不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响.pdf

第 29 卷第 1 期农 业 工 程 学 报Vol.29No.12013 年1 月Transactions of the Chinese Society of Agricultural EngineeringJan.2013225不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响王永忠1,2，冉尧1,2，陈蓉1,2，廖强1,2，朱恂1,2（1.重庆大学低品位能源利用技术及系统教育部重点实验室，重庆 400030；2.重庆大学工程热物理研究所，重庆 400030）摘要：该文研究了自然堆积、超声波、NaOH 溶液以及 H2SO4溶液等不同方法预处理后的稻草秸秆基质固态酶解特性，结合 SEM 电镜扫描、傅里叶变换红外光谱（FTIR）及 X 射线衍射对预处理前后稻草秸秆基质的结构特性进行了观察和分析，获得了稻草秸秆固态酶解的最佳预处理条件。结果表明自然堆积 9 d、质量分数分别为 1.0%的 NaOH 溶液和 15%的 H2SO4溶液、超声 40 min 的预处理条件能有效除去包裹在纤维素基质外表面的木质素和半纤维素，提高基质的酶解糖化效率。该试验中质量分数为 1.0%的 NaOH 溶液预处理后的稻草秸秆通过酶解作用获得的还原糖产率最高，为 126.3 mg/g。该研究可为探索提高纤维素基质酶解糖化效率的方法提供参考。关键词：糖化作用，秸秆，超声波，固态酶解，预处理doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2013.01.030中图分类号：TK6文献标志码：A文章编号：1002-6819(2013)-01-0225-07王永忠，冉尧，陈蓉，等.不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响J.农业工程学报，2013，29(1)：225231.Wang Yongzhong,Ran Yao,Chen Rong,et al.Effects of different pretreatment methods on enzymolysis characteristics ofrice straw in solid stateJ.Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering(Transactions of the CSAE),2013,29(1):225231.(in Chinese with English abstract)0引言在木质纤维素转化能源过程中，纤维素的酶解糖化是最关键的步骤，也是木质纤维素能源化转化过程中的限制性步骤。只有当木质纤维素通过酶解作用转化为葡萄糖、木糖等单糖后，才能通过发酵过程转化为各种生物能源，如乙醇、H2等1-3。然而传统的酶解作用在液态条件下进行，由此产生一系列问题，例如酶解糖化效率和水解产物浓度低，单糖浓缩过程需消耗大量能量，产生大量的废水，反应器体积过大3-5。目前，人们提出的固态酶解糖化方法能有效地克服这些问题5-7。固态酶解是指基质中游离水含量低的条件下进行纤维素基质的酶解糖化作用。木质纤维素原料具有结晶度高和木质化两大特征6-9，因此，在酶解前对木质纤维素进行适当的预处理可以改变其理化结构，降低结晶度，有效去除木质素，增加纤维素酶等水解酶在基质表面的吸附性能，提高酶解效率8-11。目前，人们对不同收稿日期：2012-08-31修订日期：2012-12-14基金项目：国家自然科学基金项目（No.50976130,No.51136007），国家杰出青年基金项目（No.50825602）作者简介：王永忠（1967），男，四川资阳人，副教授，主要研究方向为环境与能源生物技术中的热物理问题。重庆重庆大学工程热物理研究所 400030。Email:预处理方法对纤维素基质液态条件下的酶解特性进行了许多研究10-13，而关于预处理方法对固态酶解反应特性的影响还未见报道。开展这方面的研究有助于探索提高纤维素基质酶解糖化效率的方法，促进纤维素基质固态酶解糖化技术的发展和应用。本文以稻草秸秆为原料，分别对稻草秸秆进行了自然堆积、NaOH、H2SO4、超声波等预处理，利用处理后的秸秆基质进行了固态酶解试验，分析了不同预处理方法对固态基质酶解特性的影响及预处理前后稻草秸秆基质的表观特性及化学结构的变化，并对试验结果进行了显著性分析。1材料和方法1.1材料稻草秸秆取自重庆郊区，秸秆剪切成 24 cm小段，洗净并烘干至恒质量，放置于密封器皿中待用。纤维素酶采用商业用绿色木酶，购自上海展云化工有限公司，活性大于 15 U/mg。其他化学试剂均为分析纯。1.2稻草秸秆预处理方法1.2.1自然堆积取备用稻草秸秆 50 g，置于 1 000 mL烧杯中，并加入 200 mL 蒸馏水，混合均匀后用保鲜膜封好烧杯口，以维持烧杯中基质的含水率。在室温农业工程学报2013 年226为 30左右的条件下进行自然堆积预处理，分别于堆积的第 0、3、6、9、12 天从烧杯中称取 4.0 g稻草基质烘干粉碎，取过 60 目筛14的基质进行酶解试验。1.2.2NaOH 预处理取备用秸秆 50 g，按固液比 1:10（g/mL）的比例加入 NaOH 溶液并使秸秆充分润侵，于室温（30左右）下处理 24 h。NaOH 溶液质量分数分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%15-17。处理完成后，用蒸馏水对秸秆进行冲洗至中性，并在105下烘箱中烘干至恒质量。对烘干后稻草基质粉碎，取过 60 目筛的稻草粉末进行固态酶解试验。1.2.3H2SO4预处理取备用秸秆，按固液比 110（g/mL）加入H2SO4溶液润侵，于室温（30左右）下处理 24 h。H2SO4溶液质量分数为 1%、5%、10%、15%、20%、25%18-20。处理完成后，用蒸馏水对秸秆进行冲洗至中性，并在 105的烘箱中烘干至恒质量。对烘干后稻草基质进行粉碎，取过 60 目筛的稻草粉末进行固态酶解试验。1.2.4超声波预处理对洗净干燥后的稻草秸秆粉碎，取过 60 目筛的稻草粉末在冰浴条件下进行超声波预处理。超声功率为 180 W，固液比为 115（g/mL），超声时间分别为 5、10、20、30、40、60 min21-24。处理完成后将基质烘干，进行固态酶解试验。1.3试验步骤1.3.1固态酶解分别称取 4.0 g 预处理后的秸秆基质进行灭菌，作为酶解基质。冷却后，根据前期试验结果按基质量与加水量为 14（g/mL）的比例加入含有纤维素酶的无菌水 16 mL，混合均匀后填装于 50 mL 离心管中，密封，置于恒温水浴箱中进行纤维素基质的酶解糖化。其中，纤维素酶的添加量为 20.0 mg，酶解温度控制为 50，酶解时间为 96 h。1.3.2测量方法酶解完成后，在基质中加入 6.5 mL 蒸馏水，在高速冷冻离心机中离心 10 min（10000 r/min），取离心后上清液测量还原糖浓度。还原糖浓度测量采用 3,5-二硝基水杨酸法25，并根据离心得到的液体总量计算总还原糖量，总还原糖量除以基质初始量得到其产率。为了进一步分析预处理方法对稻草基质表面特性及化学结构特性的影响，分别取预处理前基质及 1.0%NaOH 溶液预处理、15%H2SO4溶液预处理及 15 min 超声波预处理后的稻草秸秆基质，进行SEM 电镜扫描、傅里叶红外光谱分析及 X-射线衍射分析。由于自然堆积预处理后的基质酶解效率较低，因此没有进行相应的后续观察和扫描。2结果与分析2.1自然堆积预处理对酶解结果影响自然环境中存在着大量微生物，可以分解木质纤维素成分，降低其聚合度；同时，自然堆积不需要消耗能源或者化学试剂。由此，本试验对稻草秸秆进行自然堆积预处理，分析了堆积时间对固态酶解性能的影响（图 1）。图 1自然堆积时间对酶解作用的影响Fig.1Effect of nature stacking time of cellulosic material onenzymolysis由图 1 发现，随着自然堆积时间延长还原糖产率变化不明显，维持在 1.3 mg/g 左右。12 d 的自然堆积预处理后，稻草秸秆固态酶解还原糖产率与未预处理的基本相同。结果表明尽管在自然界存在大量微生物，但对木质纤维素具有高效水解作用的微生物种类较少，且其繁殖生长需要消耗水解产生的单糖，同时单纯采用自然堆积的方式对纤维素基质结构的改变很小。因此，单纯的自然堆积所获得的还原糖产率相对较低，采用其他预处理方式如化学、物理法是很有必要的。2.2NaOH 预处理稻草秸秆对固态酶解特性的影响NaOH 能削弱纤维素与半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素与木质素之间的酯键，增加木质纤维素的孔隙度。因此，利用稀 NaOH 溶液对木质纤维素进行处理，可以润涨原料，从而增加其内部表面积，降低聚合度及结晶度，同时去除木质素10,26。本试验研究了不同NaOH质量分数处理后稻草秸秆的固态酶解特性。试验结果见图 2。由图发现，当 NaOH 质量分数从 0.5%增加到 1.0%，酶解所得还原糖产率从65.4 mg/g 增加到 126.3 mg/g，而随着 NaOH 质量分数进一步增加到 5.0%，所得还原糖产率逐渐减少至36.7 mg/g。对于固态酶解作用而言，纤维素酶能否第 1 期王永忠等：不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响227有效被纤维素基质吸附是影响木质纤维素原料水解产率的主要因素11。已有研究表明，随着 NaOH质量分数的提高，预处理后的秸秆基质中纤维素含量增加27。因此，当 NaOH 质量分数从 0.5%增加到 1.0%时，还原糖产量明显提高。但当 NaOH 质量分数进一步提高时，经过预处理后稻草秸秆形貌呈絮状，密度明显下降，同时，基质对水的浸润性降低，所以酶解反应效率下降，得到的还原糖产率相应降低。这是因为水不仅是纤维素基质酶解作用的直接参与者，更是作为传质媒介直接影响纤维素酶在纤维素基质表面的吸附。当预处理后的基质浸润性降低时，也就降低了基质的吸水膨胀性和其表面对纤维素酶的有效吸附性。另一方面，随着基质对水浸润性的降低，基质孔隙中含水率下降，造成基质反应位点产生的糖类积累，黏度增强，抑制了纤维素酶的迁移和吸附，这也进一步阻碍了酶解反应的进行28-29。图 2NaOH 质量分数对酶解作用的影响Fig.2Effect of mass fraction of NaOH on enzymolysis本试验中，质量分数为 1.0%的 NaOH 溶液对稻草秸秆预处理后固态酶解效果最佳，还原糖产率为 126.3 mg/g。2.3H2SO4预处理稻草秸秆对固态酶解特性的影响稀酸预处理能有效去除木质纤维素中的半纤维素，降低木质纤维素聚合度。本试验研究了常温下不同质量分数的H2SO4预处理稻草秸秆后的酶解特性。试验结果如图 3 所示，随着 H2SO4质量分数从1%提高到 15%，还原糖产率从 12.7 mg/g 逐渐增加到 99.7 mg/g，而随着 H2SO4质量分数的继续增大，还原糖产率则呈下降趋势，当 H2SO4质量分数增大至 25%时，得到的还原糖产率仅为 24.3 mg/g。这是由于随着 H2SO4质量分数的增加，基质中被分解木质素和半纤维素增多，由木质素和半纤维素形成的保护层逐渐被破坏，基质微纤丝中的纤维素被暴露，从而增加了纤维素酶与纤维素接触的几率，促进了酶解作用，由此提高了还原糖产率。而随着预处理 H2SO4质量分数的进一步增大，H2SO4不仅引起木质素和半纤维素的溶解，同时，还导致纤维素中的游离羟基发生酯化作用，生成硫酸氢酯，甚至在强酸作用下，发生反应，生成糠醛一类的化学物质30-31。因此，预处理后的基质中纤维素含量下降，引起酶解反应的还原糖产率降低。此外，较强质量分数的酸预处理还易造成暴露的纤维素再结晶，这也是引起纤维素酶水解效率下降的原因之一。图 3H2SO4质量分数对酶解作用的影响Fig.3Effect of mass fraction of H2SO4on enzymolysis本试验中，当 H2SO4质量分数为 15%的时候，还原糖产率最高达 99.7 mg/g，此时酶解效果最佳。2.4超声波预处理对稻草秸秆固态酶解特性的影响超声波具有空化、机械传质等作用，来自超声波产生的微射流对秸杆表面产生冲击、剪切，且空化作用所产生的热量及自由基均可使大分子降解，从而降低木质纤维素的结晶度。在一定功率条件下的超声波预处理过程中，超声时间对预处理效果影响显著，为此，本试验研究了超声波预处理时间对超声预处理后的稻草秸秆酶解性能的影响。试验结果见图 4。从图可看出，随着超声时间增加，酶解后得到还原糖产率呈逐渐增加的趋势。当超声波预处理时间从 5 min 增加到20 min 时，酶解后基质还原糖产率从9.1 mg/g 缓慢增加至10.6 mg/g。这是由于在较短的预处理时间内，超声波对稻草秸秆的预处理效果较差，不能明显提高酶解效率。随着超声时间继续增加到40 min，酶解后基质还原糖产率显著增加到25.4 mg/g，在这个预处理时间内，超声波产生的机械力和空化作用能对稻草基质表面进行充分的侵蚀，木质纤维素结晶度显著降低，因此，酶解效率显著提高。然而，随着超声处理时间从 40 min 增加到60 min，酶解后基质还原糖产率下降至25.3 mg/g。这是由于随着超声波预处理时间继续增加，来自超声波的机械力作用和空化作用使大分子间的化学键断裂，生成了大量的可溶性小分子，这些小分子又可与体系农业工程学报2013 年228中裂解下来的其他单体发生聚合反应，引起酶解反应后产生的还原糖产率明显下降。该试验表明，超声波预处理时间为40 min 时，酶解作用效率最佳，得到的还原糖产率最大。图 4超声波时间对酶解作用的影响Fig.4Effect of ultrasonic time on enzymolysis2.5预处理方法对稻草秸秆基质表面特性的影响利用电镜观察和比较预处理前后基质的形貌变化，对于判断木质纤维素材料预处理效果和分析其对酶解效率的影响具有重要作用。试验中，分别选取未处理稻草秸秆及 1.0%NaOH 预处理、15%H2SO4预处理和40 min超声波预处理后稻草秸秆进行了电镜扫描。扫描结果如图 5 所示，其中图 5a、5b、5c 和 5d 分别是未处理、40 min 超声波、1.0%NaOH 预处理、15%H2SO4预处理后的稻草秸秆电镜扫描图。从图 5 中看出，预处理前的稻草秸秆基质表面形貌比较光滑，而通过 40 min 超声波、1.0%NaOH、15%H2SO4预处理后的稻草秸秆基质表面变粗糙，基质宏观结构发生明显改变，表明基质及纤维素表面的保护层被去除，更有利于水解酶的吸附和水解作用的进行。图 5预处理前后稻草电镜扫描Fig.5SEM photographs of rice straw under different pretreatment conditions2.6预处理前后基质的化学特性分析试验过程中分别对预处理前后基质进行了傅里叶红外光谱（FITR）和 X-射线（XRD）扫描，由此分别分析基质内基团和结晶度的改变。图 6 所示为预处理前的稻草秸秆及 1.0%NaOH、15%H2SO4和 40 min 超声波预处理后稻草秸秆基质的傅里叶红外光谱分析结果。从图中可以看出，预处理前后基质的图谱基本相同，没有明显的新特征峰出现，结合 SEM 分析，表明稻草秸秆在经过 NaOH、H2SO4及超声波预处理后没有发生衍生化作用，主要是基质结构的改变。前后的 X-射线衍射图谱。图 7a 为经过机械粉碎后的稻草秸秆基质的衍射图谱，与粉碎前的基质相比（结果未显示），其结晶度有一定下降，表明机械粉碎能在一定程度上降低基质的结晶度，有利于基质的酶解作用；图 7b 为 NaOH 预处理后的基质 X 射线衍射图，从图中发现：NaOH 预处理后基质结晶度明显降低，这是由于 NaOH 预处理能破坏通过氢键与纤维素和半纤维素紧密结合的木质素，因此，纤维素结晶度明显下降，易于被纤维素酶吸附降解；图 7c 和图 7d 分别表示 H2SO4和超声波预处理后基质的 X 射线衍射图，二者在 22左右都表现出明显的纤维素型特征峰，说明 H2SO4和超声波预处理并没有明显破坏稻草秸秆的结晶结构，甚至引起了纤维素基质的部分重结晶，这也可能是稻草秸秆在这 2 种预处理方式下还原糖产率低于NaOH 预处理的一个原因。第 1 期王永忠等：不同预处理方法对稻草秸秆固态酶解特性的影响229注：图中数值指波数。图 6预处理前后稻草 FTIR 图谱Fig.6FTIR spectra of rice straw under different pretreatment conditions图 7预处理前后 X 射线衍射图Fig.7XRD spectra of rice straw before and after pretreatment4结论试验表明随着预处理过程中自然堆积时间、NaOH 质量分数、H2SO4质量分数的增大和超声时间的延长，预处理后稻草秸秆基质通过酶解作用得到的还原糖产率皆呈先增加后下降的趋势，其中1.0%NaOH 溶液处理后的基质酶解效率最高为126.3 mg/g。结果表明，采用 1.0%NaOH 溶液、15%H2SO4溶液和 40 min 超声时间等预处理能有效除去包裹在纤维素基质外表面的木质素和半纤维素，提高了纤维素酶的水解效率；但分别高于这些参数的预处理条件则易引起基质的重结晶，降低酶解糖化效率。农业工程学报2013 年230参考文献1Saxena R C,Adhikari D K,Goyal H B.Biomass-basedenergy fuel through biochemical routes:A reviewJ.Renewable and Sustainable Energy Reviews,2009,13(1):167178.2Demirbas A.Biofuels sources,biofuel policy,biofueleconomyandglobalbiofuelprojectionsJ.EnergyConvers Manage,2008,29(5):210621016.3田沈，徐鑫，孟繁燕，等.木质纤维素乙醇发酵研究进展J.农业工程学报，2006，22(1)：221224.Tian Shen,Xu Xin,Meng Fanyan,et al.Development ofethanol production from hydrolysatesJ.Transactions 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sample was taken atintervals of 0,3,6,9,12 d respectively,and dried and ground.As for NaOH pretreatment,50 g rice straw with 2-4cm length immersed in 0.5%,1.0%,2.0%,3.0%,4.0%,5.0%NaOH solutions at ratio of 1:10(g/mL)waspretreated for 24 h at 30 C,respectively.After that,the treated substrate samples were individually washed withwater to be neutral,and ground after drying.