DNA核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）.pdf

DNA 核酸浓度的测定实验应用方案（超微量紫外分光法）引言 寡核苷酸，单链、双链 DNA，以及 RNA 可以定量溶于缓冲液，构成核酸的嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键，使核苷核和核酸在紫外线光具有特征性的吸收光谱，最大吸收峰为 260nm。窄光带紫外分光光度计，长 260nm，比色杯光径 1cm，1个吸光度值（1A）相当于50ug/ml双螺DNA，40ug/ml单螺旋DNA或RNA），20 ug/ml 寡核苷酸。测试前，选择正确的程序，输入原液和稀释液的体积，尔后测试空白液和样品液。然而，实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者最头痛的问题。灵敏度越高的仪器，表现出的吸光值漂移越大。原理 紫外分光光度法基于 DNA 链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，DNA/RNA在260nm处有最大的吸收峰，蛋白质在28Onm处有最大的吸收峰，盐和小分子则集中在 230nm 处。因此，可以用 260nm 波长进行分光测定核酸浓度，OD 值为 1 相当于大约 50ug/ml 双链 DNA，单链 DNA 浓度约为 33ug l ml，RNA 约为 40ug/ml，寡核苷酸约为 35ug/ml。如用 1cm 光径，用 H,O 稀释 DNA/RNA 样品 n 倍并以 H,O 为空白对照，根据此时读出的 OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:DNA(mg/ml)=50OD260 读数稀释倍数/1000RNA(mg/ml)=40OD260 读数稀释倍数/1000。A280nm 是蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 的 A260/A280 比值为 1.8，纯 RNA 为 2.0。假如比值低，表示受到蛋白（芳香族)或分类物质的污染，需要纯化样品。比值=1.5 相当于 50%蛋白质/DNA 溶液。A230nm 是碳水化合物最高吸收峰的吸收波长，比值可进行核酸样品纯度评估:纯 DNA 和 RNA 的 A260/A230 比值为 2.5。若比值小于 2.0标明样品被碳水化合物（糖类）、盐类或有机溶剂污染，需要纯化样品。A320nm 或 A340nm 为检测溶液样品的浊度，该值应该接近 0.0。假如不足，标明溶液中有悬浮物，需要纯化样品。仪器及试剂 UL-1000 超微量紫外可见分光光度计 比色杯 样本 DNA 双蒸水 测定 1、将制备的 DNA 悬浮溶解于 TE 缓冲液中 pH8.0，10mmo1L 的 Tris 缓冲液，内含(1mmol/L EDTA)或悬浮溶解在灭菌水中(依据 DNA 含量加水)。2、用可扫描的紫外分光光度计测定制备的 DNA/RNA 的紫外吸收曲线，测定OD260 和 OD280，并计算比值:OD260/OD280，纯 DNA 的此比值约为1.82.0。纯 RNA 的此比值 约为大于 2.0。3、根据每毫升 1 微克的纯 DNA 的 OD260 值=0.020，计算所得 DNA 的纯度:每毫升 1 微克的纯 RNA 的 OD260 值=0.025，计算所得 RNA 的纯度。注意事项 OD 值范围应该在 0.10.99 之间，否则不符合上述线性关系。A260/A280 比值可提供 DNA 纯度的一个参考，但 A260/A280 比值会受 pH影响。如果未调 pH，比值可能与实际差别很大。如果需要准确数值，建议在 10 mM Tris Cl，pH 8.5 中检测，此时纯净的 DNA A260/A280 比值应为 1.8-2.0（注意应使用同样缓冲液作为对照)在测试时，离子浓度太高，也会导致读数漂移，因此建议使用 pH 值一定、离子浓度较低的缓冲液，如 TE，可大大稳定读数。样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素：由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒，尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了最大程度减少颗粒对测试结果的影响，要求核酸吸光值至少大于 0.1A，吸光值最好在 0.1-1.5A。在此范围内，颗粒的干扰相对较小，结果稳定。从而意味着样品的浓度不能过低，或者过高（超过光度计的测试范围）。最后是操作因素，如混合要充分，否则吸光值太低，甚至出现负值；混合液不能存在气泡，空白液无悬浮物，否则读数漂移剧烈；必须使用相同的比色杯测试空白液和样品，否则浓度差异太大；换算系数和样品浓度单位选择一致；不能采用窗口磨损的比色杯；样品的体积必须达到比色杯要求的最小体积等多个操作事项。关于美析 美析主营光谱类仪器：可见分光光度计、紫外可见分光光度计、原子吸收光谱仪、原子荧光光度计、ICP-AES、ICP-MS，生命科学仪器：超微量分光光度计、全自动核酸提取仪，目前，我们的产品已广泛应用于有机化学、无机化学、生物化学、医药、环保、冶金、石油、农业等领域。同时美析利用在产品机械结构、光学设计、电气应用和软件开发方面积累的丰富经验，结合市场的最新实际需求，近期将陆续推出一批全新的分析类仪器。