强烈的荧光发出（图 3b），说明该量子点具有优良的光学特性，这为活体细胞及其亚结构标记奠定了光学基础。图 3 尖孢镰刀菌 SiC 量子点标记及其荧光成像 Fig.3 Labeling Fusarium oxysporum with SiC QDs and fluorescence imaging for living cells 进一步研究发现，培养 5 d 后，SiC 量子点主要存在于尖孢镰刀菌分生孢子的细胞膜处，如图3d。对圆内细胞进行局部放大，可以清楚的看到这一点。利用缓冲液对标记后的尖孢镰刀菌进行 3 次细胞洗脱，在荧光显微镜下，经过 SiC 量子点培养的尖孢镰刀菌细胞膜处仍然发出较强的荧光，因此，可以断定，本研究制备的 SiC 量子点对尖孢镰刀菌细胞形成了稳定标记。2.3 尖孢镰刀菌活体细胞长时程荧光成像 对有 SiC 量子点培养液内培养 10 及 20 d 时的尖孢镰刀菌进行荧光成像，如图 4 所示。结合图 3d 可以看出，随着培养时间的延长，尖孢镰刀菌细胞形貌出现较大变化，由初期的分生孢子生长成镰刀状菌落（图 4a），最后形成团絮状菌丝（图 4b），与图 3d 所不同的是，经 SiC 量子点标记的分生孢子生长过程中，通过内吞作用可使量子点进入到活体细胞内部并形成强烈的荧光效应（图 4a），而后，可对尖孢镰刀菌菌丝形成稳定的荧光标记（图 4b 左上角放大图）。由此可以看出，SiC 量子点材料可以实现对不同时期尖孢镰刀菌的稳定标记，这对于该菌生长及调控规律、侵染过程等方面的研究提供了材料及技术支持。第 17 期 宋月鹏等：尖孢镰刀菌碳化硅量子点标记及其长时程荧光成像 289 经过 SiC 量子点培养的尖孢镰刀菌与对照组（无 SiC 量子点培养液）相比，其细胞形貌、发育模式及生长规律等方面未发现明显差别，这说明SiC 量子点细胞毒性较小或无细胞毒性，不会对细胞生长发育过程产生影响，文献12的研究结果 表 明，SiC量 子 点 对 出 芽 短 梗 霉 菌（Aureobasidium pulluans）生长生理机能无显著影响，而 Bluet25及 Sahu 等28进行的 SiC 量子点细胞毒性试验也证明了这一点。同时，Bluet 等认为，SiC 量子点表面物化特性相对简单、在活体细胞内分布均匀是其细胞毒性小的主要原因28，这为该量子点在活体细胞长时程荧光成像方面的应用奠定了生物学基础。图 4 尖孢镰刀菌活体细胞长时程荧光成像 Fig.4 Long-term-distance fluorescence imaging for living cell of Fusarium oxysporum 3 尖孢镰刀菌碳化硅量子点的稳定标记分析 量子点微观结构及尺寸分布情况对其光学性能影响极大，结构呈核壳球状，半径接近或小于相应体材料激子波尔（Bohr）半径，尺寸高度单分散时，量子点才有可能展现出强的量子限制效应。半径越小，效应越强，则发射光强越强。文献26经过理论计算获得了 3C-SiC 体材料的激子波尔直径为 5.4 nm，本研究制备的量子点尺寸在 13.5 nm，可以形成极为显著的光致发光效应。碳化硅量子点标记的稳定性取决于表面物化特性，对于镉系量子点，需要经过合成、表面修饰及生物功能化处理才可用于生物学应用，而对于 SiC量子点标记材料，众多文献12,25-27,31介绍，在其腐蚀过程中，在表面既可形成亲有机物功能团。在 HNO3与 HF 混合溶液内，自蔓延燃烧合成的-SiC 颗粒将按如下方程式发生反应 SiC+2HNO3+6HFH2SiF6+2HNO2+CO2+2H2（1）对腐蚀前后的 SiC 颗粒利用傅氏转换红外线光谱分析仪进行表面物化特性检测，结果如图 5a所示。根据对 SiC 颗粒腐蚀前后进行 FTIR 检测，结果发现两者存在一定差异，腐蚀后，在 SiC 颗粒表面形成明显的 C=O，O-H 等功能键的能量峰，结合对腐蚀过程的化学分析，可以认为，在腐蚀过程中，SiC 颗粒表面既已形成了 COO-、O-及OH-等亲有机物功能团，其表面物化特性模型如图 5b 所示。图 5 SiC 颗粒腐蚀前后的 FTIR 检测结果及其表面物化特性 Fig.5 Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR)for SiC particles before and after corrosion and its surface physicochemical characteristics model Bluet、Fan 及 Li 也分别进行了此方面的研究工作，获得相同的研究结果25-27,31。如 Bluet 认为，在化学腐蚀过程中，SiC 量子点表面即可形成COO-，OH-等亲有机物功能团25。这些功能团的存农业工程学报 2013 年 290 在，对于尖孢镰刀菌活体细胞 SiC 量子点的稳定标记起到重要作用。因此，可以认为，自蔓延合成的均质纳米-SiC颗粒在 HNO3与 HF 混合溶液内快速腐蚀成镂空或网状结构，其表面既已形成了 COO-，OH-等亲有机物功能团，在尖孢镰刀菌培养过程中，这些表面带有功能团的量子点与分生孢子细胞膜处的蛋白质结合，形成稳定标记。而后随着孢子生长，发育成菌落而后形成团絮状菌丝，通过细胞的内吞作用，SiC 量子点将进入活体细胞内部并形成稳定标记。但是，SiC 量子点对细胞膜标记结合的动态过程，细胞内吞作用机理及其进入活体细胞后的分布等问题，尚待进一步研究。4 结 论 1）腐蚀法制备的 SiC 量子点具有优良的光学特性，荧光颜色与其直径尺寸有内在关联性，在340 nm 激发光下，5 及 2 nm 量子点荧光发射波长分别为 470 与 439 nm，这说明量子点直径减小将导致荧光发射蓝移。2）SiC 量子点在腐蚀制备过程中，表面一步法可以形成了 COO-、O-及 OH-等亲有机物功能团，这也是 SiC 量子点对尖孢镰刀菌稳定标记的内在原因，同时对标记特异性也具有重要意义。3）碳化硅量子点可实现尖孢镰刀菌不同生长阶段的稳定性标记，由于其光学性能稳定、生物相容性优良、无细胞毒性可以实现活体细胞的长时程荧光成像与示踪。致谢：本文中 SiC 量子点腐蚀机制及表面物化特 性 分 析 方 面 得 到 了 韩 国 浦 项 工 科 大 学（POSTECH）的 Kim Hyoungseop 教授的指导与帮助，在此表示感谢。参 考 文 献 1 刘爱平，王琦琛，郭振，等.细胞生物学荧光技术原理和应用M.合肥：中国科学技术大学出版社，2007.2.2 Michalet X,Pinaud F F,Bwntolila L A,et al.Quantum dots for live cells,in vivo imaging,and diagnosticsJ.Science,2005,307（5709）:538544.3 Gao X H,Cui Y Y,Levenson R M,et al.In 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Equipments;Taian 271018,China;3.Technical Institute of Physics and Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100190,China;4.Wendeng Orthopaedic and Traumatic Hospital,Wendeng 264400,China)Abstract:Fluorescence microscopy has allowed the functional study of various molecules that have been identified in living cells.The capabilities of this technique have generated a huge interest in developing new probes for labeling molecules and observing changes in their cellular activities.Quantum dots(QDs)based on II-VI(e.g.,CdSe,CdTe,CdS,and ZnSe)and III-V(e.g.,InP and InAs)semiconductors have attracted considerable scientific interest over the past two decades for their remarkable luminescent properties.However,the widely used CdX semiconductor QDs were found to be cytotoxic through the release of free metallic ions(cadmium ions for instance).Therefore,it becomes clear that the cytotoxicity strongly influencing biological cell functioning is one of the major limiting factors for the application of II-VI QDs in efficient living cell imaging.Recently,silicon carbide(SiC)QDs has been growing attention for people with the advantages of non-toxic,good biocompatible due to its simple preparation process and excellent optical properties.Es