《消毒剂消毒效果定性试验-应用稀释法》报批版.docx

ICS11.080
C 50

中华人民共和国国家标准
GB/TXXXXX—XXXX

消毒剂消毒效果定性试验-应用稀释法
Qualitative testing of use dilution method for disinfection effect of disinfectant     

XXXX-XX-XX发布
XXXX-XX-  实施

GB/T XXXXX—XXXX
目  次
前  言 II
1　范围 1
2　规范性引用文件 1
3　术语 1
4　实验材料 1
5　染菌载体的制备 2
6　中和剂鉴定试验 4
7　杀菌试验 5
8　结果判定 6
9　注意事项 6
附录A　培养基和试剂 7

前  言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国国家卫生健康委员会提出并归口。
本标准负责起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、解放军疾病预防控制中心。
本标准主要起草人：佟颖、于礼、沈瑾、魏秋华、王劲、韩杰、安伟、肖潇、高迪。

9
　消毒剂消毒效果定性试验-应用稀释法
1　 范围
本标准规定了消毒剂消毒效果定性试验应用稀释法的实验材料、染菌载体的制备、中和剂鉴定试验、杀菌试验、结果判定和注意事项。
本标准适用于消毒剂对光滑硬质物体表面的实验室消毒效果评价。
2　 规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/TXXXXX—XXXX消毒试验用微生物要求
3　 术语
下列术语和定义适用于本文件。
3.1　
应用稀释法usedilutionmethod
采用定性方法评价消毒剂对不锈钢圆筒载体上试验微生物杀灭效果的检测方法。
4　 实验材料
4.1　 试验微生物
4.1.1　 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作为细菌繁殖体中化脓性球菌的代表，试验菌种为ATCC6538。
4.1.2　 铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)作为医院感染中常见分离的细菌繁殖体的代表，试验菌种为ATCC15442。
4.1.3　 肠炎沙门菌(Salmonellaenterica)，试验菌种为ATCC10708。
4.2　 培养基
4.2.1　 传代培养基
合成肉汤或营养肉汤，用于细菌传代培养，见附录A。
4.2.2　 中和试验培养基
4.2.2.1　 基础培养液：营养肉汤或液体硫乙醇培养基，作为中和试验的基础培养基，见附录A。
4.2.2.2　 中和剂培养液：根据消毒剂有效成分选择相应中和剂加入基础培养基液中制备成为中和剂培养液，中和剂培养液需经中和剂鉴定试验验证合格后方可使用。
4.2.3　 其他培养基
胰蛋白胨大豆琼脂，用于染菌载体的菌落计数，见附录A。
4.3　 其他试剂和材料
4.3.1　 磷酸盐缓冲液(见附录A.6)。
4.3.2　 标准硬水(见附录A.7)。
4.3.3　 有机干扰物：牛血清白蛋白。
4.3.4　 载体：304不锈钢圆筒，表面抛光，外径8mm±1mm，内径6mm±1mm，壁厚1mm±0.5mm，长度10mm±1mm。
4.3.5　 吊钩：长度为50mm～75mm，直径为0.5mm的镍铬合金丝，末端3mm呈直角弯屈。
4.3.6　 滤纸：直径为90mm的定性滤纸。
4.3.7　 器皿：25mm×100mm玻璃试管，直径为90mm的平皿，10mL吸管。
4.4　 仪器设备
II级及上生物安全柜、恒温培养箱、振荡培养箱、恒温水浴箱。
5　 染菌载体的制备
5.1　 载体准备
5.1.1　 外观检查
载体经肉眼观察合格，方可使用。如有可见破损如钝化、缺口、凹陷或凿孔等应剔除。
5.1.2　 清洗
将载体置于1mol/L NaOH溶液中浸泡约12h，用去离子水反复冲洗3～4次，收集冲洗水加入2～3滴1%酚酞溶液，如酚酞变为粉红色，表明有NaOH残留，需要继续冲洗至酚酞不变色，将载体晾干后密闭保存。
5.1.3　 筛选测试
5.1.3.1　 测试要求
未使用过，或使用过但试验中无菌生长的载体，不需进行筛选测试，经压力蒸汽灭菌后可使用。使用过的载体，且在试验中有菌生长，应进行筛选测试，测试合格方可使用。
5.1.3.2　 测试方法
按照7.1规定，在无有机干扰物条件下，选用500mg/L苯扎氯铵消毒液对铜绿假单胞菌消毒作用10min，以Letheen肉汤作为中和剂培养液，对每个载体进行杀菌试验。
5.1.3.3　 测试结果判断
无菌生长为载体筛选测试合格，测试管中有菌生长，则该载体不合格。
5.1.4　 灭菌
载体染菌前，将清洗后的载体放入试管中，加入去离子水至载体完全浸没，经压力蒸汽灭菌后，冷却至室温备用。
5.2　 菌悬液的制备
5.2.1　 按照GB/TXXXXX—XXXX的规定复苏菌种，接种于含10mL营养肉汤或合成肉汤的试管中，经36℃±1℃200rpm±20rpm振荡培养24h±2h，此为第1代培养物。
5.2.2　 用移液器取第1代培养物10μL转种于含10mL营养肉汤或合成肉汤的试管中，经36℃±1℃　200rpm±20rpm振荡培养24h±2h，此为第2代培养物，可继续传代培养至第5代。
5.2.3　 用移液器取第1～5代的24h新鲜培养物10μL转种于10个含10mL营养肉汤或合成肉汤的试管中，经36℃±1℃静置培养48h～56h后备用。
5.2.4　 铜绿假单胞菌培养物应去除培养菌液表面的菌膜，或使用10mL吸管直接从溶液中部吸取菌液，放入另一个试管中。不可使用含菌膜的菌悬液进行试验。
5.2.5　 将金黄色葡萄球菌、肠炎沙门菌和去除菌膜的铜绿假单胞菌培养菌液用电动混匀器振荡混合20s，室温静置10min后，用10mL吸管吸取上层四分之三的菌液转移至新的试管中混匀，以去除细菌碎片和团块，菌悬液于4℃冷藏保存备用，于30min内使用。
5.2.6　 根据消毒剂的检测要求，按照GB/TXXXXX的规定加入有机干扰物。
5.3　 载体染菌
5.3.1　 每次试验时取80个无菌载体染菌，首先向4个无菌试管（25mm×100mm）中分别加入20mL制备好的菌悬液，依次向每管菌液中加入20个干燥无菌载体，确保载体完全浸没于菌液中，持续15min±2min。
5.3.2　 用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余菌液，垂直放置于无菌的双层滤纸上，置36℃±1℃恒温培养箱内干燥40min±2min后，于2h内进行试验。
5.4　 染菌载体菌落计数
5.4.1　 随机挑选2个染菌载体，分别放入2个含10mL营养肉汤的50mL离心管中，用电动混匀器剧烈振荡混匀20s进行洗脱，使用磷酸盐缓冲溶液进行10倍系列稀释。
5.4.2　 选择适宜稀释度试管，吸取1mL加入无菌平皿中，将冷却至40℃～45℃的熔化营养琼脂培养基，倾注于平皿中，平行接种于2个平皿，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h后进行菌落计数。
5.4.3　 每个染菌载体上金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的回收菌量为1.0×106CFU/载体～1.0×107CFU/载体，肠炎沙门菌的回收菌量为1.0×105CFU/载体～1.0×106CFU/载体。
6　 中和剂鉴定试验
6.1　 试验原则
通过中和剂鉴定试验结果，判断所选中和方法对消毒剂是否有效中和。若中和I组显示可有效中和，则仅使用中和剂培养液进行中和。若中和I组结果显示未完全中和，而中和II组为有效中和，则在选用中和剂培养液进行中和的基础上，再使用培养液进行二次中和。如仍显示未完全中和，则继续进行中和II组试验。试验重复三次。
6.2　 菌悬液的稀释
6.2.1　 取1mL制备好的菌悬液加入9mL磷酸盐缓冲溶液中进行10倍梯度稀释，取4个稀释梯度（举例：10-4、10-5、10-6和10-7）进行中和试验。
6.2.2　 同时取4个稀释梯度各1.0mL采用倾注法接种于TSA平板中，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h后，进行菌落计数。
6.3　 中和I组
6.3.1　 试验中所用消毒剂的浓度应以杀菌试验中使用的最高浓度为准。
6.3.2　 分别选取4个无菌载体加入10mL消毒剂溶液中，作用至规定时间后，用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余消毒液，分别转移至4管含有10mL中和剂培养液的试管中。
6.3.3　 向上述4管中和剂培养液中分别接种0.1mL 4个稀释梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h。
6.4　 中和II组
6.4.1　 重复6.3.1和6.3.2，载体在中和剂培养液中室温静置30min后，用灭菌后的吊钩取出载体，轻触管壁去除多余液体，分别转移至4管含10mL基础培养液的试管中。
6.4.2　 向上述4管培养液中分别接种0.1mL 4个稀释梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h。
6.5　 阳性对照
未暴露于消毒剂的中和剂培养液和基础培养液各4管，分别接种0.1mL 4个稀释梯度（10-4、10-5、10-6和10-7）的菌液，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h，作为阳性对照。
6.6　 阴性对照
　　中和剂培养液和基础培养液各1管加入无菌载体，不接种菌液，置36℃±1℃恒温培养箱中培养48h±2h，作为阴性对照。
6.7　 结果判定

6.7.1　 菌悬液浓度
菌悬液计数最后二个稀释梯度（如10-6和10-7），至少有一个稀释梯度的菌悬液的数量在5CFU/mL～100CFU/mL范围内。
6.7.2　 阳性对照
基础培养液管有菌生长表明试验菌、培养液性能良好，中和剂培养液管有菌生长表明中和剂对试验菌生长无明显影响。
6.7.3　 阴性对照
应无菌生长。
6.7.4　 中和I组
接种菌量较低（5CFU/mL～100CFU/mL）的中和剂培养液管中有菌生长，认定为中和剂可有效中和消毒剂，且中和产物对试验菌生长无明显影响。若无菌生长或仅在接种高滴度菌液的试管中生长表明未完全中和，或中和产物有抑菌作用，需进行中和II组试验。
6.7.5　 中和II组
接种菌量较低（5CFU/mL～100CFU/mL）的培养液中有菌生长认为中和有效。
7　 杀菌试验
7.1　 实验步骤　
7.1.1　 用标准硬水配制消毒剂溶液至作用浓度，以每管10mL分装至60个无菌试管（25mm×100mm）中，置于20℃±1℃水浴中平衡10min。　
7.1.2　 用灭菌后的吊钩以20s±5s间隔依次向每管消毒液中加入一个染菌载体，加入过程中勿触碰管壁，轻柔振荡2～3下后放入于20℃±1℃水浴中。
7.1.3　 消毒作用至规定时间后，用灭菌后的吊钩依次钩取染菌载体，轻触管壁去除多余消毒液，转移至10mL中和剂培养液管中，加入时勿触碰管壁。
7.1.4　 振荡混匀，置36℃±1℃恒温培养箱中静置培养48h±2h。
7.1.5　 若中和剂鉴定试验结果显示中和I组未完全中和，在中和剂培养液中静置30min后用灭菌后的吊钩将染菌载体取出后，转移至基础培养液管中，振荡混匀后进行培养。
7.2　 阳性对照
将未经消毒处理的染菌载体各1个，分别放入10mL中和剂培养液和10mL基础培养液管中振荡混匀，置36℃±1℃恒温培养箱中静置培养48h±2h。
7.3　 阴性对照　
将无菌载体各1个分别放入10mL中和剂培养液和10mL基础培养液中振荡混匀，置36℃±1℃恒温培养箱中静置培养48h±2h。
7.4　 试验重复三次。
8　 结果判定
8.1　 阳性对照管应有菌生长，阴性对照管应无菌生长。
消毒剂标注的消毒对象为光滑物体表面时，对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的三次重复杀灭效果均应达到表1的要求。当消毒剂标注对肠炎沙门菌有效时，对肠炎沙门菌的杀灭效果也应同时达到表1的要求。
表1　消毒剂应用稀释法对微生物杀灭效果的判定
实验菌株
阳性管数（个）
实验管数（个）
阳性对照菌量对数值
金黄色葡萄球菌
0～3
60
6～7
铜绿假单胞菌
0～6
60
6～7
肠炎沙门氏菌
0～1
60
5～6
9　 注意事项
9.1　 金黄色葡萄球菌在试验中可使用营养肉汤或液体硫乙醇培养基作为基础培养液，Letheen肉汤对金黄色葡萄球菌有一定的抑制作用。
9.2　 同一消毒剂拟对多种微生物进行杀灭试验时，应按微生物种类分别进行中和剂鉴定试验。
9.3　 染菌载体转移至消毒剂管时应避免触碰管壁，严格无菌操作，操作中产生的微生物气溶胶可能导致测试管假阳性。
9.4　 在结果判定时，如培养液未出现混浊，但发生颜色变化或出现膜状物，应与阳性对照对比来判定结果，并进行细菌的分离鉴定。
9.5　 杀菌试验中实验组有菌生长时，可随机挑选阳性管进行细菌形态、生化或抗原鉴定，以排除污染。
A
A
附　录　A
培养基和试剂
A.1　合成肉汤
L-胱氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05g
DL-蛋氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.37g
L-精氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.40g
DL-组氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.30g
L-赖氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.85g
L-酪氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.21g
DL-苏氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.50g
DL-缬氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.00g
L-亮氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.80g
DL-异亮氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　0.44g
氨基乙酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.06g
DL丝氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.61g
DL-丙氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.43g
L-谷氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.30g
L-天冬氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.45g
DL-苯丙氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　0.26g
DL-色氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05g
L-脯氨酸　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05g
氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　3.00g
氯化钾　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.20g
硫酸镁　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.05g
磷酸二氢钾　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.50g
磷酸氢二钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　4.00g
盐酸硫胺素　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.01g
烟酰胺　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.01g
将上述成分制成溶液，调pH值至6.9～7.3，于121℃压力蒸汽灭菌20min，冷却至室温后加入0.1ml无菌10%葡萄糖溶液备用。
A.2　　营养肉汤培养基　
蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　10.0g　
牛肉膏　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g　
氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g　
蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000mL　
将上述成分制成溶液，调pH值至7.2～7.4，于121℃压力蒸汽灭菌20min备用。　
A.3　　液体硫乙醇培养基
酪蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 15.0g
酵母粉　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 5.0g
葡萄糖　 　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
硫乙醇酸钠　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.5g
L-胱氨酸　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.5g
氯化钠　 　 　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　2.5g
刃天青　 　 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.001g
除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解　，调节pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH至6.9～7.3，分装于115℃压力蒸汽灭菌20min备用。　
A.4　　Letheen肉汤
酪蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 10.0g 
牛肉膏 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
吐温 80　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　  5.0g
卵磷脂       　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　   0.7g 
氯化钠               　　　　　　　　　　　　　　　　　　   5.0g
蒸馏水       　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000mL　
将上述成分制成溶液，调pH值至6.8～7.2，于121℃压力蒸汽灭菌20min备用。　
A.5　　胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA）　
胰蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　15.0g
大豆蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g
氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.0g　
琼脂　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　16.0g
蒸馏水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000mL　
将上述成分制成溶液，调pH值至7.2～7.4，于121℃压力蒸汽灭菌20min备用。
A.6　磷酸盐缓冲液　（PBS，0.03mol/L，pH　7.2）
无水磷酸氢二钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2.83g
磷酸二氢钾　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.36g
蒸馏水加至　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000ml
将各成分加入到1000ml蒸馏水中，待完全溶解后，调pH至7.2～7.4，于121℃压力蒸气灭菌20min备用。
A.7　标准硬水　(硬度342mg/L)　　
氯化钙(CaCl2)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.304g　　
氯化镁(MgCl2·6H2O)　　　　　　　　　　　　　　　　0.139g　　
蒸馏水加至　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　1000ml。
将各成分加入到1000ml蒸馏水中，待完全溶解后，于121℃压力蒸气灭菌20min备用。
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